第十三章专题讲在一 外源基因的表面展示 The Surface display of foreign gene 马永平 重庆医科大学基础医学院分子生物学教研室
马永平 重庆医科大学基础医学院分子生物学教研室 外源基因的表面展示 The Surface display of foreign gene 第十三章 专题讲座一
、 什么是表面展示枝术？ (What's surface display technic?) 表面展示技术(surface display technic)是一种将外源肽或蛋白质与噬 菌体、细菌或杆状病毒表面特定蛋白质 融合表达并展示在其表面的技术，主要 用于构建蛋白质或多肽文库，并从中筛 选出感兴趣的蛋白质、多肽或抗体等， 它在抗体制备、蛋白质相互作用研究、 活菌疫苗和生物催化剂研究方面有广泛 的应用前景
一、什么是表面展示技术? (What’s surface display technic?) 表面展示技术(surface display technic)是一种将外源肽或蛋白质与噬 菌体、细菌或杆状病毒表面特定蛋白质 融合表达并展示在其表面的技术，主要 用于构建蛋白质或多肽文库，并从中筛 选出感兴趣的蛋白质、多肽或抗体等， 它在抗体制备、蛋白质相互作用研究、 活菌疫苗和生物催化剂研究方面有广泛 的应用前景
二、操作程厉 (procedure) 随机核苷酸片段令 淋巴细胞-→总mRNA→cDNA→构建 重组噬菌体→感染大肠杆菌→筛选 (亲和吸附-→洗脱→扩增→继续3一4 轮)
二、操作程序(procedure) 随机核苷酸片段 淋巴细胞→总mRNA →cDNA →构建 重组噬菌体→感染大肠杆菌→筛选 (亲和吸附→洗脱→扩增→ 继续3-4 轮)
三、表面展示康镜分美 (surface display system taxonomy) 噬菌体表面展示系统 >细菌表面展示系统 >真核表面展示系统
三、表面展示系统分类 (surface display system taxonomy) ➢噬菌体表面展示系统 ➢细菌表面展示系统 ➢真核表面展示系统
(一）噬菌体表面展示系统 (phage surface display system) 噬菌体表面展示(phage display)是将外源 蛋白通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体颗 粒表面的一种技术 特点：1.在噬菌体表面可随机表达特定长度的外 源肽段. 2.可用亲和吸附技术筛选和富集含有与特 异靶分子结合的噬菌体克隆 3.外源肽可以保持相对独立的空间结构和 生物活性
（一）噬菌体表面展示系统 (phage surface display system) 噬菌体表面展示（phage display）是将外源 蛋白通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体颗 粒表面的一种技术． 特点：１.在噬菌体表面可随机表达特定长度的外 源肽段． ２.可用亲和吸附技术筛选和富集含有与特 异靶分子结合的噬菌体克隆． ３.外源肽可以保持相对独立的空间结构和 生物活性．
1.丝状噬菌体系统 常见的丝状噬菌体有M13、fd、f1等。 M13是大肠杆菌的丝状噬菌体，基因组为6407bp 的闭合环状+SsDNA,感染雄性大肠杆菌 后，ssDNA转变成dsDNA(复制型)，很容易从细胞 中分离和基因工程改造及操作. 用于表面展示的基因主要有次要外壳蛋白基因 pIII(3-5个/virion)和主要外壳蛋白基因 pVIII (30001/virion)
1. 丝状噬菌体系统 • 常见的丝状噬菌体有M13、fd、f1等。 • M13是大肠杆菌的丝状噬菌体,基因组为6407bp 的闭合环状+ssDNA,感染雄性大肠杆菌 后,ssDNA转变成dsDNA(复制型),很容易从细胞 中分离和基因工程改造及操作. • 用于表面展示的基因主要有次要外壳蛋白基因 pIII(3-5个/virion)和主要外壳蛋白基因 pVIII (3000个/virion)
MI3 sDNA dsIA 总避南体 图1.M13噬菌体表面展示系统图示
图1. M13 噬菌体表面展示系统图示 fg
2.入颗粒状噬菌体展示系统 1.PV展示系统 。 PV基因编码噬菌体的主要尾部蛋白，6个PV蛋白组成一个 盘状亚单位，32个盘状结构组成管状尾部.PV的C端折叠区是 病毒的非必需区，可供外源基因的插入和替换，有人已经成 功地展示了有活性的B-半乳糖苷酶(465kD). 2.D蛋白展示系统 •D蛋白是噬菌体的头部组装的必需蛋白质，但当噬 菌体基因组小于野生型基因组的82%时，它可以在缺 少D蛋白的情况下完成组装，因此，D蛋白基因的N端 也可融合外源蛋白
1. PV展示系统 • PV基因编码噬菌体的主要尾部蛋白,6个PV蛋白组成一个 盘状亚单位,32个盘状结构组成管状尾部.PV的C端折叠区是 病毒的非必需区,可供外源基因的插入和替换,有人已经成 功地展示了有活性的ß -半乳糖苷酶(465kD). 2. D蛋白展示系统 •D蛋白是噬菌体的头部组装的必需蛋白质,但当噬 菌体基因组小于野生型基因组的82%时,它可以在缺 少D蛋白的情况下完成组装,因此,D蛋白基因的N端 也可融合外源蛋白. 2. 颗粒状噬菌体展示系统
D蛋自 du心leic Bcld gename Hlead Toil 图2外源蛋白在入噬菌体表面展示部位图示
pv D 蛋白 图2. 外源蛋白在噬菌体表面展示部位图示
例1.表面展示系统在疫苗研究 1.可以直接用多抗来鉴定抗原决定簇，并参考这些肽的结构 信息设计新的疫苗. 2.利用合成的抗原决定簇库，钓出噬菌体表位，而无需考虑 该抗原是否已知.只要它是疾病特异的，并带有诱导机体产 生中和抗体的中和决定簇，就可以用于疫苗设计. 3.噬菌体可以作为疫苗载体.如有人已经用BV单抗从15肽 库中筛选出HBsAg的模拟表位，该噬菌体表位能被HBV患者的 血清识别，并能在小鼠体内诱导出抗HBV抗体.提示特异特异 的噬菌体表位可以作为疫苗和诊断性试剂
例1.表面展示系统在疫苗研究 1.可以直接用多抗来鉴定抗原决定簇,并参考这些肽的结构 信息设计新的疫苗. 2.利用合成的抗原决定簇库,钓出噬菌体表位,而无需考虑 该抗原是否已知.只要它是疾病特异的,并带有诱导机体产 生中和抗体的中和决定簇,就可以用于疫苗设计. 3.噬菌体可以作为疫苗载体.如有人已经用HBV单抗从15肽 库中筛选出HBsAg的模拟表位,该噬菌体表位能被HBV患者的 血清识别,并能在小鼠体内诱导出抗HBV抗体.提示特异特异 的噬菌体表位可以作为疫苗和诊断性试剂