第九章血清（浆）脂类及脂蛋白测定血清(浆)脂类简称血脂。其成分主要包括有甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂游离脂肪酸等，均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式存在于血液中，血浆脂蛋白根据密度不同分为高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoproteinLDL)、极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoproteinVLDL)、乳糜微粒(chylomicrons,CM)等；载脂蛋白是血浆脂蛋白的蛋白质部分，各类脂蛋白中均含有一种或几种不同的特异性载脂蛋白。血脂测定可及时地反映体内脂类代谢状况，也是临床常规分析的重要指标。在临床上，对这些成分的检测由来已久，就方法学而言有化学法、酶法、免疫化学比浊法、电泳法、超速离心法等。本章根据教学和临床实际需要，介绍一般常用的基础检测方法，并就方法学的优缺点、发展趋势进行简要评价。第一节血清甘油三酯的测定甘油三酯(triglyceride,TG)的测定分为化学法和酶法。化学法可使用正庚烷-异丙醇混合溶剂等从血清中抽提出甘油三酯，再经过皂化、氧化，由显色反应进行测定。乙酰丙酮显色法是目前常用的化学法。酶法测定甘油三酯具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工和自动化测定。实验48乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯【原理】血清甘油三酯经过正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提，用氢氧化钾皂化生成甘油，在过碘酸的作用下甘油被氧化为甲醛，当有铵离子存在时，甲醛和乙酰丙酮发生缩合反应生成带荧光的黄色物质即3，5-二乙酰-1，4二氢二甲基吡啶(Hantgsch反应)，反应液的颜色深浅与TG浓度成正比。【试剂】1.抽提液正庚烷(AR)和异丙醇(AR)以4：7(V/V)比例混合均匀。2.40mmol/LH2SO4溶液浓硫酸2.24ml(根据比重和百分含量而定)加蒸馏水稀释至1000 ml。3.皂化剂称取氢氧化钾6.0g溶于蒸馏水60ml中，再加异丙醇40ml，混匀后置棕色
1 第九章 血清（浆）脂类及脂蛋白测定 血清(浆)脂类简称血脂。其成分主要包括有甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂、 游离脂肪酸等，均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式存在于血液中，血浆脂蛋白根据密度不 同分为高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)、乳糜微粒(chylomicrons, CM)等； 载脂蛋白是血浆脂蛋白的蛋白质部分，各类脂蛋白中均含有一种或几种不同的特异性载脂蛋 白。血脂测定可及时地反映体内脂类代谢状况，也是临床常规分析的重要指标。在临床上， 对这些成分的检测由来已久，就方法学而言有化学法、酶法、免疫化学比浊法、电泳法、超 速离心法等。本章根据教学和临床实际需要，介绍一般常用的基础检测方法，并就方法学的 优缺点、发展趋势进行简要评价。 第一节 血清甘油三酯的测定 甘油三酯(triglyceride, TG)的测定分为化学法和酶法。化学法可使用正庚烷-异丙醇混合溶 剂等从血清中抽提出甘油三酯，再经过皂化、氧化，由显色反应进行测定。乙酰丙酮显色法 是目前常用的化学法。酶法测定甘油三酯具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用 于手工和自动化测定。 实验 48 乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯 【原理】 血清甘油三酯经过正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提，用氢氧化钾皂化生成甘油， 在过碘酸的作用下甘油被氧化为甲醛，当有铵离子存在时，甲醛和乙酰丙酮发生缩合反应生 成带荧光的黄色物质即 3，5-二乙酰-1，4-二氢二甲基吡啶(Hantgsch 反应)，反应液的颜色深 浅与 TG 浓度成正比。 【试剂】 1．抽提液 正庚烷(AR)和异丙醇(AR)以 4：7(V/V)比例混合均匀。 2．40 mmol/L H2SO4 溶液 浓硫酸 2.24 ml (根据比重和百分含量而定)加蒸馏水稀释至 1 000 ml。 3．皂化剂 称取氢氧化钾 6.0 g 溶于蒸馏水 60 ml 中，再加异丙醇 40 ml，混匀后置棕色
