雅致放射毛霉液体深层通气发酵培养基本操作 培养基的组成及配制 1.2种子培养基 培养基组成 200ml:豆粕粉6g,饴糖lg,酵母膏0.2g,MgSO0.4g,KH2PO404g。放入高压灭菌锅,121℃,2omin灭菌。 灭菌操作完毕,将上述物品并洗耳球转入超净台,接种前2omin进行紫外空气灭菌。 1.3产酶培养基 培养基组成: l0ml:豆粕粉30g,蔗糖8g,酵母膏1g,MgSO43.6g,KHPO1.2g,CaCl2lg。放入高压灭菌锅中,121℃、 20min灭菌。操作完毕,取出置于超净台内,接种前20分钟进行紫外空气灭菌 2.雅致放射毛霉液体深层培养技术 2种子的培养 接种前4小时从冰箱取出1支菌种,在25℃条件下活化。在超净台内,以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬 浮液以每瓶I0ml的接种量,接λ种子培养基。从超浄台取岀接好的种子三角瓶,转入摇床,在28℃、250rpm的条 件下培养14~16小时,至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止 2.3雅致放射毛霉的产酶培养过程 将已经灭菌的产酶培养基转入超净台,紫外空气灭菌20分钟。将培养好的种子用灭过菌的小烧杯进行转接,每 支产酶培养基三角瓶接入20m1左右的种子。在28℃、250rm的条件下培养36~48小时,至发酵液颜色变深、澄清 为止。 蛋白酶活力测定 (1)定义 1g固体酶粉,在一定温度和pH值条件下,1min水解酪素产生lug酪氨酸为一个酶活单位,以ug表示 (2)原理 蛋白酶在一定温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去, 滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力 (3)试剂和溶液 ①三氯乙酸c(CCl:COOH)=04molL:称取三氯乙酸32.7g,用水溶解并定容至500mL ②磷酸缓冲溶液(pH=7.5)适用于中性蛋白酶:称取磷酸氢二纳(Na2HPO412H2O)301g和磷酸二氢纳 (NaH2PO42H2O)0.25g,加水溶解并定容至500mL ③100ug/mLL—酪氨酸标准溶液: a称取预先于105℃干燥至恒重的L酪氨酸0.100g,精确至0.001g,用1moML盐酸60mL溶解后定容至100mL, 即为1mg/mL酪氨酸标准溶液 b吸取lmg/mL酪氨酸标准溶液1000mL,用0.lmoL盐酸定容至100mL,即得到10ug/mLL—酪氨酸标准 溶液。 ④10g/L酪素溶液:称取酪素1.000g,精确至0.001g,用少量0.5moⅥL氢氧化钠湿润后,加入适量的缓冲溶液约 80mL,在沸水域中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100mL容量瓶中,用缓冲溶液稀释至刻度 ⑤待测酶液 精确取2.0om,用水使充分溶解,然后将上清夜小心倾入50mL容量瓶中,并定容至刻度,供测试用。(此时相 当于稀释25倍) (4)分析步骤 ①求K值(K取135) ②测定
1 雅致放射毛霉液体深层通气发酵培养基本操作 1.培养基的组成及配制 1.2 种子培养基 培养基组成： 200ml：豆粕粉 6g， 饴糖 1g，酵母膏 0.2g，MgSO40.4g，KH2PO40.4g。放入高压灭菌锅，121℃，20min 灭菌。 灭菌操作完毕，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前 20min 进行紫外空气灭菌。 1.3 产酶培养基 培养基组成： 1000ml：豆粕粉 30g，蔗糖 8g，酵母膏 1g，MgSO43.6g，KH2PO41.2g，CaCl21g。放入高压灭菌锅中，121℃、 20min 灭菌。操作完毕，取出置于超净台内，接种前 20 分钟进行紫外空气灭菌。 2．雅致放射毛霉液体深层培养技术 2．2 种子的培养 接种前 4 小时从冰箱取出 1 支菌种，在 25℃条件下活化。在超净台内，以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。孢子悬 浮液以每瓶 10ml 的接种量，接入种子培养基。从超净台取出接好的种子三角瓶，转入摇床，在 28℃、250rpm 的条 件下培养 14～16 小时，至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。 2．3 雅致放射毛霉的产酶培养过程 将已经灭菌的产酶培养基转入超净台，紫外空气灭菌 20 分钟。将培养好的种子用灭过菌的小烧杯进行转接，每 支产酶培养基三角瓶接入 20ml 左右的种子。在 28℃、250rpm 的条件下培养 36～48 小时，至发酵液颜色变深、澄清 为止。 蛋白酶活力测定 （1）定义 1 g 固体酶粉，在一定温度和 pH 值条件下，1 min 水解酪素产生 1 ug 酪氨酸为一个酶活单位，以 u/g 表示。 （2）原理 蛋白酶在一定温度与 pH 条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去， 滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 （3）试剂和溶液 ① 三氯乙酸 c（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸 32.7 g，用水溶解并定容至 500 mL ② 磷酸缓冲溶液（pH=7.5）适用于中性蛋白酶：称取磷酸氢二纳（Na2HPO4·12H2O）3.01 g 和磷酸二氢纳 （NaH2PO4·2H2O）0.25 g，加水溶解并定容至 500 mL。 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液： a.称取预先于105 ℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.100 g，精确至0.001 g，用1 mol/L盐酸60 mL溶解后定容至100 mL， 即为 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液。 b.吸取 1 mg/mL 酪氨酸标准溶液 10.00 mL，用 0.1 mol/L 盐酸定容至 100 mL，即得到 100 ug/mL L—酪氨酸标准 溶液。 ④ 10 g/L 酪素溶液：称取酪素 1.000 g，精确至 0.001 g，用少量 0.5 mol/L 氢氧化钠湿润后，加入适量的缓冲溶液约 80 mL，在沸水域中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入 100 mL 容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度。 ⑤ 待测酶液 精确取 2.00ml，用水使充分溶解，然后将上清夜小心倾入 50 mL 容量瓶中，并定容至刻度，供测试用。(此时相 当于稀释 25 倍)。 （4）分析步骤 ① 求 K 值 （K 取 135） ② 测定
a.先将酪素溶液放入(40±0.2)摄氏度恒温水域中,预热5min b.按下列程序操作:取10ml试管,5ml10倍 试管A(空白) 试管B(酶试样,作三个平行样) 加酶液2.00mL 加酶液2.00mL ↓(40±0.2℃),2min ↓(40±0.2℃),2min 加三氯乙酸400mL(摇匀) 加酪素2.00mL(摇匀) ↓(40±0.2℃),10min ↓(400.2℃),10min 加酪素2.00mL(摇匀) 加三氯乙酸4.00mL(摇匀) 取出静止10min,过滤 取出静止10min,过滤 在275nm波长下,用10mm 在275nm波长下,用10mm 比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度 (5)计算 X=AxK×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 式中X—样品的酶活力(ug) A——试样溶液的平均吸光度 K—吸光常数(K=135) 8反应试剂的总体积(mL) 2—吸取酶液2.00mL,以1mL计 l/10反应时间10min,以1min计 稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数(取0.50) 2
2 a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热 5 min； b. 按下列程序操作：取 10ml 试管，5ml 10 倍 试管 A（空白） 试管 B（酶试样，作三个平行样） ↓ ↓ 加酶液 2.00 mL 加酶液 2.00 mL ↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸 4.00 mL（摇匀） 加酪素 2.00 mL（摇匀） ↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素 2.00 mL（摇匀） 加三氯乙酸 4.00 mL（摇匀） ↓ ↓ 取出静止 10 min，过滤 取出静止 10 min，过滤 ↓ ↓ 在 275 nm 波长下，用 10 mm 在 275 nm 波长下，用 10 mm 比色皿测其吸光度 比色皿测其吸光度 （5）计算 X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E 式中 X——样品的酶活力（u/g） A——试样溶液的平均吸光度 K——吸光常数（K=135） 8——反应试剂的总体积（mL） 2——吸取酶液 2.00 mL，以 1 mL 计 1/10——反应时间 10 min，以 1 min 计 n——稀释倍数 E——紫外法与福林法的换算系数（取 0.50）