七、问答题 1.阐述原核生物的转录终止 (1)转录终止的两种主要的机制是什么? (2)描述翻译怎样能调节转录终止 (3)为什么在细菌转录终止中很少涉及到Pho因子? (4)怎样能阻止转录的终止? 2.复制DNA的聚合酶(DNA依赖的DNMA聚合酶)也有校正功能,解释为什么RM聚合酶没有 这种功能。 3.讨论原核生物基因表达的聚合作用反应定向的重要性。假如核糖体从3’端到5’端读 它的模板mRNA的话,那么将会发生什么情况? 4.概括细菌细胞内的转录过程 5.概括典型原核生物启动子的结构和功能,并解释什么是保守序列。 6.转录如何在基因或基因组末端终止? 7.(1)如何区分由启动子起始转录的RNA片段与5’端被加工过的RNA片段 (2)证明多肽是从氨基端到羧基端方向合成的 8.比较E. coli rrna和tRNA的转录和加工。 9.区别可诱导和可阻遏的基因调控。 10.衰减作用如何调控E.cO中色氨酸操纵子的表达? 11.比较并指出细菌和真核生物RNA翻译机理的异同。 什么是摇摆假说 13.指出Ecol和真核生物翻译起始的不同。 14.S. N Cohen于1973年构建了三个重组体,pSC102,pSC105,pSC109请说明这三个 重组体是如何获得的?各说明了什么? 15.基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的? 6.什么是细菌的限制一修饰系统( restriction-modificaton system,R- M system) 17.细菌的限制一修饰系统有什么意义? 18.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 19.Ⅰ类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用? 20.Ⅲ类限制酶有哪些特点? 21.何谓限制性内切核酸酶的切割频率? 22.什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 3.双酶消化法( double digests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理 24.什么是DNA多态性( DNA polymorphism)? 25.限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism,RFLP)。 26.计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离: AluI:5’AGCT3” EcoR I:5’ GAATTC3 3TCGA5′ 3′ CTTAGG5′ Acyl:5’ GPuCGPyC3
115 七、问答题 1．阐述原核生物的转录终止。 (1)转录终止的两种主要的机制是什么? (2)描述翻译怎样能调节转录终止。 (3)为什么在细菌转录终止中很少涉及到 Pho 因子? (4)怎样能阻止转录的终止? 2．复制 DNA 的聚合酶(DNA 依赖的 DNA 聚合酶)也有校正功能，解释为什么 RNA 聚合酶没有 这种功能。 3．讨论原核生物基因表达的聚合作用反应定向的重要性。假如核糖体从 3’端到 5’端读 它的模板 mRNA 的话，那么将会发生什么情况? 4．概括细菌细胞内的转录过程。 5. 概括典型原核生物启动子的结构和功能，并解释什么是保守序列。 6．转录如何在基因或基因组末端终止? 7．(1)如何区分由启动子起始转录的 RNA 片段与 5’端被加工过的 RNA 片段; (2)证明多肽是从氨基端到羧基端方向合成的。 8．比较 E．coli rRNA 和 tRNA 的转录和加工。 9．区别可诱导和可阻遏的基因调控。 10．衰减作用如何调控 E. coli 中色氨酸操纵子的表达? 11．比较并指出细菌和真核生物 RNA 翻译机理的异同。 12．什么是摇摆假说? 13．指出 E.coli 和真核生物翻译起始的不同。 14．S．N Cohen 于 1973 年构建了三个重组体， pSC102， pSC105， pSC109 请说明这三个 重组体是如何获得的?各说明了什么? 15．基因克隆是如何使含有单个基因的 DNA 片段得到纯化的? 16．什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificaton system, R-M system) 17．细菌的限制—修饰系统有什么意义? 18．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 19．Ⅰ类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用? 20．Ⅲ类限制酶有哪些特点? 21．何谓限制性内切核酸酶的切割频率? 22．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响? 23．双酶消化法(double digests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。 24．什么是 DNA 多态性(DNA polymorphism)? 25．限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。 26．计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离： Alu Ⅰ：5’AGCT 3” EcoR Ⅰ: 5’GAATTC 3’ 3 TCGA 5’ 3’CTTAGG 5’ AcyⅠ:5’GPuCGPyC 3’
3’ CPyGCPu5 (注:Py=任何一种嘧啶:Pu=任何一种嘌呤) 27.在细菌质粒pBP1的四环素抗性基因tet"的中间有一个ind的切点。用Binl切 割果蝇基因组DNA,以pBPⅠ为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆15带有果蝇 的目的基因。用Hinl和EcRV对克隆15进行了酶切分析,电泳结果如图15.1(用酶 切的pBP1质粒DNA作对照),旁边标出了片段的大小 图15.1酶切电泳图谱 1~2:HinM切割:;3~4:EcRV切割;5~6:HindⅢ+EcoR 1、3、5是质粒DNA:2、4、6是15号克隆。 (1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的pBPⅠ的限制性图谱,并标明四环素抗性 基因的位置 (2)如果用克隆在另一个与pBP1完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针,进行 outhern印迹杂交,预测上述电泳图会出现什么样的杂交带? (3)如果用克隆15的果蝇DNA片段作为探针进行 Southem印迹杂交,放射自显影的 结果又是如何? 28.为什么大多数内切酶被称为“限制”酶 29.据 Science杂志报道:一种重要的遗传疾病可由导致DMA中碱基替换的诱变剂在体外进 行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。 116
116 3’CPyGCPu5’ (注： Py=任何一种嘧啶； Pu=任何一种嘌呤) 27．在细菌质粒 pBP1 的四环素抗性基因 tetR 的中间有一个 HindⅡ的切点。用 HindⅢ 切 割果蝇基因组 DNA，以 pBP1 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆 15 带有果蝇 的目的基因。用 HindⅢ和 EcoRV 对克隆 15 进行了酶切分析，电泳结果如图 15.1(用酶 切的 pBP1 质粒 DNA 作对照)，旁边标出了片段的大小。 (1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱，并标明四环素抗性 基因的位置—; (2)如果用克隆在另一个与 pBP1 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针，进 行 Southern 印迹杂交，预测上述电泳图会出现什么样的杂交带? (3)如果用克隆 15 的果蝇 DNA 片段作为探针进行 Southem 印迹杂交，放射自显影 的 结果又是如何? 28．为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。 29．据 Science 杂志报道:一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进 行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。 图 15.1 酶切电泳图谱 1～2：HindⅢ 切割；3～4：ＥcoRV 切割；5～6：Hind Ⅲ+Ｅco RV； 1、3、5 是质粒 DNA： 2、4、6 是 15 号克隆
