常用酶类测定第十四章第一节氧化还原酶类氧化还原酶能够催化氢氧原子或电子从一种底物转移到另一种底物上，它包括一大类酶如脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶以及加单氧酶等。目前临床诊断中常用的氧化还原酶主要有乳酸脱氢酶及其同工酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、铜蓝蛋白、单胺氧化酶和超氧化物歧化酶等。实验92连续监测法测定乳酸脱氢酶总活性(L-P反应法)乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LD)是糖酵解和糖异生的一个重要酶，含有锌离子，广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还原反应。乳酸+NAD+→丙酮酸+NADH+H+其中LP为正向反应，P→为逆向反应。正反两向反应的最适pH不同，其中正向反应最适pH为8.8~9.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和NAD+稳定性好，且NAD*纯品易得、价格较低，过量乳酸对LD活性的抑制较小，反应线性较好。缺点是需要较高的底物浓度，反应速度较慢。逆向反应的最适pH为7.4～7.8，与生理性pH相同。其显著的优点在于NADH用量少仅为正向反应的3%左右，而反应速度比前者约快3倍，灵敏度高。但丙酮酸于NADH的稳定性较差，过量的丙酮酸对LD活性的抑制作用较大。LD活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但1996年中华医学会检验学会酶学组专家推荐选择正向反应。LD催化下述反应：【原理】L-乳酸+NAD*L>丙酮酸+NADH+H*在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使NAD+还原为NADH。NADH在340nm处有吸收峰，因此反应会引起340nm吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中LD活性呈正比的关系。【试剂与器材】
1 第十四章 常用酶类测定 第一节 氧化还原酶类 氧化还原酶能够催化氢氧原子或电子从一种底物转移到另一种底物上，它包括一大类酶 如脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶以及加单氧酶等。目前临床诊断中常用的氧化还原酶主要有 乳酸脱氢酶及其同工酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、铜蓝蛋白、单胺氧化酶和超氧化物歧化酶等。 实验 92 连续监测法测定乳酸脱氢酶总活性(L-P 反应法) 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LD)是糖酵解和糖异生的一个重要酶，含有锌离子， 广泛分布于人和动物组织、植物和微生物中，能可逆地催化乳酸(L)和丙酮酸(P)之间的氧化还 原反应。 乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ 其中 L→P 为正向反应，P→为逆向反应。正反两向反应的最适 pH 不同，其中正向反应 最适 pH 为 8.8～9.8，偏碱，能使平衡偏向生成丙酮酸的方向。其优点是乳酸和 NAD+稳定性 好，且 NAD+纯品易得、价格较低，过量乳酸对 LD 活性的抑制较小，反应线性较好。缺点是 需要较高的底物浓度，反应速度较慢。 逆向反应的最适 pH 为 7.4～7.8，与生理性 pH 相同。其显著的优点在于 NADH 用量少， 仅为正向反应的 3%左右，而反应速度比前者约快 3 倍，灵敏度高。但丙酮酸于 NADH 的稳 定性较差，过量的丙酮酸对 LD 活性的抑制作用较大。 LD 活性测定时正向反应和逆向反应都可以运用，但 1996 年中华医学会检验学会酶学组 专家推荐选择正向反应。 【原理】 LD 催化下述反应： + + L− + NAD ⎯⎯→ + NADH + H 乳酸 LD 丙酮酸 在反应过程中，乳酸氧化生成丙酮酸，同时使 NAD+还原为 NADH。NADH 在 340nm 处 有吸收峰，因此反应会引起 340nm 吸光度的增高，并且吸光度增加的速率与样本中 LD 活性 呈正比的关系。 【试剂与器材】
