第三十一章病毒的遗传与进化(自学) 第三十二章病毒与纽跑的相互作用 6 第一节病毒的培养 第二节病毒与细胞的相互作用 课件002 兽医微生物学教学课件口一
课件002 兽医微生物学教学课件 5 第三十一章 病毒的遗传与进化（自学） 第三十二章 病毒与细胞的相互作用 第一节 病毒的培养 第二节 病毒与细胞的相互作用
第一节病毒的培养 疠毒的培养繁殖只能在活细胞内迸行,是以病毒 基因为模板,在酶的作用下,分别合成其基因及蛋 白质,再组装成完整的病毒颗粒,这种方式称为复 制。常见的病毒培养方法有:细胞(包括组织器官) 培养法;鸡胚培养法;实验动物培养法。SPF动物 或SPF鸡胚,仍常用于培养病毒,但病毒细胞培养发 展最快,重点介绍。 病毒细跑培养 1.概念将适宜组织中的细胞分散,在培养液中进行 细胞培养,再接种病毒,让病毒在细胞中繁殖来培 养病毒的方法。兽医微生物学教学课件一
课件002 兽医微生物学教学课件 6 第一节 病毒的培养 病毒的培养繁殖只能在活细胞内进行，是以病毒 基因为模板，在酶的作用下，分别合成其基因及蛋 白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复 制。常见的病毒培养方法有：细胞（包括组织器官） 培养法；鸡胚培养法；实验动物培养法。 SPF动物 或SPF鸡胚，仍常用于培养病毒，但病毒细胞培养发 展最快，重点介绍。 一、病毒细胞培养 1. 概念 将适宜组织中的细胞分散，在培养液中进行 细胞培养，再接种病毒，让病毒在细胞中繁殖来培 养病毒的方法
2.用途用于病毒学研究。分离病毒,病毒克隆纯 化,病毒病诊断及疫苗制备等。 3.特点一致性好,材料易得,易标准化试验,可 重复性好。可通过细胞病变判定病毒感染,也可结 合免疫学技术检测细胞内的病毒。 二、细胞培养类型 1.原代细胞动物组织经胰蛋白酶等消化、分散, 获得单个细胞悬液,再生长于培养器皿中。制备原 代细胞,肾和睾丸最为常用,以来源于SPF胚胎或 幼畜组织的细胞为好。 课件002 兽医微生物学教学课件口
课件002 兽医微生物学教学课件 7 2. 用途 用于病毒学研究。分离病毒，病毒克隆纯 化，病毒病诊断及疫苗制备等。 3. 特点 一致性好，材料易得，易标准化试验，可 重复性好。可通过细胞病变判定病毒感染，也可结 合免疫学技术检测细胞内的病毒。 二、细胞培养类型 1. 原代细胞 动物组织经胰蛋白酶等消化、分散， 获得单个细胞悬液，再生长于培养器皿中。制备原 代细胞，肾和睾丸最为常用，以来源于SPF胚胎或 幼畜组织的细胞为好
2.二倍体细孢株将原代细胞单层消化分散成单个 细胞,继续培养传代,仍为二倍体。此种细胞数量 可扩大,对病的易感性无变化。从样本中分离培 养病毒,一般多采用此种细胞。 3.传代细跑系在体外培养液中可无限制分裂传代 的细胞。一般来源于肿瘤组织。有已建立的很多传 代细跑系,如He6(人子宫癌细跑)、Vero(非洲绿猴 肾细胞)、PK-15(猪肾细胞)等。 优点:传代及培养方便,使用广泛。 缺点:对有的样本病毒不紋感;传代日久易被霉形 体染或病毒隐性感染有致窟的濤在危险。一
课件002 兽医微生物学教学课件 8 2. 二倍体细胞株 将原代细胞单层消化分散成单个 细胞，继续培养传代，仍为二倍体。此种细胞数量 可扩大，对病毒的易感性无变化。从样本中分离培 养病毒，一般多采用此种细胞。 3. 传代细胞系 在体外培养液中可无限制分裂传代 的细胞。一般来源于肿瘤组织。有已建立的很多传 代细胞系，如Hel6(人子宫癌细胞)、Vero(非洲绿猴 肾细胞)、PK-15(猪肾细胞)等。 优点：传代及培养方便，使用广泛。 缺点：对有的样本病毒不敏感；传代日久易被霉形 体污染或病毒隐性感染；有致肿瘤的潜在危险
