18 海南师范学院学报(自然科学版) 2005 Journal of Hainan Normal University (Natural Scie Sep.2005 植物原生质体培养与融合的研究进展 李春艳,李妮亚,陈少良 (北京林业大学生物科学与技术学院,北京100083) 摘要:对原生质体的分离、培养、融合及植株再生方面进行了简要的论述.并根据对有关 文献的分析,讨论了原生质体研究中存在的问题及今后的发展趋势,指出植物原生质体的游 离、培养和融合技术在近20多年来得到了迅速的发展,今后在进一步加强原生质体培养基础 理论研究的同时,重点放在利用原生质体融合技术进行遗传性状的改良,以获得优良性状的个 体并通过无性途径固定下来 关键词:原生质体;游离;培养;融合;植株再生 中图分类号:Q945文献标识码A文章编号:1671-8747(2005)03-0020-0 原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的“裸露细胞”,对它的研究,可追溯到20世纪 60年代英国植物学家 ocking"用酶解方法降解细胞壁,获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得 到迅速的发展.1970年 Nagata和 Takeble首次报道烟草叶肉原生质体经分离、培养得到再生植株 Carlson3 于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细 胞杂种,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径近年来,由于原生质体本身所具有的特点及其培养 技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来越受到重视.研究领域也从 分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其 是遗性状改良)方面 前人的研究表明,原生质体不仅可以作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细 胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料;而且,近年来以原生质体为材料利用 膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调剂机制已经成为人们所热切关注的问 题与此同时,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料“5现在人们对利 用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践,目前已 经建立对芹菜、玉米、胡萝卜、拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究6.这对植物遗 传转化、性状改良等方面都具有深刻的指导意义湖 原生质体的游离 1.1游离材料 选择分离原生质体的适宜材料是分离原生质体成功的关键,主要包括基因型、材料的类型及材料的生 理状态等3个方面.基因型直接影响原生质体的分离培养效果.不同基因型分离的原生质体产量和活力差别 很大,并直接影响原生质体植株再生.同时起始材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响 也很大叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离 原生质体的最佳材料是叶片叫.此外,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离 收稿日期 基金项目:国家自然科学基金重点项目(30430430)全国高校优秀博士学位论文作者专项基金资助项目(200152);高等 学校优秀青年教师教学科研奖励计划项目(2002323) 作者简介李春艳(1979-),女,山西人,硕士研究生,主要研究方向为树木抗性生理 o1994-2008ChinaAcademicjOurmalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net
收稿日期 :2005 - 04 - 07 基金项目 :国家自然科学基金重点项目 (30430430) ;全国高校优秀博士学位论文作者专项基金资助项目 (200152) ;高等 学校优秀青年教师教学科研奖励计划项目 (2002 - 323) 作者简介 :李春艳(1979 - ) ,女 ,山西人 ,硕士研究生 , 主要研究方向为树木抗性生理. 第 18 卷 第 3 期 2005 年 9 月 海南师范学院学报(自然科学版) Journal of Hainan Normal University(Natural Science) Vol. 18 No. 3 Sep. 2005 植物原生质体培养与融合的研究进展 李春艳 , 李妮亚 , 陈少良 (北京林业大学 生物科学与技术学院 ,北京 100083) 摘 要 :对原生质体的分离、培养、融合及植株再生方面进行了简要的论述. 并根据对有关 文献的分析 ,讨论了原生质体研究中存在的问题及今后的发展趋势 ,指出植物原生质体的游 离、培养和融合技术在近 20 多年来得到了迅速的发展 ,今后在进一步加强原生质体培养基础 理论研究的同时 ,重点放在利用原生质体融合技术进行遗传性状的改良 ,以获得优良性状的个 体并通过无性途径固定下来. 关键词 :原生质体 ; 游离 ; 培养 ; 融合 ; 植株再生 中图分类号 : Q 945 文献标识码 :A 文章编号 :1671 - 8747 (2005) 03 - 0020 - 05 原生质体是去除了细胞壁被质膜所包围的、具有生活力的“裸露细胞”,对它的研究 ,可追溯到 20 世纪 60 年代英国植物学家 Cocking[1 ]用酶解方法降解细胞壁 ,获得了番茄根尖原生质体 ,自此原生质体的研究得 到迅速的发展. 