1.Tris-乳酸锂缓冲液（含Tris52.5mmol/L，乳酸锂52.5mmol/L）称取Tris6.34g，乳酸锂5.04g，溶于约800ml蒸馏水中，置37℃水浴箱，使温度达到平衡后，在pH计下用1mol/L的HCI(约加入45ml)调节pH至8.9，再加入蒸馏水至1000ml，冰箱保存。2.底物应用液（含Tris52.5mmol/L，乳酸锂52.5mmol/L，NAD+6mmol/L，临用前现配）1mlTris-乳酸锂缓冲液加4.2mgNAD+的浓度比例配制。3．仪器以半自动生化分析仪为例。【操作步骤】1.血清稀释度血清50ul，加37℃预温的底物应用液1.0ml，立即吸入自动分析仪，此时血清稀释倍数为21。2．主要参数：系数337630s孵育时间连续检测时间60s波长340nm吸样量0.5ml温度37℃【计算】LD (U/L)=Mmin××0=4Amm ×3376式中，△A/min：平均每分钟吸光度增加值；6220:340nm处NADH的微摩尔吸光系数；1.05：比色液体总体积(ml)；0.05：血清用量(ml)。【参考范围】成人109~245U/L。【临床意义】LD活性增高主要见于心肌梗死、肺梗塞、病毒性肝炎、肝硬化、肾脏疾病、某些恶性肿瘤、白血病、以及非恶性疾病如传染性单核细胞增多症、贫血、肌营养不良、胰腺炎等，一些肿瘤转移所致的胸腹水中LD活性往往有升高。目前临床测定LD活性常用于心肌梗死、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。LD活性降低目前没有发现重要的临床意义。【注意事项】1.不同的LD同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于一20℃过夜，LD4和LDs会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般2～3d不会出现活性的丢失。如2
2 1．Tris-乳酸锂缓冲液(含 Tris 52.5mmol/L，乳酸锂 52.5mmol/L) 称取 Tris 6.34g，乳酸 锂 5.04g，溶于约 800ml 蒸馏水中，置 37℃水浴箱，使温度达到平衡后，在 pH 计下用 1mol/L 的 HCl(约加入 45ml)调节 pH 至 8.9，再加入蒸馏水至 1 000ml，冰箱保存。 2． 底物应用液(含 Tris 52.5mmol/L，乳酸锂 52.5mmol/L，NAD+ 6mmol/L，临用前现配) 1ml Tris-乳酸锂缓冲液加 4.2mg NAD+的浓度比例配制。 3．仪器以半自动生化分析仪为例。 【操作步骤】 1．血清稀释度 血清 50μl，加 37℃预温的底物应用液 1.0ml，立即吸入自动分析仪， 此时血清稀释倍数为 21。 2．主要参数： 系数 3 376 孵育时间 30s 连续检测时间 60s 波长 340nm 吸样量 0.5ml 温度 37℃ 【计算】 0.05 1.05 6220 106 min LD（U / L）= A 3376 min = ΔA 式中，△A/min：平均每分钟吸光度增加值；6220:340nm 处 NADH 的微摩尔吸光系数； 1.05：比色液体总体积(ml)；0.05：血清用量(ml)。 【参考范围】 成人 109～245 U/L。 【临床意义】 LD 活性增高主要见于心肌梗死、肺梗塞、病毒性肝炎、肝硬化、肾脏 疾病、某些恶性肿瘤、白血病、以及非恶性疾病如传染性单核细胞增多症、贫血、肌营养不 良、胰腺炎等，一些肿瘤转移所致的胸腹水中 LD 活性往往有升高。目前临床测定 LD 活性 常用于心肌梗死、肝病和恶性肿瘤的辅助诊断。 LD 活性降低目前没有发现重要的临床意义。 【注意事项】 1．不同的 LD 同工酶对温度的敏感性是不同的，组织提取液若放于－20℃过夜，LD4 和 LD5 会丧失全部的活性。血清标本应存放于室温下，一般 2～3d 不会出现活性的丢失。如