瓶中室温保存。4.氧化剂称取过碘酸钠65mg，溶于蒸馏水约50ml中，再加入无水醋酸铵7.7g，溶解后加冰醋酸6ml，最后加蒸馏水至100ml，置棕色瓶中室温保存。5.显色剂取乙酰丙酮0.4ml加到异丙醇100ml中，混匀后置棕色瓶室温保存。6.三油酸甘油酯标准液2.26mmol/L(200mg/d1）准确称取三油酸甘油酯(平均分子量：885.4)200mg，溶于抽提剂，以100ml容量瓶定容，分装后置4℃冰箱保存。【操作步骤】按表9-1依次加入各物质。表9-1乙酰丙酮显色法测定甘油三酯的操作步骤加入物空白管测定管标准管血清(ml)0.2 0.2.标准液(ml)-0.2蒸馏水(ml)2.5 2.5 2.5抽提剂(ml)0.5 0.540mmo/L H2SO4(ml)0.5边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，分别准确吸取上清液于另外3支试管中上清液(ml)0.3 0.3 0.3 1.01.0皂化剂(ml)1.0加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温5min，然后再分别加入下列试剂氧化剂(ml)1.01.01.01.0显色剂(ml)1.01.0加试剂后充分混匀各管，56℃水浴保温25min，取出冷却，用分光光度计比色，于415nm波长处，以空白管调零，测出各管的吸光度。【计算】测定管吸光度血清 TG(mmol/L)=X标准液浓度标准管吸光度【参考范围】血清TG正常范围：0.55~1.70mmol/L；临界阅值：2.30mmol/l：危险阅值：4.50mmol/L。2
2 瓶中室温保存。 4．氧化剂 称取过碘酸钠 65 mg，溶于蒸馏水约 50 ml 中，再加入无水醋酸铵 7.7 g，溶 解后加冰醋酸 6 ml，最后加蒸馏水至 100 ml，置棕色瓶中室温保存。 5．显色剂 取乙酰丙酮 0.4 ml 加到异丙醇 100 ml 中，混匀后置棕色瓶室温保存。 6．三油酸甘油酯标准液 2.26 mmol/L (200 mg/d1) 准确称取三油酸甘油酯(平均分子量： 885.4)200 mg，溶于抽提剂，以 100 ml 容量瓶定容，分装后置 4℃冰箱保存。 【操作步骤】 按表 9-1 依次加入各物质。 表 9-1 乙酰丙酮显色法测定甘油三酯的操作步骤 加入物 空白管 标准管 测定管 血清(ml) － － 0.2 标准液(ml) － 0.2 － 蒸馏水(ml) 0.2 － － 抽提剂(ml) 2.5 2.5 2.5 40mmol/L H2SO4(ml) 0.5 0.5 0.5 边加边摇，使之充分混匀，静置分层后， 分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中 上清液(ml) 0.3 0.3 0.3 皂化剂(ml) 1.0 1.0 1.0 加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温 5min， 然后再分别加入下列试剂 氧化剂(ml) 1.0 1.0 1.0 显色剂(ml) 1.0 1.0 1.0 加试剂后充分混匀各管，56℃水浴保温 25 min，取出冷却，用分光光度计比色，于 415 nm 波长处，以空白管调零，测出各管的吸光度。 【计算】 血清 TG(mmol/L)＝ 标准管吸光度 测定管吸光度 × 标准液浓度 【参考范围】 血清 TG 正常范围：0.55～1.70mmol/L；临界阈值：2.30mmol/l；危险阈 值：4.50mmol/L
【临床意义】1.血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗塞、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等2．血清TG降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等可引起血清TG的降低。【注意事项】1．血清TG易受饮食的影响，在进食脂肪后可以观察到血清中甘油三酯明显上升，2~4h内即可出现血清混浊，8h以后接近空腹水平。因此，要求空腹12h后再进行采血，并要求72h内不饮酒，否则会使检测结果偏高。2．显色后吸光度随时间延长会有一定量的增高，故加样后要立即比色，当标本过多时，可置冰箱中逐管进行比色3.本方法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空白值升高。4．皂化、氧化及显色的时间和温度对吸光度均会有影响，所以每测定一批都应该同时做标准对照。5.TG在12.93mmo/L以下时，线性关系良好，当血清明显混浊时，可用生理盐水作倍比稀释后再测。6.以血浆作标本时，还应注意抗凝剂的影响，通常使用EDTAK2(1mg/ml)作抗凝剂。7.无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞膜磷脂在磷胎酶的作用下产生游离甘油(free glycerol，FG)，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TG值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免TG自发水解出现误差。【评价】本方法测定范围较宽，在0.28～12.93mmol/L之间，具有良好的线性关系，回收率为100.4%～117.3%，批内变异系数为2.49%，批间变异系数为2.18%，符合临床检验方法学的要求。甘油被过碘酸氧化成甲醛的反应是非特异的，血清中磷脂、葡萄糖、游离甘油等也会被非特异地氧化，本实验方法中采用了分溶抽提，TG分配在正庚烷相中，而磷脂等则分配在异丙醇-水相中，提高了反应的特异性。实验 49磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯U