1970 年 Nagata 和 Takeble[2 ]首次报道烟草叶肉原生质体经分离、培养得到再生植株. Carlson[3 ] 于 1972 年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个种间杂种 ,可部分克服有性杂交不亲和性 ,获得体细 胞杂种 ,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径. 近年来 ,由于原生质体本身所具有的特点及其培养 技术与有关的细胞、分子和遗传等学科的交叉渗透 ,使植物原生质体的研究越来越受到重视. 研究领域也从 分离原生质体进行的生理生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段转到原生质体的应用(尤其 是遗性状改良) 方面. 前人的研究表明 ,原生质体不仅可以作为一个单细胞系统来研究细胞壁再生、细胞分裂与分化、摄入细 胞器、病毒侵染机理、膜透性及离子转运等基础理论研究的理想材料 ;而且 ,近年来以原生质体为材料利用 膜片钳技术研究离子通道及原生质体在受光、胁迫和激素作用后的调剂机制已经成为人们所热切关注的问 题. 与此同时 ,原生质体也被用来作为研究植物细胞钙信号转导及其调节机制的理想材料 [4 ,5 ] . 现在人们对利 用原生质体导入外源基因及原生质体瞬间表达系统在基因研究中的应用进行了大胆的尝试和实践 ,目前已 经建立对芹菜、玉米、胡萝卜、拟南芥和烟草等植物对不同的外界刺激下信号转导机制的研究 [6 ] . 这对植物遗 传转化、性状改良等方面都具有深刻的指导意义 [7 ,8 ] . 1 原生质体的游离 1. 1 游离材料 选择分离原生质体的适宜材料是分离原生质体成功的关键 [9 ] ,主要包括基因型、材料的类型及材料的生 理状态等 3 个方面. 基因型直接影响原生质体的分离培养效果. 不同基因型分离的原生质体产量和活力差别 很大 [10 ] ,并直接影响原生质体植株再生 [11 ,12 ] . 同时起始材料及其生理状态对原生质体的制备和活力的影响 也很大 [13 ] . 叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母细胞受到破坏 ,许多资料报道双子叶植物分离 原生质体的最佳材料是叶片 [14 ] . 此外 ,子叶、胚轴、茎尖及愈伤组织、悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离
第3期 李春艳等:植物原生质体培养与融合的研宄进展 原生质体的材料在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料.但是,采用 愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长 短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量 许多研究表明分离前的预处理对保持原生质体的完整性及提高原生质体的产量有积极的作用. Willin 等把苹果叶片放在附加质量分数为5%PP并添加0.5mmlL的蛋氨酸的w5盐-糖溶液中处理30 min,原生质体的产量明显提高.金晓玲等的研究表明,在分离草莓叶肉原生质体前将试管苗转入低浓度蔗糖 的培养基中预培养2~3周,或暗处理1周,原生质体的产量大大提高.但是并非所有的原生质体分离都需 要经过预处理,如柑桔试管苗幼叶原生质体的游离m 1.2原生质体的游离与纯化 游离原生质体常用的酶有纤维素酶 Cellulase oo cuka r-10、半纤维素酶 Hemicellulase果胶酶 Pectolyase Y-23和离析酶 Macerozyme R-10等,其中纤维素酶和果胶酶是最必要的果胶酶Y-23的活性极高,用于 叶组织的用量一般为0.1%(质量分数).不同植物材料选用哪种酶较好取决于所用细胞和组织的来源由 于酶制剂中常含有核酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减少酶解时间,提高原生质体的活 力实验证明在原生质体分离的混合酶液中加入一定量的CaC2.2HO、KH1FPO2具有保护膜的作用,加入 适量的PP或MB能稳定酶解过程的pH值通常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖来调节酶液的渗透压.W.巴 尔茨(1983)等认为代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇) 起使用有利于维持酶液的渗透压.酶解是在25~28℃的恒温下黑暗或弱光下进行的.酶解后经过400目 左右的镍丝网过滤滤去消解不完全的组织碎块(导管、筛管等)和细胞团.然后将滤液离心,弃去上清液,将 离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW中,再次离心,去上清液,重复3次在倒置显微镜下检查纯化效 果,效果好,用原生质体培养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,使完整的原生质体浮于液 面 2原生质体的培养 2.1培养基 原生质体的培养基多采用Kmn8P和NT培养基.Km8P培养基是以B5培养基为基础NT培养基是以MS 培养基为基础改良的,培养基的pH值一般为6~5.8 无机盐是构成培养基的主要成分,其中aa2和NH对培养基的影响较大,较高的Ca2浓度能提高原生 质体的稳定性,早在1977年 Von amold和 eriksson1就证实了高浓度的钙促进了豌豆原生质体的存活和细 胞分裂,但高浓度的NH对原生质体的生长发育不利 Upadhya(1975)报道NH可以抑制马铃薯原生质 体的生长现在常用有机氮如谷氨酰胺、水解酪蛋白等作氮源来提高原生质体的分裂频率,如柑桔原生质体 的培养 许多实验证明糖是原生质体培养中较理想的渗透压稳定剂和碳源卫志明等在191年的报道指出 使用葡萄糖可提高悬铃木叶肉原生质体的植板率,且对细胞的毒害也小.198年,马锋旺等关于抗氧化剂对 杏和中国李原生质体培养影响的研究中发现,在培养基中添加甘氨酸、鬥P(聚乙烯吡咯烷酮)、维生素C等 可较好地防止木本植物原生质体再生细胞团的褐化现象.赵颖等(1994)对植物原生质体培养的生理基 础问题的讨论中指出,细胞壁脱离后,随着培养天数的增加,RNae酶活性异常升高,加入BSA可降低该酶的 活性,保证原生质体的活力.此外在培养基中添加一定量的脱落酸、多胺、活性炭等可促进细胞分裂和胚状 体的形成 不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要求存在很大的差异,通常培养的前期需要较高水平的 生长素和细胞分裂素,才能启动细胞壁的再生和细胞分裂 2.2培养方法 原生质体培养方法很多,有液体浅层培养、固液结合培养、看护培养和琼脂岛培养等,其中常用的是液 体浅层培养和固液结合培养法许多木本植物都采用液体浅层培养获得成功如悬铃木、猕猴桃、苹果 301994-2008ChinaAcademicJourmalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.enki.net
