实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外 分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson(I98O)修改而成的简便 方法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强 度下（大于0.7MNC),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行 研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法 去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点 的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等 量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的 DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质 量的DNA,也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUCI9质粒，有 3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA), 开环质粒DNA,即环状质粒DNA的I条链断裂，(open circular DNA,简称ocDNA),线状 质粒DNA,即环状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂((linear DNA,简称LDNA)。这3 种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒 DNA泳动最快，其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在26Om波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1OD2o相当于dsDNA50ugmL,ssDNA33ugmL和ssRNA40ugmL。可以此米计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫 外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能 有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染
实验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外 分光光度法对 DNA 进行定性定量分析。 【实验原理】 通过 CTAB 法提取植物基因组 DNA 是由 Murray 和 Thompson (1980) 修改而成的简便 方法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强 度下(大于 0.7M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行 研磨，从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法 去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到 DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点 的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，DNA 分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质 量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)， 开环质粒 DNA，即环状质粒 DNA 的 1 条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状 质粒 DNA，即环状质粒 DNA 的 2 条链在同一处发生断裂(linear DNA，简称 L DNA）。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在 260nm波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260nm和 280nm的紫 外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280 比值高于 2.0，则可能 有RNA污染，低于 1.8 则有蛋白质污染
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 量程各一支)、胶带、100mL或250mL锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氨、研磨棒、点样板 或parafilm、吸头、1.5mlEP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Ts、乙二胺四乙酸EDTA人CTAB(十六烷基三甲基溴化铵、B 巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠NaC、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚 蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1.2xCTAB buffer 配50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5mLIM贮存液 1.4M NaCl 17.5mL4M贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2mL0.5M贮存液 2%CTAB 需CTAB固体粉末1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇100L 2.70%乙醇 3.RNaseA(10mg/mL) 4.0.5xTBE冲液（工作浓府） 45 nM Tris-.硼酸盐 1mM EDTA 配5×TBE(贮存液)1000mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5.凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 6.溴化乙锭(EB)贮存液10mgml 7.DNA marker 8.0.1×TE 9. 酚/氯仿(11，VN
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL 量程各一支)、胶带、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板 或 parafilm、吸头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA )、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β- 巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA ) 、溴酚 蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 配 50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 贮存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M 贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M 贮存液 2% CTAB 需 CTAB 固体粉末 1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇 100 μL 2. 70%乙醇 3. RNaseA (10mg/mL) 4. 0.5×TBE 缓冲液(工作浓度) 45mM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配 5×TBE (贮存液) 1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5. 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙锭 (EB ) 贮存液 10mg/mL 7. DNA marker 8. 0.1×TE 9. 酚/氯仿 (1:1，V/V)
【实验步骤】 1,取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氨冷冻条件下研磨成粉末状. 2.加入0.6mL2×CTAB提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30min, 每10min颠倒混匀一次 3.取出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。 4.13,000rpm室温离心4min(若没离好可重复一次). 5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中。 6.加等体积氯仿混匀，13,000pm离心4mim,取上清 7.加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，20℃放置60min。 8.4℃，15,000rpm离心20min. 9.弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，风干。 10.加入25L无茵水（含25 ug/mL RNase A,溶解DNA IL.取1 HL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： ()制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5.7 1.2 0.4.6 15 02-4 2.0 0.1-3 称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL0.5xTBE缓冲液，置微波炉或水浴加热 至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由D半乳糖和L~半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂神凝胶的分辨范用一般在02-50kb之间。 (2)胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮音或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙)，形成一个模具
【实验步骤】 1. 取约 100mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入 0.6 mL 2×CTAB 提取液(用前加入 0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃ 水浴 30 min， 每 10 min 颠倒混匀一次。 3. 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀。 4. 13,000 rpm 室温离心 4 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液转移到另一 1.5mL 离心管中。 6. 加等体积氯仿混匀，13,000rpm 离心 4 min，取上清。 7. 加入 2 倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置 60 min。 8. 4℃，15,000rpm 离心 20 min。 9. 弃上清，70％乙醇洗沉淀 2 次，风干。 10. 加入 25 μL 无菌水(含 25μg/mL RNase A)，溶解 DNA。 11. 取 1μL DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 4 2.0 0.1 - 3 称取 0.3g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 30mL0.5×TBE 缓冲液，置微波炉或水浴加热 至完全溶化，取出摇匀，则为 1％琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由 D-半乳糖和 L-半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在 0.2-50kb 之间。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙），形成一个模具