果血清标本需要存放较长时间，应加入10mg/ml的NAD+或3.1mg/ml的谷胱甘肽后于4℃保存。2.LD活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对LD测定的影响不同：草酸盐抗凝剂、EDTA能抑制LD活性，而肝素的影响不大，3.由于红细胞、血小板中含有大量的LDH，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标本时必须用3000r/min离心15min以除去血小板。4.LD活性能被疏基试剂所抑制，硼酸、丙二酸、草酸、以及EDTA都是竞争性抑制剂。【评价】1.LD广泛存在于人体各组织的细胞浆中，以肝、心肌、肾、骨骼肌、胰腺和肺含量最多。各组织、器官中酶活性是血清酶活性的1000倍，因此各种组织病变时可以释放LD入血，导致血清中酶活性的升高，特异性较差。2．本实验是根据正向反应(L-P)建立的连续监测法，其优点在于：乳酸盐与NAD+底物溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小，NAD较少被产物抑制。反应的线性范围较宽(726U/L)，重复性较好，精密度较高(LD为65U/L时日间CV%为5.8%，LD为149U/L时日间CV为3.2%)，特异性高(血清中存在的非LD的其它NAD+类氧化还原酶的内源性底物很少，加上样本被高度稀释，故这些酶的干扰作用可忽略不计)。实验93比色法测定乳酸脱氢酶总活性【原理】以NAD+为受氢体，乳酸脱氢酶(LD)催化L-乳酸脱氢，生成丙酮酸。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腺，后者在碱性的溶液中呈棕红色。其颜色的深浅与丙酮酸的浓度呈正比，由测得的丙酮酸含量计算出酶的活性。【试剂】1.底物缓冲液(pH8.8，含0.3mol/L乳酸锂）称取二乙醇胺2.1g，乳酸锂2.9g，加蒸馏水约80ml，用1mol/LHCI调节pH至8.8，加蒸馏水至100ml。2.11.3mmol/LNAD+溶液称取NAD+15mg(若含量为70%，则取21.4mg），溶于2ml蒸馏水中，4℃可保存至少2周。3.1mmol/L2,4-二硝基苯肼溶液取2,4-二硝基苯肼198mg，加10mol/L盐酸100ml,待溶解后加蒸馏水至IL。于棕色瓶中室温放置
3 果血清标本需要存放较长时间，应加入 10mg/ml 的 NAD+或 3.1mg/ml 的谷胱甘肽后于 4℃保 存。 2．LD 活性测定也可用抗凝血浆，但不同抗凝剂对 LD 测定的影响不同：草酸盐抗凝剂、 EDTA 能抑制 LD 活性，而肝素的影响不大。 3．由于红细胞、血小板中含有大量的 LDH，故严禁使用溶血标本。在采用血浆作为标 本时必须用 3 000r/min 离心 15min 以除去血小板。 4．LD 活性能被巯基试剂所抑制，硼酸、丙二酸、草酸、以及 EDTA 都是竞争性抑制 剂。 【评价】 1．LD 广泛存在于人体各组织的细胞浆中，以肝、心肌、肾、骨骼肌、胰腺和肺含量 最多。各组织、器官中酶活性是血清酶活性的 1 000 倍，因此各种组织病变时可以释放 LD 入 血，导致血清中酶活性的升高，特异性较差。 2．本实验是根据正向反应(L-P)建立的连续监测法，其优点在于：乳酸盐与 NAD+底物 溶液的稳定性较好，冰冻放置可稳定 6 个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的影响最小， NAD 较少被产物抑制。反应的线性范围较宽(726U/L)，重复性较好，精密度较高(LD 为 65U/L 时日间 CV%为 5.8%，LD 为 149U/L 时日间 CV 为 3.2%)，特异性高(血清中存在的非 LD 的 其它 NAD+类氧化还原酶的内源性底物很少，加上样本被高度稀释，故这些酶的干扰作用可 忽略不计)。 实验 93 比色法测定乳酸脱氢酶总活性 【原理】 以 NAD+为受氢体，乳酸脱氢酶(LD)催化 L-乳酸脱氢，生成丙酮酸。