细胞培养的方法 最常用的方法为静置培养及旋转培养。还可用悬 浮培养或微载体培养技术等。 静置培养将消化分散的细跑悬液分裝于培养瓶 (管)或培养板(孔),封闭,静置于恒温箱内,数天 后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板, 般需培养在含5%的CO条件下。哺乳动物及禽 类的细胞培养温度一般为37℃。 2.旋转培养基本方法与静置培养相同,不同之处 是要培养的细胞不断缓慢旋转(5-10rpm),经过 段时间,细胞可在培养瓶管)的四壁长满单层。此 的产量高,适用竽疫省半学产件
课件002 兽医微生物学教学课件 9 三、细胞培养的方法 最常用的方法为静置培养及旋转培养。还可用悬 浮培养或微载体培养技术等。 1. 静置培养 将消化分散的细胞悬液分装于培养瓶 (管)或培养板(孔)，封闭，静置于恒温箱内，数天 后细胞可生成贴壁的单层细胞。如用细胞培养板， 一般需培养在含5％的CO2条件下。哺乳动物及禽 类的细胞培养温度一般为37℃。 2. 旋转培养 基本方法与静置培养相同，不同之处 是要培养的细胞不断缓慢旋转(5-10rpm)，经过一 段时间，细胞可在培养瓶(管)的四壁长满单层。此 法的产量高，适用于疫苗生产
3.悬浮培养通过搅拌使细跑处于悬浮状态,并补 充营养和校正pH,使之生长或维持存活。适用某 些不需贴壁生长的细胞系,如NS1(一种骨髓瘤细 胞系)。 4.微载体培养是在悬浮培养的基础上,结合微载 体的细胞培养技术。微载体是直径35-00um微小 颗粒,对细跑无毒性,细胞可贴附其上长成单层。 由于微载体数量较大,所获得的细跑数也比上述 常规方法大为增加,用于规模化细胞或疫苗生产。 微载体有若干型号、已商品化。 课件002 兽医微生物学教学课件口
课件002 兽医微生物学教学课件 10 3. 悬浮培养 通过搅拌使细胞处于悬浮状态，井补 充营养和校正pH，使之生长或维持存活。适用某 些不需贴壁生长的细胞系，如NS1(一种骨髓瘤细 胞系) 。 4. 微载体培养 是在悬浮培养的基础上，结合微载 体的细胞培养技术。微载体是直径35-100um微小 颗粒，对细胞无毒性，细胞可贴附其上长成单层。 由于微载体数量较大，所获得的细胞数也比上述 常规方法大为增加，用于规模化细胞或疫苗生产。 微载体有若干型号、已商品化
第二节病毒与细胞的相互作用 病毒与宿主细跑之间作用的表现形式各异。病毒 的基因往往能诱导、模拟或封闭宿主细胞的功能。 反之,宿主细跑具有的防御功能也能封闭病毒的功 能。病毒可致细跑、亚细跑及分子水平的变化 病毒与细胞相互作用的类塑 宿主细胞感染病毒发生的变化有杀细胞和非杀细 胞两种。即细胞死亡(杀细胞、细胞病变、细胞裂解) 生产性(细胞存活、允许病毒繁殖、分泌释放),非生产性 (细胞存活、阻断病毒复制),转化(病毒基因与细胞基因 整合、可致肿瘤、细胞形态变化)。 课件002 兽医微生物学教学课件口
课件002 兽医微生物学教学课件 11 第二节 病毒与细胞的相互作用 病毒与宿主细胞之间作用的表现形式各异。病毒 的基因往往能诱导、模拟或封闭宿主细胞的功能。 反之，宿主细胞具有的防御功能也能封闭病毒的功 能。病毒可致细胞、亚细胞及分子水平的变化。 一、病毒与细胞相互作用的类型 宿主细胞感染病毒发生的变化有杀细胞和非杀细 胞两种。即细胞死亡（杀细胞、细胞病变、细胞裂解）， 生产性（细胞存活、允许病毒繁殖、分泌释放），非生产性 （细胞存活、阻断病毒复制），转化（病毒基因与细胞基因 整合、可致肿瘤、细胞形态变化）