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④室温下静置直至凝胶完全凝周（室温下30-45m),垂直轻拔梳子，取下胶带，将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。 )加样 在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于I×。用IOuL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证DNA沉入加样孔内：使样品带有颜色 便于简化上样过程：其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于300p的线性双链 DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中DNA分子的迁移位置 (④电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动)。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此 最高电压不超过5Vcm。 ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 ⑤)染色 将电泳后的凝胶浸入含有0.5gmL溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温30-45mim) 清水脱色10mi,紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照 保存。 溴化乙锭(Ethidium bromide,EB),是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和DNA形成络合物，并在约30Onm波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度： (1)用0.1×TE对待测DNA样品按120或合适的倍数稀释。 (2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready 时，进入核酸测定窗口
② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③ 将冷却到 60℃ 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1mm。 (3) 加样 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1×。用 10μL 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证 DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色 便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于 300bp 的线性双链 DNA 分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中 DNA 分子的迁移位置。 (4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm。 ② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 (5) 染色 将电泳后的凝胶浸入含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温 30-45min）， 清水脱色 10min，紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照 保存。 溴化乙锭（Ethidium bromide, EB），是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和 DNA 形成络合物，并在约 300nm 波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使 DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度： (1) 用 0.1×TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。 (2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready” 时，进入核酸测定窗口
(3)调零。先用0.1xTE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“str心键， 仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 (4)吸7OL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用5~TuL的石英样品杯。点击“eter”键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260和280nm处的光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样 品的浓度等。 (⑤)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加 入下一个待测样品 (6)DNA纯度：以A260/A280比值米反映。当A260A280比值2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。 【实验结果】 在紫外灯(360nm,312nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶（图1-1）。DNA存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应藏上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用)。 图1】拟南芥基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提DNA,下午电泳及紫外分光光度法检测DNA
(3) 调零。先用 0.1×TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键， 仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 (4) 吸 70μL 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用 5～7μL 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260 和 280nm 处的光密度（OD 值）及 A260/A280nm 和 A280/A260nm 的比率以及 DNA 样 品的浓度等。 (5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加 入下一个待测样品。 (6) DNA 纯度：以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值2.0，说明样品存在 RNA 污染，可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。 【实验结果】 在紫外灯（360 nm, 312 nm 或 254 nm ）下观察染色后的电泳凝胶（图 1-1）。DNA 存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用）。 图 1-1 拟南芥基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提 DNA，下午电泳及紫外分光光度法检测 DNA
【注意事项】 1.尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2.研磨过程中确保样品不要融化，直至加CTAB 3.酚氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4.所用试剂需灭南。 5.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7.电泳时应注意电源线路，预防触电。 8.溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实 验室内使用。 9.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 1O.DNA带形状模糊：DNA加样过多：电压太高：凝胶中有气泡。 1L.紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除苯 酚、RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往 比实际浓度偏高。 12.测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破：持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1.提取DNA之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2.提取DNA的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3.如何检测、评价提取的DNA的质量？ 4.如何确定提取的DNA的浓度？ 5.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 6.CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7.电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8.如何配制电泳缓冲液TBE? 9.试分析自己实验得到的电冰结果？ 10.EB染色的特点和注意事项是什么？ 11.上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12.DNA定最时，什么方法比较精确？ 13.紫外分光光度法测定DNA浓度的原理？ 14.DNA样品的A260/A280比值如何反应DNA的纯度 15.DNA样品的A260/A280比值大于20或小于1.8时应该如何处理才能提高DNA纯度？