30.为了绘制长为3.0 kb Band I限制性片段的限制性图谱,分别用 EcoR I、HpaⅡEcOR 十a消化这一片段的三个样品,然后通过凝胶电泳分离DNA片段,溴化乙锭染 图15.2用EcRI、aⅡ单独切割及用这两种酶混合切割30kb BamI片段产生的DNA带 色后观察DNA带型(图15.2)。请根据这些结果,绘制一个限制性图谱,要标明E.cOR 和a识别位点间的相对位置,以及它们之间的距离(kb)。 1.1967年,有5个实验室几乎同时独立发现了DNA连接酶,每个实验室的实验有什么 特点? 32.简述DNA和RNA连接酶的催化反应机制。 33.影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些? 34.什么是 Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 35.如何利用T4DNA聚合酶制备3’隐含末端或双链平末端? 36.如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3’末端标记? 37.如何利用T4DNA聚合酶制备平末端? 8.反转录酶有两种类型,一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMWY, aviam myeloblastosis vIrus),另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV, Moloney murine leukemia virus),它们之间有什么不同? 39.与E. colirna聚合酶相比,细菌噬菌体的SP6RN聚合酶、T7RNA聚合酶和T3RNA 聚合酶具有哪些优越性 40.什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应 41.细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途 42.λ外切核酸酶(1 ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 43.Mn2、Mg2对 DNase I( deoxyribonuclease I)的活性有什么影响? DNase I在基因 工程中有什么作用 44.比较S1- Mapping和 Footprinting在原理上、方法上、应用上有何不同? l17
117 30．为了绘制长为 3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用 EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ EcoR Ⅰ十 HpaⅡ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA 片段，溴化乙锭染 色后观察 DNA 带型(图 15.2)。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明 E.coR Ⅰ 和 HpaⅡ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离(kb)。 31．1967 年，有 5 个实验室几乎同时独立发现了 DNA 连接酶，每个实验室的实验有什么 特点? 32．简述 DNA 和 RNA 连接酶的催化反应机制。 33. 影响 DNA 连接酶催化连接反应的因素有哪些? 34．什么是 Klenow 酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用? 35. 如何利用 T4 DNA 聚合酶制备 3’隐含末端或双链平末端? 36. 如何利用 T4 DNA 聚合酶进行双链 DNA 的 3’末端标记? 37．如何利用 T4 DNA 聚合酶制备平末端? 38．反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMY, aviam myeloblastosis virus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M—MLV，Moloney murine leukemia virus)，它们之间有什么不同? 39．与 E.coli RNA 聚合酶相比，细菌噬菌体的 SP6RNA 聚合酶、 T7 RNA 聚合酶和 T3 RNA 聚合酶具有哪些优越性? 40．什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应? 41．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途? 42．λ外切核酸酶(lambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用? 43．Mn2+、 Mg2+对 DNase Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ)的活性有什么影响? DNase Ⅰ在基因 工程中有什么作用? 44．比较 S1-Mapping 和 Footprinting 在原理上、方法上、应用上有何不同? 图 15.2 用 EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ单独切割及用这两种酶混合切割 30kb BamHⅠ片段产生的 DNA 带
45.什么是复制子( replicon)? 46.什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 47.什么是质粒的带动转移? 48.说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理, 49. Colel衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么? 50.R1质粒拷贝数受到怎样的调节控制 51.质粒如何维持在细胞中的稳定? 52.引起质粒不相容性的主要原因是什么? 53.由于基因工程是人为改变遗传信息的操作,因此必须注意被操作基因的安全,进行严 格的监控,质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方 54.请指出质粒pSC101的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用 55.自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多,即使是ColE1和pSC101这两个自然质 粒也不尽人意,通常需要进行改造,请问质粒改造包括哪些基本内容? 56.质粒改造的发展过程如何? 57.在质粒中如何增减酶切点? 58.有人用限制性内切核酸酶EcORⅠ分别切割松弛型质粒 Colel和严紧型质粒pSCl01(各 有一个切点),然后重组连接形成一个杂种质粒pSC134,请推测这种质粒有什么特性 和用途 59.现分离了4种新的大肠杆菌Hfr菌株,通过中断接合实验,针对每一菌株确定了高频 转移的标记基因和它们进入F受体的时间分别为 Hfrl Hfr2 Hfr3 Hfrs 13min 1 16 6 标记基因和第 arg 次进入的时间hs put his gal (gal、lac、ml、皿a不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖:arg、his、met、trp 生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸;u:紫外线敏感) 任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环 状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了100 分钟转移,而且苏氨酸被认为位于0分钟或100分钟处 0.YAC克隆载体常出现哪些问题? 61.为什么野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体? 62.什么是蓝白斑筛选法? 63.蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性 64.什么是cI筛选法? 65.λ噬菌体载体具有哪些优点与不足? l18