原生质体的材料. 在木本植物中 ,愈伤组织或细胞悬浮物是应用最广泛的原生质体培养材料 [15 ] . 但是 ,采用 愈伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才能达到适合分离原生质体的状态 ;而继代时间的长 短在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量 [16 ] . 许多研究表明分离前的预处理对保持原生质体的完整性及提高原生质体的产量有积极的作用. Willin 等 [11 ]把苹果叶片放在附加质量分数为 5 % PVP 并添加 0. 5 mmolΠL 的蛋氨酸的 W5 盐 - 糖溶液中处理 30 min ,原生质体的产量明显提高. 金晓玲等的研究表明 ,在分离草莓叶肉原生质体前将试管苗转入低浓度蔗糖 的培养基中预培养 2～3 周 ,或暗处理 1 周 ,原生质体的产量大大提高 [13 ] . 但是并非所有的原生质体分离都需 要经过预处理 ,如柑桔试管苗幼叶原生质体的游离 [17 ] . 1. 2 原生质体的游离与纯化 游离原生质体常用的酶有纤维素酶 Cellulase Onozuka R - 10、半纤维素酶 Hemicellulase、果胶酶 Pectolyase Y- 23 和离析酶 Macerozyme R - 10 等 ,其中纤维素酶和果胶酶是最必要的 ,果胶酶 Y - 23 的活性极高 ,用于 叶组织的用量一般为 0. 1 %(质量分数) [18 ] . 不同植物材料选用哪种酶较好取决于所用细胞和组织的来源. 由 于酶制剂中常含有核酸酶 ,影响原生质体的活力 ,可以用降低保温温度或减少酶解时间 ,提高原生质体的活 力. 实验证明在原生质体分离的混合酶液中加入一定量的 CaCl2 . 2H2O、KH2PO4 具有保护膜的作用 [19 ] ,加入 适量的 PVP 或 MES 能稳定酶解过程的 pH 值 [20 ] . 通常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖来调节酶液的渗透压. W. 巴 尔茨(1983) 等 [21 ]认为 ,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和山梨醇) 与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇) 一起使用有利于维持酶液的渗透压. 酶解是在 25～28 ℃的恒温下黑暗或弱光下进行的. 酶解后经过 400 目 左右的镍丝网过滤 ,滤去消解不完全的组织碎块(导管、筛管等) 和细胞团. 然后将滤液离心 ,弃去上清液 ,将 离心下来的原生质体重新悬浮在洗液(CPW) 中 ,再次离心 ,去上清液 ,重复 3 次. 在倒置显微镜下检查纯化效 果 ,效果好 ,用原生质体培养基离心 ,效果不好 ,用质量分数为 20 %的蔗糖离心 ,使完整的原生质体浮于液 面. 2 原生质体的培养 2. 1 培养基 原生质体的培养基多采用 Km8P 和 NT 培养基. Km8P 培养基是以 B5 培养基为基础 ,NT 培养基是以 MS 培养基为基础改良的 [22 ] ,培养基的 pH 值一般为 5. 6～5. 8. 无机盐是构成培养基的主要成分 ,其中 Ca2 + 和 NH+ 4 对培养基的影响较大 ,较高的 Ca2 + 浓度能提高原生 质体的稳定性 ,早在 1977 年 ,Von Arnold 和 Eriksson[23 ]就证实了高浓度的钙促进了豌豆原生质体的存活和细 胞分裂 ,但高浓度的 NH+ 4 对原生质体的生长发育不利. Upadhya (1975) [24 ] 报道 NH+ 4 可以抑制马铃薯原生质 体的生长. 现在常用有机氮如谷氨酰胺、水解酪蛋白等作氮源来提高原生质体的分裂频率 ,如柑桔原生质体 的培养 [25 ] . 许多实验证明糖是原生质体培养中较理想的渗透压稳定剂和碳源. 卫志明等 [26 ] 在 1991 年的报道指出 使用葡萄糖可提高悬铃木叶肉原生质体的植板率 ,且对细胞的毒害也小. 1998 年 ,马锋旺等关于抗氧化剂对 杏和中国李原生质体培养影响的研究中发现 ,在培养基中添加甘氨酸、PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 、维生素 C 等 可较好地防止木本植物原生质体再生细胞团的褐化现象 [27 ] . 赵颖等 [28 ] (1994) 对植物原生质体培养的生理基 础问题的讨论中指出 ,细胞壁脱离后 ,随着培养天数的增加 ,RNase 酶活性异常升高 ,加入 BSA 可降低该酶的 活性 ,保证原生质体的活力. 此外在培养基中添加一定量的脱落酸、多胺、活性炭等可促进细胞分裂和胚状 体的形成. 不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要求存在很大的差异 ,通常培养的前期需要较高水平的 生长素和细胞分裂素 ,才能启动细胞壁的再生和细胞分裂. 2. 2 培养方法 原生质体培养方法很多 ,有液体浅层培养、固液结合培养、看护培养和琼脂岛培养等 ,其中常用的是液 体浅层培养和固液结合培养法. 许多木本植物都采用液体浅层培养获得成功. 如悬铃木 [26 ] 、猕猴桃 [29 ] 、苹果. 第 3 期 李春艳等 :植物原生质体培养与融合的研究进展 562