丙酮酸 与 2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性的溶液中呈棕红色。其颜色的深 浅与丙酮酸的浓度呈正比，由测得的丙酮酸含量计算出酶的活性。 【试剂】 1．底物缓冲液(pH 8.8 ，含 0.3mol/L 乳酸锂) 称取二乙醇胺 2.1 g，乳酸锂 2.9 g，加蒸 馏水约 80ml，用 1mol/L HCl 调节 pH 至 8.8，加蒸馏水至 100ml。 2．11.3mmol/L NAD+溶液 称取 NAD+ 15mg(若含量为 70%，则取 21.4mg)，溶于 2ml 蒸 馏水中，4℃可保存至少 2 周。 3．1mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液 取 2,4-二硝基苯肼 198mg，加 10mol/L 盐酸 100ml， 待溶解后加蒸馏水至 1L。于棕色瓶中室温放置
4. 0.4mol/L NaOH。5.0.5mmol/L丙酮酸标准液(临用前配制）准确称取丙酮酸钠(AR)11mg，以底物缓冲液溶解后，移入200ml容量瓶中，用底物缓冲液定容至刻度。【操作步骤】1．校正曲线的制作按表14-1操作。2.表14-1校正曲线的制作加入物(ml)B23451丙酮酸标准液0.0250.050.100.150.200底物缓冲液0.50.4750.450.400.350.30蒸馏水0.110.110.110.11 0.110.112,4-二硝基苯肼溶液0.500.500.500.500.500.5037℃水浴15min0.4mol/L NaOH 5.05.05.05.05.05.01252505007501 000相当于LD活性(金氏)单位0室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用B管调零，读取各管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。3.酶活性的测定按表14-2操作。表14-2LD 酶活性的测定加入物(ml)测定管对照管血清0.010.01NAD+底物缓冲液0.500.5037℃水浴15minNAD+溶液0.1-37℃水浴15min2,4二硝基苯肼溶液0.50.5-0.1 NAD+溶液37℃水浴15min5.00.4mol/L NaOH5.04
4 4．0.4mol/L NaOH。 5．0.5mmol/L 丙酮酸标准液(临用前配制) 准确称取丙酮酸钠(AR)11mg，以底物缓冲液 溶解后，移入 200ml 容量瓶中，用底物缓冲液定容至刻度。 【操作步骤】 1．校正曲线的制作 按表 14-1 操作。 2． 表 14-1 校正曲线的制作 加入物(ml) B 1 2 3 4 5 丙酮酸标准液 0 0.025 0.05 0.10 0.15 0.20 底物缓冲液 0.5 0.475 0.45 0.40 0.35 0.30 蒸馏水 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 0.11 2,4-二硝基苯肼溶液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 37℃水浴 15min 0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 相当于 LD 活性(金氏)单位 0 125 250 500 750 1 000 室温放置 5min 后，于 440nm 波长处比色，比色杯光径为 1.0cm，用 B 管调零，读取各 管吸光度。以吸光度值为纵坐标，相应的酶活性单位为横坐标绘制校正曲线。 3．酶活性的测定 按表 14-2 操作。 表 14-2 LD 酶活性的测定 加入物(ml) 测定管 对照管 血 清 0.01 0.01 NAD+底物缓冲液 0.50 0.50 37℃水浴 15min NAD+溶液 0.1 － 37℃水浴 15min 2,4-二硝基苯肼溶液 0.5 0.5 NAD+溶液 － 0.1 37℃水浴 15min 0.4mol/L NaOH 5.0 5.0