3 【临床意义】 1．血清 TG 增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、 急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗塞、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等。 2．血清 TG 降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和 消化吸收不良综合征等可引起血清 TG 的降低。 【注意事项】 1．血清 TG 易受饮食的影响，在进食脂肪后可以观察到血清中甘油三酯明显上升，2～ 4h 内即可出现血清混浊，8h 以后接近空腹水平。因此，要求空腹 12h 后再进行采血，并要求 72h 内不饮酒，否则会使检测结果偏高。 2．显色后吸光度随时间延长会有一定量的增高，故加样后要立即比色，当标本过多时， 可置冰箱中逐管进行比色。 3．本方法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空 白值升高。 4．皂化、氧化及显色的时间和温度对吸光度均会有影响，所以每测定一批都应该同时做 标准对照。 5．TG 在 12.93mmol/L 以下时，线性关系良好，当血清明显混浊时，可用生理盐水作倍 比稀释后再测。 6．以血浆作标本时，还应注意抗凝剂的影响，通常使用 EDTAK2(1 mg/ml)作抗凝剂。 7．无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞膜磷 脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油(free glycerol，FG)，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而 稀释血浆降低 TG 值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免 TG 自发 水解出现误差。 【评价】 本方法测定范围较宽，在 0.28～12.93 mmol/L 之间，具有良好的线性关系， 回收率为 100.4%～117.3%，批内变异系数为 2.49%，批间变异系数为 2.18%，符合临床检验 方法学的要求。 甘油被过碘酸氧化成甲醛的反应是非特异的，血清中磷脂、葡萄糖、游离甘油等也会被 非特异地氧化，本实验方法中采用了分溶抽提，TG 分配在正庚烷相中，而磷脂等则分配在异 丙醇-水相中，提高了反应的特异性。 实验 49 磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯
【原理】血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)作用，可以水解为甘油和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，甘油在ATP和甘油激酶(glycerokinase，GK)的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶(glycerophosphateoxidase，GPO)作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢(H2O2),H2O,与4-氨基安替比林(4-AAP)及4-氯酚在过氧化物酶(peroxidasePOD)作用下，生成红色醒类化合物，其显色程度与TG的浓度成正比。【试剂】1.甘油三酯液体稳定酶试剂组成(具体含量见相关文献)50mmol/LGOODs 缓冲液(pH7.2)脂蛋白脂酶≥4 000U/L甘油激酶≥40 U/L磷酸甘油氧化酶≥500 U/L过氧化物酶≥2 000U/LATP2.0mmol/L硫酸镁15mmol/L4-AAP0.4mmol/L4-氯酚4.0mmol/L2.三油酸甘油酯标准液2.26mmol/L（200mg/d1）准确称取三油酸甘油酯(平均分子量：885.4)200mg加TritonX-1005ml，用蒸馏水定容至100ml，分装后，4℃保存，切勿冰冻保存。【操作步骤】取3支试管按表9-2操作。GPO 法测定TG 操作步骤表9-2（空白管加入物标准管测定管血清(u)10标准液(μI)-10---蒸馏水(ul)10酶试剂(μl)1 00010001000混匀后37℃水浴5min，用分光光度计比色，以空白管调零，于500nm波长处测各管的吸光度。【计算】同实验48。【参考范围】同实验48
4 【原理】 血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)作用，可以水解为甘 油和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，甘油在 ATP 和甘油激酶(glycerokinase，GK)的作用下， 生成 3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶(glycerophosphate oxidase，GPO)作用氧化生成磷酸二 羟丙酮和过氧化氢(H2O2)，H2O2与 4-氨基安替比林(4-AAP)及 4-氯酚在过氧化物酶(peroxidase， POD)作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与 TG 的浓度成正比。 【试剂】 1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成(具体含量见相关文献) GOODs 缓冲液(pH7.2) 50mmol/L 脂蛋白脂酶 ≥4 000U/L 甘油激酶 ≥40 U/L 磷酸甘油氧化酶 ≥500 U/L 过氧化物酶 ≥2 000U/L ATP 2.0mmol/L 硫酸镁 15mmol/L 4-AAP 0.4mmol/L 4-氯酚 4.0mmol/L 2. 三油酸甘油酯标准液 2.26mmol/L (200mg/d1) 准确称取三油酸甘油酯(平均分子量： 885.4)200mg 加 Triton X-100 5ml，用蒸馏水定容至 100ml，分装后，4℃保存，切勿冰冻保存。 【操作步骤】 取 3 支试管按表 9-2 操作。 表 9-2 GPO 法测定 TG 操作步骤 加入物 空白管 标准管 测定管 血清(μl) － － 10 标准液(μl) － 10 － 蒸馏水(μl) 10 － － 酶试剂(μl) 1 000 1 000 1 000 混匀后 37℃水浴 5 min，用分光光度计比色，以空白管调零，于 500 nm 波长处测各管的 吸光度。 【计算】 同实验 48。 【参考范围】 同实验 48