海南师范学院学报(自然科学版) 2005年 目前应用最广泛的是固液结合培养中的双层培养法,使用这种方法既可以从固体培养基中吸收养分以补 充培养物对营养的消耗,同时培养物所产生的一些有害物质也可被固体部分吸收.1994年,吴家道等在水 稻原生质体高效培养技术的研究中发现,培养20d左右就可获得肉眼可见的愈伤组织,证明了固液双相培 养法较其他方法更能显著提高水稻原生质体的植板率 随着对原生质体研究的不断发展,培养方法也不断推陈出新有海藻酸钠包埋培养2和低熔点的琼脂 糖薄层培养.海藻酸钠包埋培养是应用藻酸盐来固定原生质体,不仅可以在常温下操作,而且加入一种螯 合剂后可使固态的培养基液化,便于培养物的转移琼脂糖不仅具有熔点低的特点,而且能促进原生质体再 生细胞的分裂.1986年, Abdullah r等在水稻培养的研究中发现·琼脂糖包埋培养技术可明显地增加水 稻原生质体的存活率、分裂频率和植板率 3原生质体植株再生 颜昌敬(1990)报道,通过原生质体获得的再生植株大多数集中在茄科、伞形科、十字花科、菊科、豆科和 禾本科的几个属.植物原生质体培养形成的愈伤组织能否表现出形态分化和植株再生及再生频率的高低 主要决定于供体植物材料和基因型.叶肉组织、茎尖、胚性组织的细胞分离的原生质体再生植株能较好 地保持原来的倍性;而悬浮培养的细胞特别是长期继代培养的细胞因在遗传学上的不稳定较容易出现倍性 和数目的变化.1982年,孙勇如等的研究表明,枸杞原生质体再生愈伤组织分化能力的丧失是由于供体 愈伤组织的长期继代培养而产生的.但从另一个角度讲,原生质体再生植株的变异提供了另外一种来源的 体细胞变异,这对体细胞遗传的研究和育种上有十分重要的意义 原生质体融合 自 Carlson等在1972年获得第一株烟草体细胞杂种植物以来,原生质体融合技术在植物中得到了广泛 的应用在融合方法上,1974年高国楠创立PEG化学诱导融合法目前PEG与高Ca、高pH结合的诱导 融合已经成为化学诱导细胞融合的主流用该方法诱导原生质体融合时,其融合频率的大小除与PEG本身 的纯度和浓度有关外,还与原生质体的生理状态与密度等因素有关近年来一些学者建议在PEG溶液中加 入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白A、胰蛋白酶、精胺和亚精胺等)可以显著提高融合频率. Senda于1979年建 立的电融合法,是目前最流行的物理诱导融合法迄今为止,通过电融合反复实验,已经测出了数十种植 物原生质体的电融合数,如水稻、小麦、燕麦( Avena satiⅳaL)、马铃薯( Solanum tuberous)、油菜(B. campestris)、 胡萝卜 Daucus carota)、菜豆( Phaseolus vulgaris))、蚕豆烟草矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种.原生质 体融合频率的高低除了受原生质体密度、悬液中CaC2浓度的影响外,还受交变电流的强度与大小及脉冲期 宽度与间隔的影响诸葛强等“利用电融合技术对杨树体细胞融合进行研究,首次得到了美洲黑杨+胡杨、 青杨+胡杨、美洲黑杨+青杨体细胞杂种愈伤组织,其中美洲黑杨+胡杨、青杨+胡杨体细胞杂种愈伤组织 可在附加质量分数为0.4%的氯化钠的培养基上生长,表现出融合亲本之一的胡杨的耐盐性 融合后的原生质体,在一定条件下培养再生成植株的过程中,需要对杂种细胞筛选和对体细胞杂种进 行鉴定,但是目前对它们的研究不是很多杂种细胞筛选方法有3类:1)突变细胞互补选择法如将黄化的 黄花烟草(N. rustica)原生质体同白化的普通烟草原生质体融合,筛选出绿色的种间体细胞杂种2)利用 原生质体特性差异的选择法 Sunder等(1986)根据融合和未融合原生质体物理特性的差异,利用倒置显 微镜成功挑选出油莱融合原生质体.3)利用杂种细胞生长差异的选择法.如1992年蔡起贵对美味猕猴桃原 生质体再生植株无性系变异的研究表明,通过美味猕猴桃愈伤组织培养的原生质体再生植株在叶片、节间 及花的形态上表现出大量的无性变异目前对于再生植株是否为体细胞杂种的鉴定,主要采用植株形态、 染色体数目、同功酶和DNA图谱等指标 5展望 近20年来,植物原生质体培养技术得到了迅速的发展,并取得了可喜的成绩,主要表现在通过原生质体 C1994-2008 China Academic Joumal Ele PublishingHouseAllrightsreservedhttp://ww
目前应用最广泛的是固液结合培养中的双层培养法 [30 ] ,使用这种方法既可以从固体培养基中吸收养分以补 充培养物对营养的消耗 ,同时培养物所产生的一些有害物质也可被固体部分吸收. 1994 年 ,吴家道等 [31 ]在水 稻原生质体高效培养技术的研究中发现 ,培养 20 d 左右就可获得肉眼可见的愈伤组织 ,证明了固液双相培 养法较其他方法更能显著提高水稻原生质体的植板率. 随着对原生质体研究的不断发展 ,培养方法也不断推陈出新 ,有海藻酸钠包埋培养 [32 ] 和低熔点的琼脂 糖薄层培养 [33 ] . 海藻酸钠包埋培养是应用藻酸盐来固定原生质体 ,不仅可以在常温下操作 ,而且加入一种螯 合剂后可使固态的培养基液化 ,便于培养物的转移. 琼脂糖不仅具有熔点低的特点 ,而且能促进原生质体再 生细胞的分裂 [34 ] . 1986 年 ,Abdullah R 等 [35 ] 在水稻培养的研究中发现 ,琼脂糖包埋培养技术可明显地增加水 稻原生质体的存活率、分裂频率和植板率. 3 原生质体植株再生 颜昌敬(1990) 报道 ,通过原生质体获得的再生植株大多数集中在茄科、伞形科、十字花科、菊科、豆科和 禾本科的几个属 [36 ] . 植物原生质体培养形成的愈伤组织能否表现出形态分化和植株再生及再生频率的高低 主要决定于供体植物材料和基因型 [37 ,38 ] . 叶肉组织、茎尖、胚性组织的细胞分离的原生质体再生植株能较好 地保持原来的倍性 ;而悬浮培养的细胞特别是长期继代培养的细胞因在遗传学上的不稳定较容易出现倍性 和数目的变化 [39 ] . 1982 年 ,孙勇如等 [40 ]的研究表明 ,枸杞原生质体再生愈伤组织分化能力的丧失是由于供体 愈伤组织的长期继代培养而产生的. 但从另一个角度讲 ,原生质体再生植株的变异提供了另外一种来源的 体细胞变异 ,这对体细胞遗传的研究和育种上有十分重要的意义. 