118 45．什么是复制子(replicon)? 46．什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么? 47．什么是质粒的带动转移? 48．说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。 49． Co1El 衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么? 50． R1 质粒拷贝数受到怎样的调节控制? 51．质粒如何维持在细胞中的稳定? 52. 引起质粒不相容性的主要原因是什么? 53．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行 严 格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方 面? 54．请指出质粒 pSC101 的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用。 55. 自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是 Co1E1 和 pSC101 这两个自然质 粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容? 56. 质粒改造的发展过程如何? 57. 在质粒中如何增减酶切点? 58．有人用限制性内切核酸酶 EcoR I 分别切割松弛型质粒 Co1E1 和严紧型质粒 pSC101(各 有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒 pSC134，请推测这种质粒有什么特性 和用途。 59．现分离了 4 种新的大肠杆菌 Hfr 菌株，通过中断接合实验，针对每一菌株确定了高频 转移的标记基因和它们进入 F —受体的时间分别为： 标记基因和第一 次进入的时间 Hfr1 Hfr2 Hfr3 Hfr4 man 13min mal 29 lys 16 pur 6 trp 6 met 14 arg 9 trp 3 his 23 thr 4 mal 2 thr 31 pur 3 uvr 20 his 32 lac 23 gal 14 (gal、lac、mal、man 不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖；arg、his、met、trp 生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸；uvr：紫外线敏感)。 任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环 状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了 100 分钟转移，而且苏氨酸被认为位于 0 分钟或 10O 分钟处。 60．YAC 克隆载体常出现哪些问题? 61．为什么野生型的λ噬菌体 DNA 不宜作为基因工程载体? 62．什么是蓝白斑筛选法? 63．蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性? 64．什么是 cⅠ筛选法? 65．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
66.什么是M3的IG序列区?有何特点和功能? 67.将野生型的M13改造成基因工程载体,首先是进行酶切位点的改造,请问M13中的EcOR I最初是如何引入的? 68.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时,为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 69.M3系列载体具有哪些优缺点? 0.粘粒载体具有哪些特点与不足? 71.辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 72.克隆的DNA在质量上有什么要求? 73.为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂? 74.为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离? 75.为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离?应如何处置? 76.在DNA分离过程中,酚通常与氯仿联合使用,即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯 仿再抽提一次,为什么? 77.说明溴化乙锭一氯化钩密度梯度离心( ethidium bromide- caesium chloride gradient centrifugation)纯化DNA的原理。 78.采用什么措施保证DNA化学合成的定时性和专一性? 79.何谓简并引物( degenerate primer)? 80.简并引物设计的一般原则是什么? 81.双脱氧法( dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 2.在古生物学中,尚不知道恐龙是否是温血爬行动物,而不像今天的变温爬行动物。假 如你得到一些恐龙的DNA,你如何通过PCR和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行 动物? 83.如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成,可以通过何种方法 克隆该基因? 84.何谓定位克隆( positional cloning)? 85.何谓染色体步移( chromosome walking)? 在染色体步移中,用哪些方法获得克隆的末端? 87.何谓表型克隆( phenotype cloning) 什么是基 89.什么是基因组文库( genomic library)?构建基因组文库,涉及哪些基本过程?它同遗传 学上的基因库有什么不同? 90.什么是cDNA文库( complement DNa libraly)?同基因组文库有何差别? 91.粘性末端连接法是最常用的连接方法,具有许多优点,但是也有一些不足,请指出这 些不足之处 92.什么是同聚物加尾连接法( homopo lymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点? 3.何谓接头连接法( Linker ligation)? 94.什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高 95.如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义?