【注意事项】1．本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对TG测定结果有一定的影响。2.方法中所用酶试剂在4℃避光保存，至少可稳定3天至1周，出现红色时不可再用，试剂空白的吸光度应≤0.05。3．取血前注意事项同实验48，标本4℃存放不宜超过3天，避免TG水解释放出甘油。4.本实验方法的线性上限为11.3mmol/L，若所测TG值超过了11.0mmol/L，则可用生理盐水稀释后再测。【评价】本实验介绍的是一步终点法，具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离的甘油。为了除去FG的干扰，常用的方法有两种：1.外空白法即同时使用不含LPL的酶试剂测定FG作空白值，此法需作双份测定，使成本加倍，但是可同时得到血清中FG数据；2．内空白法又称为两步法或双试剂法，将酶试剂分作两部分，其中LPL和4-AAP组成试剂II，其余部分为试剂1，血清先加试剂1，37℃孵育后，因无LPL存在，TG不被水解，FG在GK和GPO的作用下反应生成H2O2，但因不含4-AAP，不能完成显色反应，故可除去FG的干扰；再加入试剂I，即可测出TG水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步骤，但不增加试剂成本，且排除FG干扰效果好，预孵育5min即可排除4mmoI/LFG的干扰。本法线性范围在11.4mmol/L以内，精密度为：批内CV≤3%、批间CV≤5%。加入不同浓度TG，平均回收率98.6%，加入甘油的平均回收率103.6%。与乙酰丙酮法比较：y=0.996x一4.2,r=0.9996.因为LPL除水解TG外，亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占 TG 的3%），所以本法测定结果包含了后二者的值第二节血清胆固醇的测定血清中胆固醇包括CE和FC，在LDL中最多，其次是HDL和VLDL，CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。化学法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黄皂苷沉淀纯化；①显色、比色四个阶段。代表性的方法有Abell-Kendall法。目前临床上常用的是胆固醇氧化酶法
5 【注意事项】 1．本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对 TG 测定结果有一定的影响。 2．方法中所用酶试剂在 4℃避光保存，至少可稳定 3 天至 1 周，出现红色时不可再用， 试剂空白的吸光度应≤0.05。 3．取血前注意事项同实验 48，标本 4℃存放不宜超过 3 天，避免 TG 水解释放出甘油。 4．本实验方法的线性上限为 11.3 mmol/L，若所测 TG 值超过了 11.0mmol/L，则可用生 理盐水稀释后再测。 【评价】 本实验介绍的是一步终点法，具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点， 适用于手工和自动化测定；其主要缺点是所测 TG 值包括了血清中游离的甘油。为了除去 FG 的干扰，常用的方法有两种： 1．外空白法 即同时使用不含 LPL 的酶试剂测定 FG 作空白值，此法需作双份测定，使 成本加倍，但是可同时得到血清中 FG 数据； 2．内空白法 又称为两步法或双试剂法，将酶试剂分作两部分，其中 LPL 和 4-AAP 组 成试剂Ⅱ，其余部分为试剂Ⅰ，血清先加试剂Ⅰ，37℃孵育后，因无 LPL 存在，TG 不被水 解，FG 在 GK 和 GPO 的作用下反应生成 H2O2，但因不含 4-AAP，不能完成显色反应，故可 除去 FG 的干扰；再加入试剂Ⅱ，即可测出 TG 水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步 骤，但不增加试剂成本，且排除 FG 干扰效果好，预孵育 5 min 即可排除 4 mmol/L FG 的干扰。 本法线性范围在 11.4mmol/L 以内，精密度为：批内 CV≤3%、批间 CV≤5%。加入不同浓度 TG，平均回收率 98.6%，加入甘油的平均回收率 103.6%。与乙酰丙酮法比较：y＝0.996x－ 4.2，r＝0.9996。 因为 LPL 除水解 TG 外，亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占 TG 的 3%)，所以本法测定结果包含了后二者的值。 第二节 血清胆固醇的测定 血清中胆固醇包括 CE 和 FC，在 LDL 中最多，其次是 HDL 和 VLDL，CM 最少。血清 总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。化学法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黄 皂苷沉淀纯化；④显色、比色四个阶段。代表性的方法有 Abell-Kendall 法。目前临床上常用 的是胆固醇氧化酶法