【注意事项】 1．尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA 可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2．研磨过程中确保样品不要融化，直至加 CTAB 3．酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4．所用试剂需灭菌。 5．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7．电泳时应注意电源线路，预防触电。 8．溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实 验室内使用。 9．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 10．DNA 带形状模糊：DNA 加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 11．紫外分光光度法不能区分 DNA 分子的构型，如质粒 DNA 分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体 DNA 和 RNA 等。由于测定吸收光度 A260 时，难以排除苯 酚、RNA、染色体 DNA、以及 DNA 解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往 比实际浓度偏高。 12．测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破；持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1. 提取 DNA 之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2. 提取 DNA 的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3. 如何检测、评价提取的 DNA 的质量？ 4. 如何确定提取的 DNA 的浓度？ 5. 分离基因组 DNA 和质粒 DNA 有哪些不同之处？ 6. CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7. 电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8. 如何配制电泳缓冲液 TBE？ 9. 试分析自己实验得到的电泳结果？ 10. EB 染色的特点和注意事项是什么？ 11. 上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12. DNA 定量时，什么方法比较精确？ 13. 紫外分光光度法测定 DNA 浓度的原理？ 14. DNA 样品的 A260/A280 比值如何反应 DNA 的纯度？ 15. DNA 样品的 A260/A280 比值大于 2.0 或小于 1.8 时应该如何处理才能提高 DNA 纯度？
实验二PCR扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术及DNA片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合醇链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2”倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个 扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段：②退火，快速降低温度至50-60C后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段：③延伸，溶液反应温度升至T2C,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP,按5”一3方向复制出互 补DNA,即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可 扩增1O51O'倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理：
实验二 PCR 扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术及 DNA 片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的 寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个 扩增过程分三步：① 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶 段；② 退火，快速降低温度至 50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即 退火阶段；③ 延伸，溶液反应温度升至 72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引 物的引导下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按 5’→3’ 方向复制出互 补DNA，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过 25-30 个循环后，DNA可 扩增 106 -109 倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理：
模板(Total) A 模板5 目的DNA 循环02中A+L+B 变性退火 5'o 5 循环】 A+LLL+B 延伸 4101 变性泪火 循环2 8222 循环3 1638 3 循环n2”n2”2nn 图21PCR基本原理示意图 Taq DNA聚合酶就是在PCR中常用的一种耐热DNA聚合酶，该酶分离自水生柄热菌， 分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3”一5'外切 酶活性，合成的DNA双链3'端常有一个突出的碱基A,便于与3”端有突出T的线性载体 (如T载体)直接进行重组连接，该特点在DNA重组中使用非常方便。 分离和纯化PCR产物及DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同 大小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得 目的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝周成凝胶。由 于双链DNA的解链温度高于65C,所以可以熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时 回收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR热循环仪、台式高心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5L)、200 uL.PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000L量程各一支)、胶带、 100mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、.吸头、PE手套和乳胶手套
图 2-1 PCR 基本原理示意图 Taq DNA 聚合酶就是在 PCR 中常用的一种耐热 DNA 聚合酶，该酶分离自水生栖热菌， 分子量为 94,000，最适反应温度 75℃，对 95℃高温具良好稳定性，该酶不存在 3’→5’ 外切 酶活性，合成的 DNA 双链 3’ 端常有一个突出的碱基 A，便于与 3’ 端有突出 T 的线性载体 （如 T-载体）直接进行重组连接，该特点在 DNA 重组中使用非常方便。 分离和纯化 PCR 产物及 DNA 酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同 大小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得 目的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在 65℃时熔化成液体，在 30℃时凝固成凝胶。由 于双链 DNA 的解链温度高于 65℃，所以可以熔化凝胶而 DNA 并不变性，在凝胶成液态时 回收 DNA 片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5μL）、200μL PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）、胶带、 100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、点样板或 parafilm、吸头、PE 手套和乳胶手套
二、试剂 1.10×缓冲液 500 mmol/L KCI 100mmol/L Tris-C(pH8.3,室温) 15 mmol/L MgClz 2.DNA模板1ngL(以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板) 3.dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4.引物 引物15'GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA3 引物2 5'CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC3 引物溶液浓度：2μM 5.Taq酶 5 U/uL 6.低熔点琼脂糖 7.凝胶回收试剂盒 8.去离子水或TE(pH7.6 【实验步骤】 1.在200 pLPCR管内配制20uL反应体系： 反应物 体积 ddHzO 10.3 10xPCR缓冲液 2.0 dNTP 16(终浓度20一200uM) 引物1 2.0 引物2 2.0 模板DNA 2.0 Tag酶 0.1 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油
二、试剂 1. 10 × 缓冲液 500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3，室温） 15 mmol/L MgCl2 2. DNA 模板 1 ng/μL (以实验一提取的拟南芥基因组 DNA 为模板) 3. dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4．引物 引物 1 5′ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3′ 引物 2 5′ CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC 3′ 引物溶液浓度：2μM 5. Taq 酶 5 U/μL 6. 低熔点琼脂糖 7. 凝胶回收试剂盒 8. 去离子水或 TE（pH7.6） 【实验步骤】 1．在 200μL PCR 管内配制 20μL 反应体系： 反应物 体积 /μL ddH2O 10.3 10×PCR 缓冲液 2.0 dNTP 1.6（终浓度 20－200μM） 引物１ 2.0 引物 2 2.0 模板 DNA 2.0 Tag 酶 0.1 Total 20 视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油
2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000rpm离心15sc使反 应成分集于管底。 3.PCR反应热循环程序设置： ①94℃预变性3min ②94℃变性30s, ③58℃退火30s 30 cyeles ④72℃延伸1min30s ⑤72℃延伸4min ©4℃pause 反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。 4.配制1%的琼脂糖凝胶。 5.将PCR产物进行电泳。 6.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5mL离心管中，于70℃热水中熔化。 7.按凝胶回收试剂盒说明书操作。 8.取适量纯化好的目的DNA于分光光度计中检测纯度和浓度，其余样品于20℃保存 【实验结果】 本实验扩增片段长1,080bp 图2-2PCR产物电泳结果 (图片左侧为PCR产物，右侧为DNA相对分子质量标准物marker DL20OO)
2. 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm 离心 15 sec 使反 应成分集于管底。 3. PCR 反应热循环程序设置： ① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性 30s; ③ 58 ℃ 退火 30s; 30 cycles ④ 72 ℃ 延伸 1 min30s; ⑤ 72 ℃ 延伸 4 min; ⑥ 4℃ pause 反应结束后短暂离心，置 4℃保存备用。 4. 配制 1％的琼脂糖凝胶。 5. 将 PCR 产物进行电泳。 6. 在紫外灯下切含有 DNA 的低熔点胶，置 1.5 mL 离心管中，于 70℃热水中熔化。 7. 按凝胶回收试剂盒说明书操作。 8. 取适量纯化好的目的 DNA 于分光光度计中检测纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。 【实验结果】 本实验扩增片段长 1,080 bp。 图 2-2 PCR 产物电泳结果 （图片左侧为 PCR 产物，右侧为 DNA 相对分子质量标准物 marker DL2000）