119 66．什么是 M13 的 IG 序列区?有何特点和功能? 67．将野生型的 M13 改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问 M13 中的 EcoR Ⅰ最初是如何引入的? 68．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 69． M13 系列载体具有哪些优缺点? 70．粘粒载体具有哪些特点与不足? 71．辅助噬菌体 DNA 和相应的噬菌粒是如何协同工作的? 72. 克隆的 DNA 在质量上有什么要求? 73．为什么从细胞中分离 DNA 时往往会断裂? 74．为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于 DNA 的分离? 75．为什么氧化变色的酚不能直接用于 DNA 的分离?应如何处置? 76. 在 DNA 分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯 仿再抽提一次，为什么? 77. 说明溴化乙锭—氯化钩密度梯度离心(ethidium bromide-caesium chloride gradient centrifugation)纯化 DNA 的原理。 78. 采用什么措施保证 DNA 化学合成的定时性和专一性? 79．何谓简并引物(degenerate primer)? 80．简并引物设计的一般原则是什么? 81．双脱氧法(dideoxynucleotide method)测序的基本原理是什么? 82．在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不像今天的变温爬行动物。 假 如你得到一些恐龙的 DNA，你如何通过 PCR 和基因克隆来检测恐龙是否是温血 爬行 动物? 83．如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法 克隆该基因? 84．何谓定位克隆(positional cloning)? 85．何谓染色体步移(chromosome walking)? 86．在染色体步移中，用哪些方法获得克隆的末端? 87．何谓表型克隆(phenotype cloning)? 88．什么是基因文库? 89．什么是基因组文库(genomic librarY)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传 学上的基因库有什么不同? 90．什么是 cDNA 文库(complement DNA libraly)?同基因组文库有何差别? 91．粘性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出 这 些不足之处， 92．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优 缺点? 93．何谓接头连接法(Iinker ligation)? 94．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高? 95．如何使用甲基化酶对克隆 DNA 进行保护?有什么意义?
96.何谓稀有酶?(举例说明) 97.为了大量获得许多用于生化鉴定的产物,你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体 酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达,你如何确保最终能得到产物? 98.若在进行DNA重叠群分析时,你发现在一个编码有价值但不稳定蛋白质的可读框之 后,紧接着另一个可读框,它可在蛋白质的C末端加上一个稳定结构。举出至少两种获 得被修饰蛋白产物的方法。 99.某一质粒载体具有Tet和Kan'的表型,在Kan抗性基因内有一BglⅠ的切点。现用 BglI切割该载体进行基因克隆,问:(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养 后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插人片段的 重组体? 100.限制性内切核酸酶 Bamh I和PstI切割某一DNA序列,结果示于图20.1。 图20.1BoI和PstI识别序列处的切割,只显示识别位点的核苷酸序列 (1)指出被切割DNA分子的5’端和3’端; (2)如果你将切割后的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育,这些DNA末端会 有什么样的变化? (3)经过B中的反应后,你还能够用T4DNA连接酶将BaI末端连接起来吗?PstI 末端呢?(T4DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端) (4)(3)中的连接后,能够重新形成BamH1位点吗?Pst1位点呢? 101.什么是遗传学检测法? 102.以pBR322DNA作为载体,从四环素抗性基因区克隆外源DNA时,可采用环丝氨酸富 集法筛选重组体,说明其基本原理和基本操作过程 103.放射性抗体检测法( radioactive antibody test)的基本原理是什么? 104.何谓液相杂交?举例说明在分子生物学中的应用。 105.什么是活体标记法( in vivo labeling)? 107.什么是随机引物( random primer)?如何标记DMP优点? 106.单链RMA作为探针,具有哪些单链DNA探针所没有的 108.良好的固相支持物必须具备哪些优良特性 109.以硝酸纤维素滤膜( nitrocellulose filter membrane)作为杂交的固相支持物具有哪 些优缺点? 110.什么是印迹( blotting)杂交?
120 96．何谓稀有酶?(举例说明) 97．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体 酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物? 98．若在进行 DNA 重叠群分析时，你发现在一个编码有价值但不稳定蛋白质的可读框 之 后，紧接着另一个可读框，它可在蛋白质的 C 末端加上一个稳定结构。举出至少两种获 得被修饰蛋白产物的方法。 99．某一质粒载体具有 Tetr 和 Kanr 的表型，在 Kan 抗性基因内有一 Bgl Ⅰ的切点。现用 Bgl Ⅰ切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养 后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插人片段的 重组体? 100．限制性内切核酸酶 Bam H Ⅰ和 Pst Ⅰ切割某一 DNA 序列，结果示于图 20.1。 图 20.1 BomH Ⅰ和 Pst Ⅰ识别序列处的切割，只显示识别位点的核苷酸序列 (1)指出被切割 DNA 分子的 5’端和 3’端； (2)如果你将切割后的 DNA 同 DNA 聚合酶、4 种 dNTP 在一起温育，这些 DNA 末端会 有什么样的变化? (3)经过 B 中的反应后，你还能够用 T4 DNA 连接酶将 BamH Ⅰ末端连接起来吗? Pst Ⅰ 末端呢？（T4DNA 连接酶能够连接平末端和黏性末端） (4)(3)中的连接后，能够重新形成 BamH I 位点吗？Pst I 位点呢？ 101．什么是遗传学检测法? 102．以 pBR322 DNA 作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源 DNA 时，可采用环丝氨酸富 集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。 103．放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么? 104．何谓液相杂交?举例说明在分子生物学中的应用。 105. 什么是活体标记法(in vivo labeling)? 106. 单链 RNA 作为探针，具有哪些单链 DNA 探针所没有的优点? 107. 什么是随机引物(random primer)?如何标记 DNA? 108．良好的固相支持物必须具备哪些优良特性? 109．以硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose filter membrane)作为杂交的固相支持物具有哪 些优缺点? 110．什么是印迹(blotting)杂交?