病毒引致的杀细跑变化 某些病毒接种培养的单层细跑后,第一轮感染产 生的子代病毒将蔓延感染邻近的细胞,最终感染所 有细胞。感染导致的细胞损伤称之为细胞病变 (CPE)。CPE可在光学显微镜下观察,是病毒学检 测及研究的常规手段之一。病毒产生CPE的能力与 其对动物的致病力正相关,因此通常用CPE作为指 标,来判定病毒的毒力,即计算病毒的半数细胞感 染量(TcID50) 细胞病变(CPE)包括涉及细胞膜的CPE(细胞膜融合) 涉及细胞骨架的CPE、病毒引致的细胞凋亡与坏死。 课件002 兽医微生物学教学课件如一
课件002 兽医微生物学教学课件 12 二、病毒引致的杀细胞变化 某些病毒接种培养的单层细胞后，第一轮感染产 生的子代病毒将蔓延感染邻近的细胞，最终感染所 有细胞。感染导致的细胞损伤称之为细胞病变 (CPE)。CPE可在光学显微镜下观察，是病毒学检 测及研究的常规手段之一。病毒产生CPE的能力与 其对动物的致病力正相关，因此通常用CPE作为指 标，来判定病毒的毒力，即计算病毒的半数细胞感 染量(TcID50)。 细胞病变(CPE)包括涉及细胞膜的CPE（细胞膜融合）、 涉及细胞骨架的CPE、病毒引致的细胞凋亡与坏死
三、空班形成 将10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单层细胞 而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂,以防止游 离的病毒通过营养液扩散,但病毒可在细胞间传递。 经过一段时间培养,进行染色,原先感染病毒的细 跑及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似园形的斑 点,类似固体培养基上的菌落形态,称为空斑或蚀 斑(细胞病变)。 课件002 兽医微生物学教学课件口 13
课件002 兽医微生物学教学课件 13 三、空斑形成 将10倍梯度稀释的病毒样本接种吸附于单层细胞， 而后在细胞上覆盖一层含营养液的琼脂，以防止游 离的病毒通过营养液扩散，但病毒可在细胞间传递。 经过一段时间培养，进行染色，原先感染病毒的细 胞及病毒扩散的周围细胞会形成一个近似圆形的斑 点，类似固体培养基上的菌落形态，称为空斑或蚀 斑（细胞病变）
一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致,因 此可将获得的单个空斑制作悬液,梯度稀释后再作 空斑,最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空 斑,这就是病毒克隆。借助空斑技术不仅可纯化病 毒,还对病毒定量,定量单位称为空斑形成单位 (FUO 通过PFU的计数及PFU数试验,可滴定血清的 效价、测定干扰素的活性等。许多动物病毒如疱疹 病毒、披膜病、微RNA病毒及水泡性口炎病毒均可 通过此法作定量分析。 课件002 兽医微生物学教学课件口
课件002 兽医微生物学教学课件 14 一个空斑可能由一个以上病毒颗粒感染所致，因 此可将获得的单个空斑制作悬液，梯度稀释后再作 空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空 斑，这就是病毒克隆。借助空斑技术不仅可纯化病 毒，还对病毒定量，定量单位称为空斑形成单位 (PFU)。 通过PFU的计数及PFU减数试验，可滴定血清的 效价、测定干扰素的活性等。许多动物病毒如疱疹 病毒、披膜病、微RNA病毒及水泡性口炎病毒均可 通过此法作定量分析