氨在肝性脑病发病机制中的作用肝性脑病是严重肝病引起的以代谢紊乱为基础的意识改变和昏迷为主的中枢神经系统功能失调的神经精神综合征。在肝功能严重障碍后，血氨增高与肝性脑病的发生密切相关，为使学生获得这一方面的感性认识，从而加深对氨中毒学说的认识，特设计本实验。【实验目的】学习复制急性肝功能不全的动物模型的方法，通过观察出现相应症状所需NHC1用量及时间，测定血氨浓度，来进一步探讨氨在肝性脑病发病机制中的作用。谷氨酸钠是针对氨中毒的一项基本治疗措施，通过谷氨酸钠实验性治疗，探讨其治疗的病理生理机制。【实验原理】实验通过对大部分肝脏结扎的方法，造成肝解毒功能的严重损害，在此基础上经消化道输入氯化铵溶液，使动物出现震颤、抽播、昏迷等类似肝性脑病症状，同时测定血氨浓度：设置相关对照组，以进一步探讨氨在肝性脑病发病机制中的作用。【实验对象】健康家免（2—2.5kg）【器材、药品】1%普鲁卡因、2.5%复方氯化铵溶液、复方NaCI溶液、2.5%复方谷氨酸钠溶液、常规动物手术器械一套、免手术台及兔头固定器、小儿静脉头皮针，10ml、30ml注射器，粗、细手术线，粗棉线、测定血氨的试剂、药品与仪器见附录。【方法步骤及观察项目】本实验以呼吸（频率、幅度）、角膜反射、瞳孔大小、对刺激的反应、是否出现肌肉痉挛、抽描及强直为观察指标，并记录出现相应症状所需的NH,CI用量及时间，测定血氨浓度。（一）取四只家兔，分四组实验。家兔称重后仰卧固定于兔手术台上。剪去颈前部和上腹部正中线附近的被毛。（二）用1%普鲁卡因6一8m1沿颈正中线做局部浸润麻醉后，行颈部手术。（三）颈总动脉插管：在甲状软骨下纵行切开颈正中皮肤，切口为6cm左右，行颈总动脉插管术（方法参见实验酸碱平衡紊乱一节）以备取血测定血氨。（四）肝大部分结扎术：从胸骨剑突下沿腹正中线行约6一8cm长的切口，打开腹腔，暴露肝脏，剪断肝与横隔之间的镰壮韧带，再将肝叶上翻，剥离肝胃韧带，使肝叶完全游离。辩明肝脏各叶（见图3-22），用粗棉线沿肝左外叶、左中叶、右中叶和方形叶之根部围绕一周并用力结扎粗棉线，使被结扎肝叶迅速变为暗褐色。由于供应右外叶及尾壮叶的门脉血管为独立分支，不会同时被结扎而得以保留。图3-22（五）十二指肠插管：沿胃幽门找出十二指肠，提出腹腔，经肠系膜穿一粗线，牵引十二指肠并将线头固定于兔固定台的竖铁杆上，以皮钳对合夹住腹壁，关闭腹腔，将十二指肠祥留在腹腔外，置于盐水纱布上。把小儿头皮针向结肠方向刺入十二指肠的肠腔内，固定好针头。（六）观察并记录实验前的各项指标后分组复制以下模型：1.甲免一一肝大部结扎+肠腔推注复方NHCI溶液：通过头皮针，每隔5分钟向十二指肠肠腔内快速推注复方NH.CI溶液5m1。仔细观察，及时记录各项指标的变化，记录从用药开始至出现相应症状所需时间和每公斤体重的复方NHC1用量（m1/kg体重），也可取血测定血氨浓度。继续推注复方NHCI溶液直至动物死亡，记录存活时间和复方NH,Cl用量（ml/kg体重）