实验50胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇【原理】血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)包括游离胆固醇(free cholesterol，FC)和胆固醇酯(cholesterolester，CE)两部分。血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA)，胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆笛烯酮和过氧化氢H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腺的红色醒类化合物，其颜色深浅与标本中TC含量成正比。【试剂】1．胆固醇液体酶试剂组成(具体含量见相关文献)GOOD's 缓冲液(pH6.7)50mmol/L胆固醇酯酶≥200U/L胆固醇氧化酶≥100U/L过氧化物酶≥3 000U/L4-AAP0.3mmol/L苯酚5mmol/L2.胆固醇标准溶液5.17mmol/L(200mg/dl）精确称取胆固醇200mg，用异丙醇配成100ml溶液，分装后，4℃保存，临用取出。也可用定值的参考血清作标准。【操作步骤】终点法检测TC按表9-3依次加样。表9-3酶法测定TC操作步骤加入物空白管标准管测定管血清(μl)1010/标准液或定值血清(μ)一10蒸馏水(μI)-10001 0001 000酶试剂(μl)混匀后，37℃保温5min，用分光光度计比色，于500m波长处以空白管调零，读出各管吸光度。【计算】测定管吸光度×胆固醇标准液浓度血清 TC (mmol/L)=标准管吸光度
6 实验 50 胆固醇氧化酶法测定血清总胆固醇 【原理】 血清中总胆固醇(total cholesterol，TC)包括游离胆固醇(free cholesterol，FC) 和胆固醇酯(cholesterol ester，CE)两部分。血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇 和游离脂肪酸(FFA)，胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢， H2O2 在 4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺非那腙的红色醌 类化合物，其颜色深浅与标本中 TC 含量成正比。 【试剂】 1．胆固醇液体酶试剂组成(具体含量见相关文献) GOOD's 缓冲液(pH6.7) 50mmol/L 胆固醇酯酶 ≥200U/L 胆固醇氧化酶 ≥100U/L 过氧化物酶 ≥3 000U/L 4-AAP 0.3mmol/L 苯酚 5mmol/L 2．胆固醇标准溶液 5.17 mmol/L (200 mg/dl) 精确称取胆固醇 200 mg，用异丙醇配成 100 ml 溶液，分装后，4℃保存，临用取出。也可用定值的参考血清作标准。 【操作步骤】 终点法检测 TC 按表 9-3 依次加样。 表 9-3 酶法测定 TC 操作步骤 加入物 空白管 标准管 测定管 血清(μl) － － 10 标准液或定值血清(μl) － 10 － 蒸馏水(μl) 10 － － 酶试剂(μl) 1 000 1 000 1 000 混匀后，37℃保温 5 min，用分光光度计比色，于 500 nm 波长处以空白管调零，读出各 管吸光度。 【计算】 血清 TC (mmol/L)＝ 标准管吸光度 测定管吸光度 ×胆固醇标准液浓度
【参考范围】血清参考值：3.0~5.20mmol/L；危险阈值：5.20~6.20mmol/L；高胆固醇血症：≥6.20mmol/L【临床意义】1.TC增高常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症(如家族性高胆固醇血症、家族性ApoB 缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等)、糖尿病、肾病综合征、总胆管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。2.TC 降低常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、肝脏疾病、严重感染、营养不良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性黄疽及慢性消耗性疾病，如癌症晚期等。【注意事项】1．试剂中酶的质量影响测定结果。2．若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。3.检测标本可为血清或者血浆(以肝素或EDTAK2抗凝)。【评价】本方法线性范围为≤19.38mmol/L(750mg/d1)。本方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测，也可作速率法检测。在终点法中血红蛋白高于2g/L时引起正干扰；胆红素高于0.1g/L时有明显负干扰；血中维生素C与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。但是在速率法中上述干扰物质影响较小。高TG血症对本法无明显影响。检测TC的血清(浆)标本密闭保存时，在4℃可稳定1周，一20℃可稳定半年以上。第三节血清(浆)脂蛋白的测定在脂蛋白中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，较难定量。由于其中的胆固醇含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)或极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)。实验51磷钨酸-镁沉淀法测定高密度脂蛋白-胆固醇7