混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm，用蒸馏水调零读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。单位定义以100ml血清，37℃，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为一个金氏单位【参考范围】190~437金氏单位【注意事项】1．乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可以作为LD的底物，但后两种为水溶液，若保存不当容易产生酮酸类物质从而抑制酶促反应，且含量不够准确，目前少用。而乳酸锂为固体，稳定、易称量。2．除用二乙醇胺缓冲液外，还可用Tris或焦磷酸缓冲液。而甘氨酸对LD有抑制作用故不采用甘氨酸缓冲液。3.标本严禁溶血，也不采用草酸盐、EDTA抗凝血浆。由于LD4、LDs对冷不稳定，不应存于冰箱中，血清标本室温可存放2~3d。4.比色应在5～15min内完成，否则吸光度值会降低。【评价】LD活性测定多采用乳酸生成丙酮酸的反应方向，但反应开始的转化速率是不成线性的。反应速率与温度有关，温度越高，速度越快。以2,4-二硝基苯肼作为底物测定酶活性所得结果不精确。实验94琼脂糖电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶LD广泛存在于人体各组织的细胞浆中，总活性的测定缺乏组织器官特异性，临床应用有限。而其同工酶的测定具有器官特异性和更高的灵敏度。因此目前除总活性测定外，还结合LD同工酶的测定来提高LD测定的临床应用价值。LD在体内共有5种同工酶形式，每个酶分子由不同数量的H和M亚基共4条多肽链构成，各组织所含的主要同工酶有差异。血清LD同工酶可用多种方法进行分离测定，包括：①电泳法；②免疫化学法；③层析法；④热稳定和抑制法。电泳法分离LD同工酶使用的支持介质包括琼脂糖凝胶和醋酸纤维薄膜、聚丙烯酰胺凝胶等。琼脂糖凝胶电泳法灵敏度高易于定量分析，由阳极至阴极分别为：LDI、LD2、LD3、LD4和LDs。电泳结束后可用光密度计扫描、比色法和荧光法测定每种同工酶的相对含量。【原理】LD各同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：以乳酸钠作为底物，LD催化乳酸脱氢生成丙
5 混匀，室温放置 5min 后，于 440nm 波长处比色，比色杯光径为 1.0cm，用蒸馏水调零， 读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查校正曲线，得酶活性。 单位定义 以 100ml 血清，37℃，作用底物 15min，产生 1μmol 丙酮酸为一个金氏单位。 【参考范围】 190～437 金氏单位 【注意事项】 1．乳酸锂、乳酸钾、乳酸钠都可以作为 LD 的底物，但后两种为水溶液，若保存不当容 易产生酮酸类物质从而抑制酶促反应，且含量不够准确，目前少用。而乳酸锂为固体，稳定、 易称量。 2．除用二乙醇胺缓冲液外，还可用 Tris 或焦磷酸缓冲液。而甘氨酸对 LD 有抑制作用， 故不采用甘氨酸缓冲液。 3．标本严禁溶血，也不采用草酸盐、EDTA 抗凝血浆。由于 LD4、LD5 对冷不稳定，不 应贮存于冰箱中，血清标本室温可存放 2～3d。 4．比色应在 5～15min 内完成，否则吸光度值会降低。 【评价】 LD 活性测定多采用乳酸生成丙酮酸的反应方向，但反应开始的转化速率是 不成线性的。反应速率与温度有关，温度越高，速度越快。以 2,4-二硝基苯肼作为底物测定 酶活性所得结果不精确。 实验 94 琼脂糖电泳法测定乳酸脱氢酶同工酶 LD 广泛存在于人体各组织的细胞浆中，总活性的测定缺乏组织器官特异性，临床应用 有限。而其同工酶的测定具有器官特异性和更高的灵敏度。因此目前除总活性测定外，还结 合 LD 同工酶的测定来提高 LD 测定的临床应用价值。 LD 在体内共有 5 种同工酶形式，每个酶分子由不同数量的 H 和 M 亚基共 4 条多肽链构 成，各组织所含的主要同工酶有差异。