氨在肝性脑病发病机制中的作用 肝性脑病是严重肝病引起的以代谢紊乱为基础的意识改变和昏迷为主的中枢神经系统 功能失调的神经精神综合征。在肝功能严重障碍后，血氨增高与肝性脑病的发生密切相关， 为使学生获得这一方面的感性认识，从而加深对氨中毒学说的认识，特设计本实验。 【实验目的】 学习复制急性肝功能不全的动物模型的方法，通过观察出现相应症状所需 NH4Cl 用量及 时间，测定血氨浓度，来进一步探讨氨在肝性脑病发病机制中的作用。谷氨酸钠是针对氨中 毒的一项基本治疗措施，通过谷氨酸钠实验性治疗，探讨其治疗的病理生理机制。 【实验原理】 实验通过对大部分肝脏结扎的方法，造成肝解毒功能的严重损害，在此基础上经消化 道输入氯化铵溶液，使动物出现震颤、抽搐、昏迷等类似肝性脑病症状，同时测定血氨浓度； 设置相关对照组，以进一步探讨氨在肝性脑病发病机制中的作用。 【实验对象】 健康家兔（2—2.5kg） 【器材、药品】 1%普鲁卡因、2.5%复方氯化铵溶液、复方 NaCI 溶液、2.5%复方谷氨酸钠溶液、常规动 物手术器械一套、兔手术台及兔头固定器、小儿静脉头皮针，10ml、30ml 注射器，粗、细 手术线，粗棉线、测定血氨的试剂、药品与仪器见附录。 【方法步骤及观察项目】 本实验以呼吸（频率、幅度）、角膜反射、瞳孔大小、对刺激的反应、是否出现肌肉痉 挛、抽搐及强直为观察指标，并记录出现相应症状所需的 NH4Cl 用量及时间，测定血氨浓度。 (一)取四只家兔，分四组实验。家兔称重后仰卧固定于兔手术台上。剪去颈前部和上腹 部正中线附近的被毛。 (二)用 1%普鲁卡因 6—8ml 沿颈正中线做局部浸润麻醉后，行颈部手术。 (三)颈总动脉插管：在甲状软骨下纵行切开颈正中皮肤，切口为 6cm 左右，行颈总动脉 插管术（方法参见实验酸碱平衡紊乱一节）以备取血测定血氨。 (四)肝大部分结扎术：从胸骨剑突下沿腹正中线行约 6—8cm 长的切口，打开腹腔，暴 露肝脏，剪断肝与横膈之间的镰壮韧带，再将肝叶上翻，剥离肝胃韧带，使肝叶完全游离。 辩明肝脏各叶（见图 3-22），用粗棉线沿肝左外叶、左中叶、右中叶和方形叶之根部围绕一 周并用力结扎粗棉线，使被结扎肝叶迅速变为暗褐色。由于供应右外叶及尾壮叶的门脉血管 为独立分支，不会同时被结扎而得以保留。 图 3-22 (五)十二指肠插管：沿胃幽门找出十二指肠，提出腹腔，经肠系膜穿一粗线，牵引十二 指肠并将线头固定于兔固定台的竖铁杆上，以皮钳对合夹住腹壁，关闭腹腔，将十二指肠袢 留在腹腔外，置于盐水纱布上。把小儿头皮针向结肠方向刺入十二指肠的肠腔内，固定好针 头。 (六)观察并记录实验前的各项指标后分组复制以下模型： 1.甲兔——肝大部结扎 + 肠腔推注复方 NH4CI 溶液：通过头皮针，每隔 5 分钟向十二 指肠肠腔内快速推注复方 NH4CI 溶液 5ml。仔细观察，及时记录各项指标的变化，记录从用 药开始至出现相应症状所需时间和每公斤体重的复方 NH4Cl 用量（ml/kg 体重），也可取血测 定血氨浓度。继续推注复方 NH4CI 溶液直至动物死亡，记录存活时间和复方 NH4Cl 用量（ml/kg 体重）