7 【参考范围】 血清参考值：3.0～5.20 mmol/L；危险阈值：5.20～6.20 mmol/L；高胆固 醇血症：≥6.20 mmol/L。 【临床意义】 1．TC 增高 常见于动脉粥样硬化、原发性高脂血症(如家族性高胆固醇血症、家族性 ApoB 缺陷症、多源性高胆固醇血症、混合性高脂蛋白血症等)、糖尿病、肾病综合征、总胆 管阻塞、甲状腺功能减退、肥大性骨关节炎、老年性白内障和牛皮癣。 2．TC 降低 常见于低脂蛋白血症、贫血、败血症、甲状腺功能亢进、肝脏疾病、严重 感染、营养不良、肠道吸收不良和药物治疗过程中的溶血性黄疸及慢性消耗性疾病，如癌症 晚期等。 【注意事项】 1．试剂中酶的质量影响测定结果。 2．若需检测游离胆固醇浓度，将酶试剂成分中去掉胆固醇酯酶即可。 3．检测标本可为血清或者血浆(以肝素或 EDTAK2 抗凝)。 【评价】 本方法线性范围为≤19.38 mmol/L (750 mg/d1)。 本方法特异性好和灵敏度高，既可用于手工操作，也可自动化分析；既可作终点法检测， 也可作速率法检测。 在终点法中血红蛋白高于 2g/L 时引起正干扰；胆红素高于 0.1g/L 时有明显负干扰；血中 维生素 C 与甲基多巴浓度高于治疗水平时，会使结果降低。但是在速率法中上述干扰物质影 响较小。高 TG 血症对本法无明显影响。 检测 TC 的血清(浆)标本密闭保存时，在 4℃可稳定 1 周，－20℃可稳定半年以上。 第三节 血清(浆)脂蛋白的测定 在脂蛋白中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，较难定量。由于其中的胆固醇 含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定 HDL、LDL 或 VLDL 中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白 -胆固醇(LDL-C)或极低密度脂蛋白-胆固醇(VLDL-C)。 实验 51 磷钨酸-镁沉淀法测定高密度脂蛋白-胆固醇
测定血清HDL-C时，通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等，采用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL与其他脂蛋白分离开，然后测定HDL组分中胆固醇的含量。美国疾病控制与预防中心(CDC)测定HDL-C 的参考方法为超速离心法。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C检测方法学评价，但因需特殊仪器，对技术操作要求高，一般实验室难以开展。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。临床实验室测定HDL-C 的方法大致可分为以下三类。第一类为化学沉淀法。常用的沉淀剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如 Mg+、Ca2+、Mnr+)联合使用。最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的肝素-锰沉淀法(HM 法)，后多采用硫酸葡聚糖-Mg+(DS-Mg2+法)。欧洲则多采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。1995 年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C 测定的常规方法。但此类方法常因含ApoB的脂蛋白组份，沉淀不完全而导致结果假性偏高。第二类采用简便的磁珠DS-Mg2+分离法，省去了离心步骤，但需特殊装置和试剂而不适于推广应用。第三类为匀相测定法，即直接测定法。其特点为：标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到NCEP的分析目标，因此在短短的数年里迅速为临床实验室采用。本实验介绍磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C。【原理】用沉淀剂大分子多阴离子化合物(磷钨酸盐)与两价阳离子(镁离子)沉淀血清中的 LDL、VLDL和 Lp(a)后，上清液中只含有HDL，然后用酶法测定其中的胆固醇含量(与酶法测 TC 相同)。以 HDL 中的胆固醇含量(即 HDL-C)作为 HDL 的定量依据。【试剂】1.沉淀剂称取磷钨酸钠0.44g和氯化镁(MgCh·6H20)1.10g，均为AR，溶于蒸馏水80ml中，以1mmol/LNaOH调pH至6.15，再加蒸馏水定容至100ml，此试剂可稳定一年。2.酶试剂同实验50。3.参考血清使用低浓度胆固醇的定值血清，或将TC 测定用定值血清进行1:2或1:3稀释后再用。【操作步骤】取血清和沉淀剂各200ul，充分混匀，置室温放置10min后，3000 /min，离心15min，吸取上清液按表9-4进行操作。如果上清液混浊，则需再以转速10000r/min，离心15min。8