111.什么是斑点杂交( dot hybridization)与狭缝杂交( slot hybridizat lon)? 112.什么是原位菌落杂交( colony hybridization)? 113.说明 Southern杂交的原理和方法 114. Northern印迹与 Southern印迹有什么不同? 115.建立了一个基因文库后,如何鉴定一个携带目的基因的克隆? 116.说明原核生物基因表达的正控制诱导型( positive inducible control)和负控制阻 遏型( Negative- represible control)调控的遗传机理。 117.一个四核苷酸序列的DNA分子 ,经羟胺处理后,再经过两次复制,会产生 GETA 什么样的DNA分子?(5分) 118.有一段多肽链的C端氨基酸残基的Tyr- Pro-Asn-val-Thr-Cys-Glu,其对应的DNA序列 为 (SS-1) GATAAGCGTGCATGTAAGCCCCAT (SS-2) CTATTCGCACGTACATTCGGGGTA 119.已知E.Coli基因组DM含有4.2×10bp,Cot/2为4。鸡管状细胞内DNA含有7×10°, 其复性动力学曲线为 请求出鸡细胞DNA中,中度重复序列组分每一重复单位的核苷酸?及重复频率? 120.将一个重组质粒PMR1分别感染三个被λ phage溶原的E.coh菌株(三菌株的差别为 phage的pRoR区段分别为或wt或oR1或oR2-),培养于含ONPG(邻硝基苯一β 半乳糖苷)的培养皿中,在加入不同的IPTG(异丙基一β一D一硫代半乳糖苷,类似 于乳糖,作为效应物分子)的培养皿中,检测被LaZ酶分解ONPG的黄色色度,并换 算成Z酶酶活,请根据测定结果判断这三条曲线分别代表哪一个测验菌株?为什么 121.某一生物DNA的 chemicai complexity=8.82×10bp,复性动力学研究表明约有40%的 DNA其 Cot(/2=5,请较详细地说明这部分DNA的特点。 (E coli DNA kinetic complexity=chemical complexity=4.2 X 10bp, Cot(1/2)=4) 122.分别说明λ phage以下突变型的表现型并简述其分子机理 λ[cI],[cⅡ],[hfl],x[cro] 123.说明 constitutive splicing与 alternative splicing, cis-splicing与 trans-splicing之间在概念 及机制上的区别。 124.E.Coh阿拉伯糖( Arabinose)分解酶操纵子( ara operon)的调节基因I发生突变后, 即使在培养基中加入效应物( Arabinose),操纵子仍处于关闭状态。将构建的i丌基因 的部分二部体E.Co培养在含有阿拉伯糖的培养基中,操纵子处于开放状态。请说明
121 111．什么是斑点杂交(dot hybridization)与狭缝杂交(slot hybridizatlon)? 112．什么是原位菌落杂交(colony hybridization)? 113．说明 Southern 杂交的原理和方法。 114．Northern 印迹与 Southern 印迹有什么不同? 115．建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆? 116．说明原核生物基因表达的正控制诱导型（positive inducible control）和负控制阻 遏型（Negative-represible control）调控的遗传机理。 117．一个四核苷酸序列的 DNA 分子 − − − − GCTA CGAT ，经羟胺处理后，再经过两次复制，会产生 什么样的 DNA 分子？（5 分） 118．有一段多肽链的 C 端氨基酸残基的 Tyr-Pro-Asn-Val-Thr-Cys-Glu,其对应的 DNA 序列 为 （SS-1） GATAAGCGTGCATGTAAGCCCCAT （SS-2） CTATTCGCACGTACATTCGGGGTA 119. 已知 E.Coli 基因组 DNA 含有 4.2×106 bp，Cot/2 为 4。鸡管状细胞内 DNA 含有 7×108， 其复性动力学曲线为： 请求出鸡细胞 DNA 中，中度重复序列组分每一重复单位的核苷酸？及重复频率？ 120. 将一个重组质粒 PMR1 分别感染三个被λphage 溶原的 E. coli 菌株（三菌株的差别为λ phage 的 pRoR 区段分别为或 w.t 或 oR1 —或 oR2 —），培养于含 ONPG（邻硝基苯—β— 半乳糖苷）的培养皿中，在加入不同的 IPTG（异丙基—β—D—硫代半乳糖苷，类似 于乳糖，作为效应物分子）的培养皿中，检测被 LacZ 酶分解 ONPG 的黄色色度，并换 算成 Z 酶酶活，请根据测定结果判断这三条曲线分别代表哪一个测验菌株？为什么？ 121. 某一生物 DNA 的 chemicai complexity=8.82×108bp，复性动力学研究表明约有 40%的 DNA 其 Cot(1/2)=5, 请较详细地说明这部分 DNA 的特点。 （E. coli DNA kinetic complexity=chemical complexity=4.2×108bp，Cot(1/2)=4） 122．分别说明λ phage 以下突变型的表现型并简述其分子机理： λ[cⅠ] — , λ[cⅡ] — , λ[hfl] — , λ[cro]— 123. 说明 constitutive splicing 与 alternative splicing, cis-splicing 与 trans-splicing 之间在概念 及机制上的区别。 124．E. Coli 阿拉伯糖（Arabinose）分解酶操纵子（ara operon）的调节基因 I 发生突变后， 即使在培养基中加入效应物（Arabinose），操纵子仍处于关闭状态。将构建的 i — /I 基因 的部分二部体 E. Coli 培养在含有阿拉伯糖的培养基中，操纵子处于开放状态。请说明