2.乙免一一肝叶假手术+肠腔推注复方NHCI溶液：除肝叶不结扎外，其余操作、观察、记录等步骤于甲兔相同。3.丙免一一肝叶大部分结扎+肠腔推注复方NaCI溶液：操作、观察、记录等步骤于甲免相同，只是要以同样的速度向肠腔内推注复方NaCI溶液，待复方NaCI溶液的用量（ml/kg体重）超过乙免相应复方NHC1用量时，即可停止推注。4.工免一一肝大部结扎+注射复方谷氨酸钠溶液+肠腔推注复方NHCI溶液：按20ml/kg体重计量从耳缘静脉缓慢注射复方谷氨酸钠溶液，再重复甲免操作步骤，注意与甲免进行比较。【注意事项】（一）剪镰状韧带时勿损伤隔肌和血管，游离肝脏时动作宜轻以免肝叶破裂出血；结扎线应结扎于肝叶根部避免拦腰勒破肝叶。操作过程应及时止血。（二）各组肠腔推注药液的量和速度以及应间隔的时间要保持一致。（三）十二指肠插管不要插向胃的方向：氯化铵溶液勿注入腹腔或胃腔内。【思考与讨论】（一）比较上述四组实验结果，找出它们的异同点，结合实验结果，分析总结氨在肝性脑病发病机制中的作用。（二）实验中引起血氨变化的原因是什么？临床上肝功能障碍的患者引起血氨增高的主要原因和机制是什么？（三）复方氯化铵溶液的主要成分有哪些？它们的主要作用是什么？（四）在肝性脑病的治疗中，你认为可能有效治疗或缓解氨中毒的环节有哪些？请写出你的具体方案。附录：（一）溶液配制：1.复方氯化铵溶液配制：氯化铵25g，碳酸氢钠15g，以5%葡萄糖溶液稀释至1000ml。2.复方谷氨酸钠溶液配制：谷氨酸钠25g，碳酸氢钠15g，以5%葡萄糖溶液稀释至1000ml。(二)血氨测定：1.直接显色法：（1）原理：血液经稀钨酸沉淀除去蛋白质，NH，仍留在上清液，经波氏显色反应测定含量。（2）试剂：无氨蒸馏水：在全玻璃蒸馏器中，加入蒸馏水2L，2mo1/L硫酸0.25ml及10g/L高锰酸钾2ml，蒸馏，将留出液体的起始及末尾约20ml弃去，收集中段蒸馏水。所用试剂均用无氨蒸馏水制备。②0.15mo1/L钨酸溶液：（1)0.3mo1/L钨酸钠溶液：称取钨酸钠（NazWO，0.MW329.86）10g，溶于无氨蒸馏水中，并稀释至100ml。（2）0.5mo1/L硫酸：取浓硫酸3.0ml加至97ml无氨蒸馏水中，混匀。（3）临用前，将0.3mo1/L钨酸钠与0.5mo1/L浓硫酸等体积混合。③显色剂1：称取酚5g及亚硝基铁氰化钠25mg，以无氨蒸馏水溶解，并稀释至500ml，置棕色瓶内，4～8℃避光保存，可长期稳定。④显色剂II：取氢氧化钠（AR）2.5g，磷酸氢二钠（NazHPO·12H20优级纯）26.8g及次氯酸钠溶液（含10%有效氯）5ml，用无氨蒸馏水溶解，并稀释至500ml，置塑料瓶内4～8℃避光保存，可长期稳定。100μmol/硫酸铵标准液：取10mmo1/L硫酸铵标准液，用无氨蒸馏水作100倍稀释
2.乙兔——肝叶假手术 + 肠腔推注复方 NH4CI 溶液：除肝叶不结扎外，其余操作、观 察、记录等步骤于甲兔相同。 3.丙兔——肝叶大部分结扎 + 肠腔推注复方 NaCI 溶液：操作、观察、记录等步骤于 甲兔相同，只是要以同样的速度向肠腔内推注复方NaCI溶液，待复方NaCI溶液的用量（ml/kg 体重）超过乙兔相应复方 NH4Cl 用量时，即可停止推注。 4.丁兔——肝大部结扎+ 注射复方谷氨酸钠溶液+ 肠腔推注复方 NH4CI 溶液：按 20ml/kg 体重计量从耳缘静脉缓慢注射复方谷氨酸钠溶液，再重复甲兔操作步骤，注意与甲 兔进行比较。 