4 原生质体融合 自 Carlson 等在 1972 年获得第一株烟草体细胞杂种植物以来 ,原生质体融合技术在植物中得到了广泛 的应用. 在融合方法上 ,1974 年 ,高国楠 [41 ]创立 PEG化学诱导融合法. 目前 PEG与高 Ca2 + 、高 pH 结合的诱导 融合已经成为化学诱导细胞融合的主流. 用该方法诱导原生质体融合时 ,其融合频率的大小除与 PEG本身 的纯度和浓度有关外 ,还与原生质体的生理状态与密度等因素有关. 近年来一些学者建议在 PEG溶液中加 入融合促进剂(如伴刀豆球蛋白 A、胰蛋白酶、精胺和亚精胺等) 可以显著提高融合频率. Senda 于 1979 年建 立的电融合法 [42 ] ,是目前最流行的物理诱导融合法. 迄今为止 ,通过电融合反复实验 ,已经测出了数十种植 物原生质体的电融合数 ,如水稻、小麦、燕麦(Avena sativa L) 、马铃薯(Solanum tuberousm) 、油菜(B. campestris) 、 胡萝卜(Daucus carota) 、菜豆(Phaseolus vulgaris) 、蚕豆、烟草、矮牵牛等 ,并成功获得部分细胞杂种 [43 ] . 原生质 体融合频率的高低除了受原生质体密度、悬液中 CaCl2 浓度的影响外 ,还受交变电流的强度与大小及脉冲期 宽度与间隔的影响. 诸葛强等 [44 ]利用电融合技术对杨树体细胞融合进行研究 ,首次得到了美洲黑杨 + 胡杨、 青杨 + 胡杨、美洲黑杨 + 青杨体细胞杂种愈伤组织 ,其中美洲黑杨 + 胡杨、青杨 + 胡杨体细胞杂种愈伤组织 可在附加质量分数为 0. 4 %的氯化钠的培养基上生长 ,表现出融合亲本之一的胡杨的耐盐性. 融合后的原生质体 ,在一定条件下培养再生成植株的过程中 ,需要对杂种细胞筛选和对体细胞杂种进 行鉴定 ,但是目前对它们的研究不是很多. 杂种细胞筛选方法有 3 类 :1) 突变细胞互补选择法. 如将黄化的 黄花烟草(N. rustica) 原生质体同白化的普通烟草原生质体融合 ,筛选出绿色的种间体细胞杂种 [45 ] . 2) 利用 原生质体特性差异的选择法. Sundber 等 [46 ] (1986) 根据融合和未融合原生质体物理特性的差异 ,利用倒置显 微镜成功挑选出油菜融合原生质体. 3) 利用杂种细胞生长差异的选择法. 如 1992 年蔡起贵对美味猕猴桃原 生质体再生植株无性系变异的研究表明 ,通过美味猕猴桃愈伤组织培养的原生质体再生植株在叶片、节间 及花的形态上表现出大量的无性变异 [47 ] . 目前对于再生植株是否为体细胞杂种的鉴定 ,主要采用植株形态、 染色体数目、同功酶和 DNA 图谱等指标 [48 ] . 5 展望 近 20 年来 ,植物原生质体培养技术得到了迅速的发展 ,并取得了可喜的成绩 ,主要表现在通过原生质体 662 海南师范学院学报(自然科学版) 2005 年
第3期 李春艳等:植物原生质体培养与融合的研宄进展 获得再生植株的植物种类不断增加,包括林木、观赏植物、药用植物、果树和作物等.目前通过原生质体培养 获得再生的植株有280余种,其中20余种是我国首先培养成功的虽然对植物原生质体的研究取得了很 大的进展,但是利用原生质体技术改良高等植物的遗传性状并将之运用于生产实践中还有很大距离今后 的任务为:1)进一步扩大原生质体培养材料的种类及基因型我们在一些蔬菜及豆科的牧草上已经取得了 些进步,但是对高等植物原生质体培养中有重要经济价值的植物种类的研究相对较少.这是限制高等植物 遗传操作开展及其在生产上应用的原因之一2)加强对原生质体再生植株无性系变异的细胞遗传学研究,比 如核质关系、不亲和性、细胞分裂的调控及细胞全能性的机理遗传物质的重组等生物学基础理论的研究.3) 选择应用先进的融合方法进行多种方式的融合,除对称融合外,还要注意不对称融合的研究.因此,今后在 进一步加强原生质体培养基础理论研究时.应将重点放在利用原生质体融合技术进行遗传性状的改良,以 获得优良性状的个体并通过无性途径固定下来 参考文献 [1 COCKNG E C. A method fer the 1. olation oi plant protoplasts and vacuoles [ J]. Nature 1960, 187: 927-929 [2 NAGATA T, TAKEBE 1. Cell well regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts[J. Panta, 1970,92: 301 [3]刘继红,邓秀新植物原生质体非对称融合及其在育种上的应用U]生命科学,1999,1增刊):88 [4 GLROY S, JONES RL. Gibberellic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barely aleurone protoplasts J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 3 591-3995 [5 KNIGHTM R, ANTHONY KC, STEVEN M S. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold shock and elicitors on cytoplasmic calcium]. Nature, 1991, 352: 524 16 JEN SHEEN. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts[J]. Pant Physiology, 2001, 1274): 1-446 [7]孙敬三,桂耀林植物细胞工程实验技术[M]北京:科学出版社,1995 [8] TAUIORUS T E, FOWKE L C. Somatic embryogenesis in conifers[J]. Can J Bot, 1991, 69: 1 873-1 899 [9] PATTA-OCHATT EM, ROWER J B. Advances in plant regeneration from apple protoplasts[J]. Acta Horticulture, 19905): 285 [10] NYAN M, WALLN A. Mant regeneation from trawberry( Fragaria Xananssa)mesophyll protoplasts []. Pant Physiol, 1998, 133 375-377 [11 WALLIN A, WEANDER M. Improved yield of apple leaf protoplasts from invitro cultured shoots by using very young leaves and add ing L-methionine to the shoot medium[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 1985, 5: 69-72 [12 HUANCARUNA- PERALES E, SHIBATE M. Pant regeneration from leaf protoplasts of apple[J]. Pant Cell lissue and Organ Cut ure,1993,34:7-76 [13]金晓玲,何平木本植物原生质体培养与融合研究进展[]浙江师范大学学报:自然科学版,2003,26(1):54·59 [14]沈前华,杨柏云,郭金平,等.大花蕙兰原生质体分离的影响因素研究[]江西农业学报199,8(1):36-40 [5]陈正华木本植物组织培养及其应用[M]北京高等教育出版社,1986 16]陆荣生,韩美丽.木本植物原生质体培养研究进展[].广西林业科学,1998,27(4):197-201. [17 OCHATTSJ, CASOO H. Shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of wild pear (pyrus communis va pyraster L)J] Plant Physiol,1986,122:243-249 [18]夏镇澳.植物原生质体培养理论、技术研究进展].农业科学集刊,1995(2):1-6 [19]陈振光,林顺权,凌经天.果树原生质体培养及细胞融合的硏究进展[].福建农学院学报,199,19(1):102-113 [20 OCHATT SJ. Woody plant protoplast techology revisisted [J]. Acta Hbrticulturace, 1993, 336: 285-295 [21][西德]巴尔茨W,赖因哈德E,岑克MH植物组织培养及其在生物技术上的应用[M].夏镇奥译.北京:科学出版社 [22]孙勇如,安锡培.植物原生质体培养[M].北京:科学出版社,1991 [23 VON ARNOLD S, ERIKSSON T. A revised medium for growth of pea mesophyll protoplasts[J]. Pant Physiol, 1977, 39: 257-260 [24 UPADHYA M D. Isolation and culture of mesophyll protoplasts of potato( Salanum tuberosum L )[J]. Rotato Res, 1975, 18: 438 201994-2008ChinaAcademicJOurnalElectronicPublishingHouseAllrightsreservedhttp://www.cnki.net
获得再生植株的植物种类不断增加 ,包括林木、观赏植物、药用植物、果树和作物等. 目前通过原生质体培养 获得再生的植株有 280 余种 [49 ] ,其中 20 余种是我国首先培养成功的. 虽然对植物原生质体的研究取得了很 大的进展 ,但是利用原生质体技术改良高等植物的遗传性状并将之运用于生产实践中还有很大距离. 今后 的任务为 :1) 进一步扩大原生质体培养材料的种类及基因型. 我们在一些蔬菜及豆科的牧草上已经取得了一 些进步 ,但是对高等植物原生质体培养中有重要经济价值的植物种类的研究相对较少. 这是限制高等植物 遗传操作开展及其在生产上应用的原因之一. 2) 加强对原生质体再生植株无性系变异的细胞遗传学研究 ,比 如核质关系、不亲和性、细胞分裂的调控及细胞全能性的机理、遗传物质的重组等生物学基础理论的研究. 3) 选择应用先进的融合方法进行多种方式的融合 ,除对称融合外 ,还要注意不对称融合的研究. 因此 ,今后在 进一步加强原生质体培养基础理论研究时. 应将重点放在利用原生质体融合技术进行遗传性状的改良 ,以 获得优良性状的个体并通过无性途径固定下来. 参考文献 : [1 ] COCKING E C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles[J ]. Nature ,1960 , 187 :927 - 929. [2 ] NAGATA T , TAKEBE I. Cell wall regeneration and cell division in isolated tobacco mesophyll protoplasts[J ]. Planta , 1970 , 92 :301 - 308. [3 ] 刘继红 ,邓秀新. 植物原生质体非对称融合及其在育种上的应用[J ]. 生命科学 ,1999 ,11(增刊) : 88 - 91. [4 ] GILROY S , JONES R L. Gibberellic acid and abscisic acid coordinately regulate cytoplasmic calcium and secretory activity in barely aleurone protoplasts[J ]. Proc Natl Acad Sci USA ,1992 ,89 : 3 591 - 3 995. [5 ] KNIGHT M R , ANTHONY K C , STEVEN M S. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold2shock and elicitors on cytoplasmic calcium[J ]. Nature ,1991 ,352 :524. [6 ] J EN SHEEN. Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts[J ]. Plant Physiology , 2001 ,127(4) : 1 - 446. [7 ] 孙敬三 ,桂耀林. 植物细胞工程实验技术[M]. 北京 :科学出版社 ,1995. [8 ] TAUTORUS T E , FOWKE L C. Somatic embryogenesis in conifers[J ]. Can J Bot ,1991 ,69 :1 873 - 1 899. [9 ] PATTA - OCHATT E M , POWER J B. Advances in plant regeneration from apple protoplasts[J ]. Acta Horticulture , 1990(5) :285 - 288. [10 ] NYMAN M , WALLIN A. Plant regeneation from trawberry (Fragaria ×ananssa) mesophyll protoplasts [J ]. Plant Physiol , 1998 ,133 : 375 - 377. [11 ] WALLIN A , WELANDER M. Improved yield of apple leaf protoplasts from invitro cultured shoots by using very young leaves and add2 ing L2methionine to the shoot medium[J ]. Plant Cell Tissue and Organ Culture ,1985 ,5 :69 - 72. [12 ] HUANCARUNA - PERALES E , SHIBATE M. Plant regeneration from leaf protoplasts of apple[J ]. Plant Cell Tissue and Organ Cul2 ture , 1993 , 34 : 71 - 76. [13 ] 金晓玲 ,何 平. 木本植物原生质体培养与融合研究进展[J ]. 浙江师范大学学报 :自然科学版 ,2003 , 26(1) :54 - 59. [14 ] 沈前华 ,杨柏云 ,郭金平 ,等. 大花蕙兰原生质体分离的影响因素研究[J ]. 江西农业学报 ,1996 ,8 (1) :36 - 40. [15 ] 陈正华. 木本植物组织培养及其应用[M]. 北京 :高等教育出版社 ,1986. [16 ] 陆荣生 ,韩美丽. 木本植物原生质体培养研究进展[J ]. 广西林业科学 ,1998 ,27(4) : 197 - 201. [17 ] OCHATT S J , CASO O H. Shoot regeneration from leaf mesophyll protoplasts of wild pear (pyrus communis va pyraster L.) [J ]. Plant Physiol ,1986 ,122 :243 - 249. [18 ] 夏镇澳. 植物原生质体培养理论、技术研究进展[J ]. 农业科学集刊 ,1995(2) :1 - 6. [19 ] 陈振光 ,林顺权 ,凌经天. 果树原生质体培养及细胞融合的研究进展[J ]. 福建农学院学报 ,1990 , 19(1) :102 - 113. [20 ] OCHATT S J . Woody plant protoplast technology revisisted[J ]. Acta Horticulturace ,1993 ,336 : 285 - 295. [21 ] [西德]巴尔茨 W , 赖因哈德 E , 岑克 M H. 植物组织培养及其在生物技术上的应用[M]. 夏镇奥译. 北京 :科学出版社 , 1983. [22 ] 孙勇如 ,安锡培. 植物原生质体培养[M]. 北京 :科学出版社 ,1991. [23 ] VON ARNOLD S , ERIKSSON T. A revised medium for growth of pea mesophyll protoplasts[J ]. Plant Physiol , 1977 ,39 :257 - 260. [24 ] UPADHYA M D. Isolation and culture of mesophyll protoplasts of potato (Salanum tuberosun L.) [J ]. Potato Res ,1975 ,18 :438 - 445. 第 3 期 李春艳等 :植物原生质体培养与融合的研究进展 762
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[25 ] GROSSER J W. CHANDLER J L. Aseptic isolation of protoplasts from Citrus , Poncirus , Citrus×Poncirus hybrids and severinia for use in somatic hybridization experiments [J ]. Scientia hortic ,1989 ,31 : 253 - 257. [26 ] 卫志明 ,许智宏 ,许 农 ,等. 悬铃木叶肉原生质体培养再生植株[J ]. 植物学报 ,1991 ,33(11) : 813 - 818. [27 ] 马锋旺 ,李嘉瑞. 抗氧化剂对杏和中国李原生质体培养的影响[J ]. 西北农业学报 ,1998 ,26(6) :10 - 13. [28 ] 赵 颖 ,梁海曼. 植物原生质体培养及有关生理基础问题[J ]. 广西植物 ,1994 ,14 (1) : 74 - 80. [29 ] 肖尊安 ,沈德绪 ,林伯年. 美味猕猴桃子叶愈伤组织的原生质体培养和再生植株[J ]. 