ara operon的调控类型,并推测i突变基因的基因型。(简述推论的理由) 125.简述λ phage选择溶原途径( lysogenic pathway)的分子生物学原理。 126.请说明一种利用PCR技术进行目标基因定点突变的技术路线及原理 127.拟应用苏云金秆菌中的一个毒素蛋白基因培育抗虫作物品种。请提出一个从基因分离 开始到品种推广为止的实验方案。并指出值得注意的关键问题。 128.说明不同种属的植物基因组共线性发现的理论和实践意义 129.基因组研究对作物遗传改良将会产生哪些影响? 130.你正在克隆一个基因。现在你己得到了数个DNA片段。下一步你将如何从中鉴定出你 所希望得到的目标基因 131.谈谈基因工程的基本步骤,说明重要工具酶在各个步骤中的作用 132.根据你对分子克隆载体的了解,对克隆载体的类别,用途及各自的特殊性加以简述。 133.以E.Coli为例,简述其基因重组的类型,作用机理及其在分子生物学研究中的应用。 134.如何解释抗体生成多样性的分子机理 135.如果你发现了一种新蛋白质,你将如何进行下一步研究?请按先后顺序列出基本方案。 136.应用生物技术创建作物新的种质有哪些途径和方法。 137.分子标记辅助选择在作物育种中有那些重要作用?如何实施? 138.说明真核生物前体RNA加工的类别及机理。 139.说明原核生物与真核生物转录元件( cis and trans)的特点 140.简述人类基因组研究近年来的进展 141.说明DNA芯片(含0 ligonucleotide chip and cDna microarray)技术的基本概念和可 能的用途 142.如何确定细菌的某一个遗传表型是由染色体控制还是由质粒控制的 143.简述DNA重组的几种不同方式及分子机理 144.比较说明原核生物与真核生物在基因表达水平上的异同 145.至少列举三例(除DNA双螺旋结构外)说明核酸分子结构的硏究成果对分子生物学理 论发展的重要贡献 146.说明生物体保证自身稳定遗传的机制 147.说明蛋白质与DNA之间序列非线性相关的因素 148.在核苷酸测序的操作中,利用哪几个途径分别获得一个片段两条单链的序列?各自的 理论依据是什么?试言简意赅地加以论述。 149.到目前为止,在高等生物中根据性状表现分离未知产物基因采用哪些途径?请说明各 种途径的基本原理并各举一例 150.请以基因组研究的新进展为例,讨论分子生物学发展与生物技术产业化的关系。 151.试述作物遗传资源的重要性,何谓作物遗传资源的创新? 152.利用分子标记进行基因定位的遗传群体有几种?各有什么优、缺点? 153.就你所熟悉的某一作物,简述作物杂种优势研究与利用的现状 154.你对“基因工程育种”有何评价? 155.何谓断裂基因( split gene)?何谓重叠基因( over lapping gene)?它们在生物进化与 适应上有何意义?
122 ara operon 的调控类型，并推测 i —突变基因的基因型。（简述推论的理由） 125．简述λphage 选择溶原途径（lysogenic pathway）的分子生物学原理。 126. 请说明一种利用 PCR 技术进行目标基因定点突变的技术路线及原理。 127．拟应用苏云金秆菌中的一个毒素蛋白基因培育抗虫作物品种。请提出一个从基因分离 开始到品种推广为止的实验方案。并指出值得注意的关键问题。 128．说明不同种属的植物基因组共线性发现的理论和实践意义。 129．基因组研究对作物遗传改良将会产生哪些影响？ 130．你正在克隆一个基因。现在你己得到了数个 DNA 片段。下一步你将如何从中鉴定出你 所希望得到的目标基因。 131．谈谈基因工程的基本步骤，说明重要工具酶在各个步骤中的作用。 132．根据你对分子克隆载体的了解，对克隆载体的类别，用途及各自的特殊性加以简述。 133．以 E.Coli 为例，简述其基因重组的类型，作用机理及其在分子生物学研究中的应用。 134．如何解释抗体生成多样性的分子机理。 135．如果你发现了一种新蛋白质，你将如何进行下一步研究?请按先后顺序列出基本方案。 136．应用生物技术创建作物新的种质有哪些途径和方法。 137．分子标记辅助选择在作物育种中有那些重要作用?如何实施? 138．说明真核生物前体 RNA 加工的类别及机理。 139．说明原核生物与真核生物转录元件(cis and trans)的特点。 140．简述人类基因组研究近年来的进展。 141. 说明 DNA 芯片(含 Oligonucleotide chip and cDNA microarray)技术的基本概念和可 能的用途。 142. 如何确定细菌的某一个遗传表型是由染色体控制还是由质粒控制的。 143. 简述 DNA 重组的几种不同方式及分子机理。 144. 比较说明原核生物与真核生物在基因表达水平上的异同。 145．至少列举三例 (除 DNA 双螺旋结构外)说明核酸分子结构的研究成果对分子生物学理 论发展的重要贡献． 146．说明生物体保证自身稳定遗传的机制。 147．说明蛋白质与 DNA 之间序列非线性相关的因素。 148．在核苷酸测序的操作中，利用哪几个途径分别获得一个片段两条单链的序列?各自的 理论依据是什么?试言简意赅地加以论述。 149．到目前为止，在高等生物中根据性状表现分离未知产物基因采用哪些途径?请说明各 种途径的基本原理并各举一例。 150．请以基因组研究的新进展为例，讨论分子生物学发展与生物技术产业化的关系。 151．试述作物遗传资源的重要性，何谓作物遗传资源的创新? 152．利用分子标记进行基因定位的遗传群体有几种?各有什么优、缺点? 153．就你所熟悉的某一作物，简述作物杂种优势研究与利用的现状。 154．你对“基因工程育种”有何评价? 155．何谓断裂基因( split gene)?何谓重叠基因( overlapping gene)?它们在生物进化与 适应上有何意义?