【注意事项】 (一)剪镰状韧带时勿损伤膈肌和血管，游离肝脏时动作宜轻以免肝叶破裂出血；结扎线 应结扎于肝叶根部避免拦腰勒破肝叶。操作过程应及时止血。 (二)各组肠腔推注药液的量和速度以及应间隔的时间要保持一致。 (三)十二指肠插管不要插向胃的方向；氯化铵溶液勿注入腹腔或胃腔内。 【思考与讨论】 (一)比较上述四组实验结果，找出它们的异同点，结合实验结果，分析总结氨在肝性脑 病发病机制中的作用。 (二)实验中引起血氨变化的原因是什么？临床上肝功能障碍的患者引起血氨增高的主 要原因和机制是什么？ (三)复方氯化铵溶液的主要成分有哪些？它们的主要作用是什么？ (四)在肝性脑病的治疗中，你认为可能有效治疗或缓解氨中毒的环节有哪些？请写出你 的具体方案。 附录： (一)溶液配制： 1．复方氯化铵溶液配制：氯化铵 25g，碳酸氢钠 15g，以 5%葡萄糖溶液稀释至 1000ml。 2．复方谷氨酸钠溶液配制：谷氨酸钠 25g，碳酸氢钠 15g，以 5%葡萄糖溶液稀释至 1000ml。 (二)血氨测定： 1. 直接显色法： （1）原理：血液经稀钨酸沉淀除去蛋白质，NH4 +仍留在上清液，经波氏显色反应测定含 量。 （2）试剂： ① 无氨蒸馏水：在全玻璃蒸馏器中，加入蒸馏水 2L,2mol/L 硫酸 0.25ml 及 10g/L 高 锰酸钾 2ml，蒸馏，将留出液体的起始及末尾约 20ml 弃去，收集中段蒸馏水。所用试剂均 用无氨蒸馏水制备。 ② 0.15mol/L 钨酸溶液：（1）0.3mol/L 钨酸钠溶液：称取钨酸钠（Na2WO4·H2O, MW329.86） 10g,溶于无氨蒸馏水中，并稀释至 100ml。（2）0.5mol/L 硫酸：取浓硫酸 3.0ml 加至 97ml 无氨蒸馏水中，混匀。（3）临用前，将 0.3mol/L 钨酸钠与 0.5mol/L 浓硫酸等体积混合。 ③ 显色剂Ⅰ：称取酚 5g 及亚硝基铁氰化钠 25mg，以无氨蒸馏水溶解，并稀释至 500ml， 置棕色瓶内，4～8℃避光保存，可长期稳定。 ④ 显色剂Ⅱ：取氢氧化钠（AR）2.5g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O 优级纯）26.8g 及次氯酸钠溶液（含 10%有效氯）5ml，用无氨蒸馏水溶解，并稀释至 500ml，置塑料瓶内， 4～8℃避光保存，可长期稳定。 ⑤ 100μmol/L 硫酸铵标准液：取 10 mmol/L 硫酸铵标准液，用无氨蒸馏水作 100 倍 稀释
（3）操作：①取10ml带盖离心管1支，置0.15mo1/L钨酸4ml，取血1ml立即加入钨酸溶液中，加盖，充分混合均匀，待液体完全变成褐色时，2500转/分，离心5分钟。②另取试管2支，各置0.15mol/L钨酸4ml，依次加无氨蒸馏水1ml（空白管），μ100mo1/L硫酸铵标准液1ml（标准管）。③另取试管3支，标明测定管、标准管和空白管，然后按下表进行操作。加入物（ml）测定管标准管空白管2.0无蛋白上清液标准混合液2. 0空白混合液2. 0显色剂I2.52.52.52. 52. 52. 5显色剂IⅡI加显色剂I和ⅡI时，需边加边混合，然后置37℃30分钟，用分光光度计，625nm波长，以空白管调零，读取各管吸光度。