武汉植物学研究 ,1993 ,11(3) : 247 - 251. [ 30 ] OCHATT SJ , CHEVREAU E , GALLET M. Organogenesis from‘Passe Crassane’and‘Old Home’pear (Pyrus Commnis L. ) proto2 plasts and isoenzymatic trueness - to - type of the regenerated plants [J ]. The Apple Genet ,1992 ,83 :1 013 - 1 018. [31 ] 吴家道 ,杨剑波 ,向太和 ,等. 水稻原生质体高效培养技术的研究[J ]. 安徽农业科学 ,1994 ,22(4) :305 - 309. [32 ] HUANCARUNA - PERALES E , SCHIEDER O. Plant regeneration from protoplasts of apple [J ]. Plant cell、Tissue&Organ Culture , 1993 ,34 :71 - 76. [33 ] CHEN M H , CHEN C C. Plant regeneration from Carica protoplasts[J ]. Plant Cell Reports ,1992 ,11 :404 - 407. [34 ] LI R B. Protoplast culture and plant regeneration of indica rice by nurse culture and capsulation technique [J ]. Guang xi Science , 1998 ,5 (3) :230 - 236. [35 ] ABDULLAH R , COCKING E C , THOMPSON J A. Efficient plant regeneration from rice protoplats through somatic embryogensis[J ]. Bio Thchnology ,1986 ,4 :1 087 - 1 090. [36 ] 颜昌敬. 植物组织培养手册[M]. 上海 :科学技术出版社 ,1990. [37 ] VASILL J K. Developing cell and tissue culture systems for improvement of cereal and grass crops[J ]. J Plant Physoil ,1987 ,128 :193 - 218. [38 ] 贾敬芬. 禾谷类植物原生质体培养和融合[A]. 孙敬三 , 陈维伦. 植物生物技术和作物改良[ C]. 北京 :中国科学技术出版 社 ,1990. 71 - 82. [39 ] 黄培铭 ,颜昌敬. 大麦叶肉原生质体的分离与培养初报[J ]. 上海农业学报 ,1990 ,6(4) : 17 - 20. [40 ] 孙勇如 ,李文彬 ,黄美娟 ,等. 枸杞的原生质体生成愈伤组织[J ]. 植物学报 ,1982 ,24(5) : 477 - 479. [41 ] KAO K N. A method for higher - frequency intergenric fusion of plant protoplast [J ]. Planta ,1974 ,115 :355 - 367. [42 ] SENDA M. Plant cell physiol [J ]. Plant cell Rep ,1979 ,20 :1 441 - 1 443. [43 ] 汪和睦 ,谢廷栋. 细胞电穿孔、电融合、电刺激 ———原理技术及应用[M]. 天津 : 天津科学技术出版社 ,2000. [44 ] 诸葛强 ,黄敏仁 ,王明庥. 杨树体细胞融合研究[J ]. 南京林业大学学报 ,2000 , 24 (2) : 6 - 10. [45 ] 黄白渠. 植物体细胞遗传学简明教程[M]. 长春 : 东北师范大学出版社 ,1991. [46 ] SUNDBER E , GIMELIUS KA. Method for production of interspecific hybrids within B. rassiceae via somatic hybridization using resyn2 theis is of B. rassica napusas a model[J ]. Plant Sci ,1986 ,43 :155 - 162. [47 ] 蔡起贵. 美味猕猴桃原生质体再生植株无性系变异的研究[J ]. 植物学报 ,1992 ,34 :822 - 888. [48 ] 邓秀新 ,刘继红. 果树遗传转化及基因组转移研究进展[J ]. 武汉植物学研究 ,1996 ,14(4) :357 - 369. [49 ] PUITE KJ . Progress in plant protoplast research[J ]. Physiol plant ,1992 ,85 :403 - 410. Advances in researches on protoplast of plants LI Chun2yan , LI Ni2ya , CHEN Shao2liang ( College of Biological Sciences and Technology , Beijing Forestry University , Beijing 100083 , China) Abstract : The isolation , culture and fusion technology of plant protoplast have been developing rapidly over the past twenty years. In this peper , we concisely summarized the protoplast isolation , culture , fusion and plant regeneration. Besides ,existing problems and fur2 ther development were also discussed. Key words: protoplast ; isolation ; culture ; fusion ; plant regeneration 862 海南师范学院学报(自然科学版) 2005 年