156.何谓分子标记?分子标记的种类有哪些?可以开展哪些领域的研究? 157.自花授粉作物与异花授粉作物的育种方法有何异同?数量性状如何进行改良? 158.在提取由ColEⅠ所衍生的质粒(如pBR322)时,常在培养携带质粒的大肠杆菌摇瓶中 加入一定浓度的氯霉素或壮观霉素以扩增质粒DNA。质粒DNA扩增的理论依据是什么? 这种质粒DMA扩增的方法为何并不具有普遍性? 159.E. Coli k2菌株的限制一修饰系统分别由R.M基因控制现有K2的三个突变菌系,当 用A噬菌体分别感染三个突变株后,将放出的噬菌体再去感染这三个菌株。得到如下 不同的eop值,请判断这三个突变株的有关(R.M)基因型。 放出A的原始菌株 K12-2 160.现有两种DNA片段: 1) ATTCCAGGATCCTGGCACCG TAAGGTCCTAGGACCGTGGC 2) CGATCTCCTAGATCTCAC GCTAGAGGATCTAGAGTG 分别用形成等列序列的同裂酶MboI和Sau3A消化后,混合,加入连接 酶,会形成什么样的DNA片段。 161.现有枯草杆菌dnaG基因的一个终止突变型菌株,当用HA处理后,会得到什么结果? 说明理由 162.下表中,a、b、c代表E.coli的 Lac operon中的i、o、z三个基因 A)根据不同试验菌株在效应物有无的条件下,测定Z酶的表达结果,说明a、b、c 各代表哪个基因 B)用i、o、z三个基因代号写出第①、⑤菌株的可能基因型 菌株基因型 有Lac ①abc ③abc/F’-ab'c ④abc/F’-abc ⑤abc'/F’-abc 163.一位科学研究λ噬菌体的一个蛋白质的功能时,获得了以下几个试验结果 A、当用HA处理野生型λ噬菌体后,分离得到一个突变体a(m'a),它只产生该蛋白质 的一个片段。 、当用5Bru处量mt后,又分离出两个突变体,mb,m'c,它们也只产生与mut后
123 156．何谓分子标记?分子标记的种类有哪些?可以开展哪些领域的研究? 157．自花授粉作物与异花授粉作物的育种方法有何异同?数量性状如何进行改良? 158．在提取由 ColEI 所衍生的质粒(如 pBR322)时，常在培养携带质粒的大肠杆菌摇瓶中 加入一定浓度的氯霉素或壮观霉素以扩增质粒 DNA。质粒 DNA 扩增的理论依据是什么? 这种质粒 DNA 扩增的方法为何并不具有普遍性? 159．E. Coli K12 菌株的限制一修饰系统分别由 R. M 基因控制现有 K12 的三个突变菌系，当 用 A 噬菌体分别感染三个突变株后，将放出的噬菌体再去感染这三个菌株。得到如下 不同的 eop 值，请判断这三个突变株的有关（R. M）基因型。 放出 A 的原始菌株 K12-1 K12—2 K12—3 K12-1 1 1 1 K12—2 10-2 1 1 K12—3 1 1 1 160．现有两种 DNA 片段： 1）ATTCCAGGATCCTGGCACCG TAAGGTCCTAGGACCGTGGC 2）CGATCTCCTAGATCTCAC GCTAGAGGATCTAGAGTG 分别用形成等列序列的同裂酶MboI 和 Sau3A 消化后，混合，加入连接 酶，会形成什么样的 DNA 片段。 161．现有枯草杆菌 dnaG 基因的一个终止突变型菌株，当用 HA 处理后，会得到什么结果？ 说明理由。 162．下表中，a、b、c 代表 E. coli 的 Lac operon 中的 i、o、z 三个基因。 A）根据不同试验菌株在效应物有无的条件下，测定 Z 酶的表达结果，说明 a、b、c 各代表哪个基因。 B）用 i、o、z 三个基因代号写出第①、⑤菌株的可能基因型。 菌 株 基 因 型 有 Lac 无 Lac ① a - b + c + + + ② a + b + c - + + ③ a + b - c + /F’-a - b + c - + + ④ a + b + c - /F’-a - b - c + + - ⑤ a - b = c + /F’-a = b - c - + + 163. 一位科学研究λ噬菌体的一个蛋白质的功能时，获得了以下几个试验结果。 A、当用 HA 处理野生型λ噬菌体后，分离得到一个突变体 a(mu+ a)，它只产生该蛋白质 的一个片段。 B、当用 5Bru 处量 muta 后，又分离出两个突变体，mu + b, mu+ c，它们也只产生与 muta 后