(1)计算：测定管吸光度X 100血氨μmol/L=标准管吸光度正常参考范围：血氨18～72Hmol/L（307～1226μg/L）附注：①本法所用器材必须用无氨蒸馏水冲洗，烘干后使用。②本法呈色后的溶液极为稳定。2.离子选择电极法：原理：新鲜血液中的NH经碱化后（与碱接触时间短）转变成气态氨（NHs）释放。氨能透过四氟乙烯薄膜扩散到电极的内溶液，改变内溶液的H浓度，直到膜两侧的分压达到平衡。根据氢气扩散平衡后的电极电势的变化来推算氢的浓度。此次法法具有较高的特异性和精确性。测定时需按仪器使用说明书所示进行操作。3.酶法：原理：血浆中氨与足量的α-酮戊二酸，NADH在谷氨酸脱氢酶（GLDH）作用下，a-酮戊二酸被还原氨基化，产生谷氨酸，NADH氧化成NAD，利用NADH在34Onm吸收峰吸光度的变化来测定氨基反应：GLDHa-酮戊二酸+NH+NADH谷氨酸+NAD+H,O此法增加了特异性而缩短了分析时间，反应中加入ADP可增加GLDH的稳定性并增加反应速度
（3）操作： ① 取 10ml 带盖离心管 1 支，置 0.15mol/L 钨酸 4ml，取血 1ml 立即加入钨酸溶液中， 加盖，充分混合均匀，待液体完全变成褐色时，2500 转/分，离心 5 分钟。 ② 另取试管 2 支，各置 0.15mol/L 钨酸 4ml，依次加无氨蒸馏水 1ml（空白管），μ 100mol/L 硫酸铵标准液 1ml（标准管）。 ③ 另取试管 3 支，标明测定管、标准管和空白管，然后按下表进行操作。 加入物（ml） 测定管 标准管 空白管 无蛋白上清液 2.0 —— —— 标准混合液 —— 2.0 —— 空白混合液 —— —— 2.0 显色剂 Ⅰ 2.5 2.5 2.5 显色剂 Ⅱ 2.5 2.5 2.5 加显色剂Ⅰ和Ⅱ时，需边加边混合，然后置 37℃ 30 分钟，用分光光度计，625nm 波 长，以空白管调零，读取各管吸光度。 (1) 计算： 测定管吸光度 血氨μmol/L = ———————— × 100 标准管吸光度 正常参考范围： 血氨 18 ～ 72 μmol/L （307 ～ 1226μg/L） 附注：① 本法所用器材必须用无氨蒸馏水冲洗，烘干后使用。② 本法呈色后的溶液 极为稳定。 2. 离子选择电极法： 原理：新鲜血液中的 NH4 + 经碱化后（与碱接触时间短）转变成气态氨（NH3）释放。氨 能透过四氟乙烯薄膜扩散到电极的内溶液，改变内溶液的 H + 浓度，直到膜两侧的分压达到 平衡。根据氨气扩散平衡后的电极电势的变化来推算氨的浓度。此次法法具有较高的特异性 和精确性。测定时需按仪器使用说明书所示进行操作。 3. 酶法： 原理：血浆中氨与足量的α-酮戊二酸，NADH 在谷氨酸脱氢酶（GLDH）作用下，α-酮 戊二酸被还原氨基化，产生谷氨酸，NADH 氧化成 NAD+ ，利用 NADH 在 340nm 吸收峰吸光度的 变化来测定氨基反应： GLDH α-酮戊二酸 + NH4 + + NADH 谷氨酸 + NAD+ + H2O 此法增加了特异性而缩短了分析时间，反应中加入 ADP 可增加 GLDH 的稳定性并增加反应速 度