8 测定血清 HDL-C 时，通常需根据各种脂蛋白的密度、颗粒大小、电荷等，采用超速离心 法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将 HDL 与其他脂蛋白分离开，然后测定 HDL 组分 中胆固醇的含量。美国疾病控制与预防中心(CDC)测定 HDL-C 的参考方法为超速离心法。此 法主要用于靶值的确定及各种 HDL-C 检测方法学评价，但因需特殊仪器，对技术操作要求高， —般实验室难以开展。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较 少应用，多用于脂蛋白的研究。 临床实验室测定 HDL-C 的方法大致可分为以下三类。第一类为化学沉淀法．常用的沉淀 剂为多阴离子，如磷钨酸(PTA)、硫酸葡聚糖(DS)、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与 某些两价阳离子(如 Mg2+、Ca2+、Mn2+)联合使用。最早为美国国立卫生研究院(NIH)所采用的 肝紊-锰沉淀法(HM 法)，后多采用硫酸葡聚糖-Mg2+(DS-Mg2+法)。欧洲则多采用磷钨酸镁沉 淀法(PTA-Mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(PEG 法)。1995 年中华医学会检验分会曾在国内推荐 PTA-Mg2＋法作为 HDL-C 测定的常规方法。但此类方法常因含 ApoB 的脂蛋白组份，沉淀不 完全而导致结果假性偏高。第二类采用简便的磁珠 DS-Mg2+分离法，省去了离心步骤，但需 特殊装置和试剂而不适于推广应用。第三类为匀相测定法，即直接测定法。其特点为：标本 用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到 NCEP 的分析目标，因此在短短的数年里迅速为临床实验室采用。 本实验介绍磷钨酸-镁沉淀法测定 HDL-C。 【原理】 用沉淀剂大分子多阴离子化合物(磷钨酸盐)与两价阳离子(镁离子)沉淀血清中 的 LDL、VLDL 和 Lp(a)后，上清液中只含有 HDL，然后用酶法测定其中的胆固醇含量(与酶 法测 TC 相同)。以 HDL 中的胆固醇含量(即 HDL-C)作为 HDL 的定量依据。 【试剂】 1．沉淀剂 称取磷钨酸钠 0.44 g 和氯化镁 (MgCl2·6H2O) 1.10 g，均为 AR，溶于蒸馏 水 80 ml 中，以 1 mmol/L NaOH 调 pH 至 6.15，再加蒸馏水定容至 100 ml，此试剂可稳定一 年。 2．酶试剂 同实验 50。 3．参考血清 使用低浓度胆固醇的定值血清，或将 TC 测定用定值血清进行 1∶2 或 1∶ 3 稀释后再用。 【操作步骤】 取血清和沉淀剂各 200 μl，充分混匀，置室温放置 10 min 后，3 000 r/min， 离心 l5 min，吸取上清液按表 9-4 进行操作。如果上清液混浊，则需再以转速 10 000 r/min， 离心 15min
表9-4PTA-Mg++法测定TC操作表加入物测定管空白管标准管上清液(μI)5050定值血清(μI)--501-蒸馏水(ul)2 0002 0002.000酶试剂(ul)混匀各管后，37℃水浴5min，于波长500nm处以空白管调零，测定各管吸光度。【计算】=测定管吸光度×定值血清胆固醇浓度HDL-C (mmol/L)=标准管吸光度【参考范围】血清：0.9~2.0mmo/L;低于0.9mmol/L为临界危险值。【注意事项】1.血清在室温条件下，各类型脂蛋白之间还会发生脂质交换，游离的胆固醇也会不断酯化，所以要及时测定，否则应该冰冻保存，但是只能冰冻一次，解冻后应立即测定。2.离心过程中应该防止温度升高使沉淀不完全，室温应为15～25℃之间，且离心后应立即吸取上清液进行测定，否则结果会偏高。3．血清严重混浊时，可以将血清以生理盐水1:1稀释后再沉淀，测定值乘以稀释倍数即为实际值。【临床意义】HDL是一种抗动脉硬化的脂蛋白，是冠心病的保护因素，冠心病的发病率与血清HDL水平呈负相关，HDL-C低于0.9mmol/L是冠心病的危险因素，其增高被认为是冠心病的“负”危险因素。HDL-C下降多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬变等。高TG血症常伴有低HDL-C；肥胖者、吸烟者的HDL-C也常偏低，但饮酒和长期体力活动会使之升高。【评价】沉淀法根据沉淀剂的不同可有多种方法。常用的有(1）肝素-锰沉淀法、(2）硫酸葡聚糖-镁沉淀法、（3）聚乙二醇沉淀法、（4）磷钨酸-镁沉淀法等。采用PTA-Mg2+(磷钨酸-Mg2)法沉淀后，测定结果与DS-Mg2法较接近。本实验方法标本用量少，操作简便易行，结果稳定，高TG血清不影响沉淀剂的沉淀效果，沉淀效果好，且不干扰酶法分析。批内CV<1.87%，批间CV<2.93%。9