相同长度的该蛋白质的一个片段 C、mu'a,muib,mc分别可以在不同的Su’基因型细胞内合成该蛋白质的正常多肽链 基因型 5°CGA3′ TTG CCA Su→Su的DNA 序列突变 3°GAT5′ AAT mu a D、当感染有ma的Su细菌分别与感染有mb的Su感染有mc的Sus细菌结合后, 没有野生型重组λ噬菌体产生,不能在野生型Su受菌体内繁殖,但当感染有mub 的Su2与感染有muc的Su6细菌结合后的极少数野生型λ噬菌体产生。 请推测mu'a,muib,mu'c分别在su、su、su细菌内产生的蛋白质与野生型λ合 成的该蛋白质的差异,并解释A、B、C、D结果 (CAA为谷氨酰胺的密码子:UCG为丝氨酸的密码子;UG为色氨酸的密码子) 164.大豆 phaselin(菜豆朊)是在种子内特异表达的一种分泌性蛋白,请用线段示意出该 基因在DMA水平上的全部结构区域,以及Pre-mRNA, mature-mRNA,多肽链的对应区域, 并标明各区域的名称。(提示:该基因的各区域包括: Promoter(含3个重要的Site或 Box), Terminator, Leader Seg, Trailer se Chambon rule Shine-Dalgarno seg . 2r Intron, 3/ Exon, Adding trailer signaler, Repeat seq In 165.有人错误地认为“E. coli trp synthetase operon i"的突变型是由于i基因产物可 以分解效应物分子所形成的”,正确的理解是什么?如何用遗传学试验否认这一说法? 166.用HA处理W.t枯草杆菌,得到分别两个不同位点上发生了无意突变的菌株,mut1, mut2,并证明这两个无意突变的序列不同。当再用HA处理这两个突变株后得到了以下 结果 mutl mute 诱发DNA水平发生回复突变 诱发一种无意序列变成另一种无意序列 167.将E. coli Lac operon中的IPO片段与 yeast的Ho基因构成的重组DNA分子与带Leu 基因的质粒连接,转化到 Yeast2TB菌株中(基因型为 hML a leu-mat a HMRa sir.ho) 将转化子涂于分别含有 Lactose, Maltose, Lactose+ Glucose的培养皿中,当长出菌 苔后,再分别涂上DC14菌株(a结合型),DC17菌株(α结合型),请判断在哪些培养 皿中会出现二倍体的杂合菌落,并说明推论的依据
124 相同长度的该蛋白质的一个片段。 C、mu + a，mu + b, mu+ c 分别可以在不同的 Su+ 基因型细胞内合成该蛋白质的正常多肽链。 基因型 SuSu2 + Su4 + Su6 + Su-→Su +的 DNA 序列突变 5°CGA 3’ 3°GCT 5’ ↓ 5°CTA 3’ 3°GAT 5’ TTG AAC ↓ TTA AAT CCA GGT ↓ TCA AGT mu + a mu + b mu + c — — — — + — + — — — — + D、当感染有 mu + a 的 Su4 +细菌分别与感染有 mu + b 的 Su2 +感染有 mu + c 的 Su6 +细菌结合后， 没有野生型重组λ噬菌体产生，不能在野生型 Su-受菌体内繁殖，但当感染有 mu + b 的 Su2 +与感染有 mu + c 的 Su6 +细菌结合后的极少数野生型λ噬菌体产生。 请推测 mu + a, mu + b, mu+ c 分别在 su4 +、su2 + 、su6 +细菌内产生的蛋白质与野生型λ合 成的该蛋白质的差异，并解释 A、B、C、D 结果。 （CAA 为谷氨酰胺的密码子：UCG 为丝氨酸的密码子；UGG 为色氨酸的密码子） 164．大豆 phasealin(菜豆朊)是在种子内特异表达的一种分泌性蛋白，请用线段示意出该 基因在 DNA 水平上的全部结构区域，以及 Pre-mRNA，mature-mRNA，多肽链的对应区域， 并标明各区域的名称。（提示：该基因的各区域包括：Promoter（含 3 个重要的 Site 或 Box ） ,Terminator, Leader Seq., Trailer seq., Signal seq., Chambon rule, Shine-Dalgarno seq., 2 个 Intron, 3 个 Exon, Adding trailer signaler, Repeat seq. in CTU.） 165．有人错误地认为“E. coli trp synthetase operon ic 的突变型是由于 i c 基因产物可 以分解效应物分子所形成的”，正确的理解是什么？如何用遗传学试验否认这一说法？ 166． 用 HA 处理 W.t 枯草杆菌，得到分别两个不同位点上发生了无意突变的菌株，mut1, mut2，并证明这两个无意突变的序列不同。当再用 HA 处理这两个突变株后得到了以下 结果。 mut1 mut2 诱发 DNA 水平发生回复突变 - - 诱发一种无意序列变成另一种无意序列 + - 167．将 E.coli Lac operon 中的 IPO 片段与 yeast 的 HO 基因构成的重组 DNA 分子与带 Leu + 基因的质粒连接，转化到 Yeast 27B 菌株中（基因型为 HML a Leu-MATα HMRa SIR. ho） 将转化子涂于分别含有 Lactose, Maltose, Lactose +Glucose 的培养皿中，当长出菌 苔后，再分别涂上 DC14 菌株（a 结合型），DC17 菌株（α结合型），请判断在哪些培养 皿中会出现二倍体的杂合菌落，并说明推论的依据