第四章； 核酸的体外扩增 马永平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室
第四章 核酸的体外扩增 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 马永平
第一节聚合酶链反应
第一节 聚合酶链反应
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2 3 45 4:PCR扩增结果
1 2 3 4 5 4：PCR扩增结果
、 PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、 70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆RNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等 发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复 制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及DNA变性、复 性及延伸的温度与时间
一、PCR技术简史 PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史,本世纪60年代末、 70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早 提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。 PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等 发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复 制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件：摸板DNA 、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，以及DNA变性、复 性及延伸的温度与时间
PCR的改进与完善 Mullis?最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA聚合酶I的Klenow.片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都需要重新添加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特 异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技 术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐 热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只 能完成一个扩增反应周期，给PC技术操作程序添了不少困难。这 使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的 DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但 每循环一次，仍需加入新酶
PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都需要重新添加。②引物链延伸反应在 37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特 异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技 术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐 热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只 能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这 使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的 DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但 每循环一次，仍需加入新酶
1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃ 下反应2后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性 是原来的60%，在95℃下反应2后其残留活性是原来的40%。②在热变 性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增 片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特 异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow 片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶 的发现使PCR广泛的被应用
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃ 下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性 是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变 性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增 片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特 异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow 片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶 的发现使PCR广泛的被应用
二、PCR技术的基本原理 (已知目的片段两侧的碱基序列) 1、基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性-退火一延伸三个基本反应步骤构成： ①变性(denature):模板DA经加热至5C左右一定时间后，使 模板DA双链或经PCR扩增形成的双链DA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②退火(anneal ing)（复性)：模板DNA经加热变性成单链后，将 温度降至引物的Tm值左右或以下(55C左右)，引物与模板DA 单链的互补序列配对结合，形成杂交链；
二、PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： ②退火（annealing）（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，将 温度降至引物的Tm值左右或以下（55℃左右），引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合，形成杂交链； ①变性（denature）：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使 模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 1、基本原理 （已知目的片段两侧的碱基序列）
③延伸(extens ion):DNA模板-引物结合物在TagDNA:聚 合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按 碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 以上三步为一个循环，约需2~4分钟，每一循环 的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约 2~3小时后，新生DNA片段理论上可达到23拷贝，约 为109个分子
③延伸(extension)：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚 合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按 碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 以上三步为一个循环，约需2～4分钟，每一循环 的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，大约 2～3小时后，新生DNA片段理论上可达到2 30拷贝，约 为109个分子
PCR反应的基本原理示意图 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG. GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 变性(95C,30s) TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG. .GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC. .CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA ataagcccgaaaggttegtt 退火(450C~550C,30s~1min) tatccaacggctaggcattt
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