9 表 9-4 PTA-Mg2+法测定 TC 操作表 加入物 空白管 标准管 测定管 上清液(μl) － － 50 定值血清(μl) － 50 － 蒸馏水(μl) 50 － － 酶试剂(μl) 2 000 2 000 2 000 混匀各管后，37℃水浴 5 min，于波长 500 nm 处以空白管调零，测定各管吸光度。 【计算】 HDL-C (mmol/L)＝ 标准管吸光度 测定管吸光度 ×定值血清胆固醇浓度 【参考范围】 血清：0.9～2.0 mmol/L； 低于 0.9 mmol/L 为临界危险值。 【注意事项】 1．血清在室温条件下，各类型脂蛋白之间还会发生脂质交换，游离的胆固醇也会不断酯 化，所以要及时测定，否则应该冰冻保存，但是只能冰冻一次，解冻后应立即测定。 2. 离心过程中应该防止温度升高使沉淀不完全，室温应为 15～25℃之间，且离心后应立 即吸取上清液进行测定，否则结果会偏高。 3．血清严重混浊时，可以将血清以生理盐水 1∶1 稀释后再沉淀，测定值乘以稀释倍数 即为实际值。 【临床意义】 HDL 是一种抗动脉硬化的脂蛋白，是冠心病的保护因素，冠心病的发病 率与血清 HDL 水平呈负相关，HDL-C 低于 0.9 mmol/L 是冠心病的危险因素，其增高被认为 是冠心病的“负”危险因素。 HDL-C 下降多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬变等。 高 TG 血症常伴有低 HDL-C；肥胖者、吸烟者的 HDL-C 也常偏低，但饮酒和长期体力 活动会使之升高。 【评价】 沉淀法根据沉淀剂的不同可有多种方法。常用的有(1) 肝素-锰沉淀法、(2) 硫 酸葡聚糖-镁沉淀法、(3) 聚乙二醇沉淀法、(4) 磷钨酸-镁沉淀法等。采用 PTA-Mg2+(磷钨酸 -Mg2+)法沉淀后，测定结果与 DS-Mg2+法较接近。本实验方法标本用量少，操作简便易行， 结果稳定，高 TG 血清不影响沉淀剂的沉淀效果，沉淀效果好，且不干扰酶法分析。批内 CV ＜1.87%，批间 CV＜2.93%
本方法不足之处是对温度和pH改变很敏感，沉淀离心后放置时间不能过长，应于4h内立即检测，若放置过久会使结果偏高。附：过氧化物酶清除法测定高密度脂蛋白-胆固醇【原理】根据原理不同，直接测定法可分为：(1)清除法(clearance method);(2）免疫分离法（immunoseparationmethod，IS法)，IS法又可分为：①PEG/抗体包裹法、②抗体免疫分离法(antibodyimmunoseparation assay，AB法)：（3）选择性抑制法：（4)PEG修饰酶法(PEG-modifiedenzyme assay, PEGME 法)。本实验主要介绍清除法中的过氧化物酶清除法。其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加入试剂1，在反应促进剂(合成的多聚物/表面活性剂)的作用下，血清中CM、VLDL及LDL形成可溶性复合物，它们表层的游离胆固醇在胆固醇氧化酶的催化下发生反应生成H2O2，在过氧化物酶的作用下，HO2被清除。加入试剂2，在一种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有HDL颗粒成为可溶，所释放的胆固醇与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，生成HO2，并作用于4-AAP色原体产生颜色反应。其颜色的深浅与HDL-C 的含量成正比。【试剂】 过氧化物酶清除法测定 HDL-C 试剂盒的试剂组成见表9-5。表9-5过氧化物酶清除法测定HDL-C试剂盒的试剂组成组成初始浓度0.5 mmol/L试剂1：偶联剂DSBmT胆固醇氧化酶1.0 IU/ml3.0 U/ml 过氧化物酶缓冲液pH 6.0试剂2:4-AAP1.0 mmol/L胆固醇酯酶0.2 U/ml表面活性剂适量pH 6.0缓冲液试剂3:参考物【操作步骤】过氧化物酶清除法测定HDL-C操作步骤见表9-6。10
10 本方法不足之处是对温度和 pH 改变很敏感，沉淀离心后放置时间不能过长，应于 4h 内 立即检测，若放置过久会使结果偏高。 附：过氧化物酶清除法测定高密度脂蛋白-胆固醇 【原理】根据原理不同，直接测定法可分为： (1) 清除法(clearance method)； (2) 免疫分离法(immunoseparation method，IS 法)，IS 法又可分为：① PEG/抗体包裹法、②抗体免疫 分离法(antibody immunoseparation assay，AB 法)；(3) 选择性抑制法；(4) PEG 修饰酶法(PEG-modified enzyme assay，PEGME 法)。 本实验主要介绍清除法中的过氧化物酶清除法。其原理为利用脂蛋白与表面活性剂的亲和性差异。加 入试剂 1，在反应促进剂(合成的多聚物/表面活性剂)的作用下，血清中 CM、VLDL 及 LDL 形成可溶性复 合物，它们表层的游离胆固醇在胆固醇氧化酶的催化下发生反应生成 H2O2，在过氧化物酶的作用下，H2O2 被清除。加入试剂 2，在—种特殊的选择性表面活性剂作用下，只有 HDL 颗粒成为可溶，所释放的胆固醇 与胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶反应，生成 H2O2，并作用于 4-AAP 色原体产生颜色反应。其颜色的深浅与 HDL-C 的含量成正比。 【试剂】 过氧化物酶清除法测定 HDL-C 试剂盒的试剂组成见表 9-5。 表 9-5 过氧化物酶清除法测定 HDL-C 试剂盒的试剂组成 组成 初始浓度 试剂 1：偶联剂 DSBmT 0.5 mmol/L 胆固醇氧化酶 1.0 IU/ml 过氧化物酶 3.0 U/ml 缓冲液 pH 6.0 试剂 2：4-AAP 1.0 mmol/L 胆固醇酯酶 0.2 U/ml 表面活性剂 适量 缓冲液 pH 6.0 试剂 3： 参考物 【操作步骤】 过氧化物酶清除法测定 HDL-C 操作步骤见表 9-6