血清 LD 同工酶可用多种方法进行分离测定，包括： ①电泳法；②免疫化学法；③层析法；④热稳定和抑制法。电泳法分离 LD 同工酶使用的支 持介质包括琼脂糖凝胶和醋酸纤维薄膜、聚丙烯酰胺凝胶等。琼脂糖凝胶电泳法灵敏度高， 易于定量分析，由阳极至阴极分别为：LD1、LD2、LD3、LD4 和 LD5。电泳结束后可用光密 度计扫描、比色法和荧光法测定每种同工酶的相对含量。 【原理】 LD 各同工酶的一级结构和等电点不同，在一定的电泳条件下，使其在支持 介质上分离。然后利用酶的催化反应进行显色：以乳酸钠作为底物，LD 催化乳酸脱氢生成丙
酮酸，同时使 NAD+还原为 NADH。盼嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将 NADH 的氢传递给氯化碘代硝基四唑蓝(INT)，使其还原为紫红色的甲化合物。有LD活性的区带就会显紫红色，且颜色的深浅与酶活性呈正比，利用光密度仪或扫描仪可求出各同工酶的相对含量【试剂】1.巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.075）称取巴比妥钠15.458g，巴比妥2.768g，溶解于蒸馏水中，加热助溶，冷却后定容至IL(用于电泳）。2.0.082mol/L巴比妥-盐酸缓冲液(pH8.2）称取巴比妥钠17.0g，溶解于蒸馏水中，加1mol/L盐酸24.6ml，蒸馏水定容至1L（用于凝胶配制）3.10mmol/L乙二胺四乙酸二钠称取EDTA-Na2372mg，溶解于蒸馏水中，并定容至100ml。4.5g/L缓冲琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.5g，加入50mlpH8.2的巴比妥-盐酸缓冲液中再加入EDTANaz2溶液1.2ml，以及蒸馏水48.8ml，隔水煮沸溶解，不时摇匀，热分装到大试管中，冷后用塑料膜密封管口置冰箱备用。称取琼脂糖0.8g，加入50mlpH8.2巴比妥-盐酸缓冲液中，5.8g/L缓冲琼脂糖凝胶再加入EDTA-Na2溶液2ml，以及蒸馏水48ml，配制方法同实际试剂4。6.显色试剂(1)D-L-乳酸溶液：取85%乳酸(AR)2ml，用1mol/LNaOH调pH至中性(约用23.6ml)。(2)1g/L吩嗪二甲酯硫酸盐(LPMS)：称取50mgPMS，加蒸馏水50ml溶解。(3)10g/LNAD+：称取100mgNAD+溶解于10ml新鲜蒸馏水中。(4)1g/L氯化碘代硝基四唑蓝(INT)：称取30mgINT，溶解于30ml蒸馏水中。上述试剂需要贮存于棕色瓶中，置4℃保存。除10g/LNAD+外，其余均可保存3个月以上。(5）底物-显色液(临用前配制)：取上述各试剂按下列比例混合而成。取①液4.5ml；②液1.2ml；③液4.5ml(或NAD+45mg溶解于4.5ml蒸馏水中）；①液12.0ml。将上述4液混匀，共22.2ml。7.固定漂洗液按乙醇：水：冰醋酸=14：5：1(V/N/V)的比例混合，或按95%乙醇冰醋酸=98：2的比例混合而成。【操作步骤】1.制备琼脂糖凝胶玻片取冰箱保存的5g/L缓冲琼脂糖凝胶一管，置沸水浴中加热融化。用吸管吸取已融化的凝胶液约1.2ml，均匀铺在干净的7.5cm×2.5cm玻片上，冷却凝固后，于凝胶板阴极端约1~1.5cm处挖槽，滤纸吸干槽内水分。8
6 酮酸，同时使 NAD+还原为 NADH。吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)将 NADH 的氢传递给氯化碘代 硝基四唑蓝(INT)，使其还原为紫红色的甲臢化合物。有 LD 活性的区带就会显紫红色，且颜 色的深浅与酶活性呈正比，利用光密度仪或扫描仪可求出各同工酶的相对含量。 【试剂】 1．巴比妥缓冲液(pH 8.6，离子强度 0.075) 称取巴比妥钠 15.458 g，巴比妥 2.768 g，溶 解于蒸馏水中，加热助溶，冷却后定容至 1L (用于电泳) 。 2．0.082mol/L 巴比妥-盐酸缓冲液(pH 8.2) 称取巴比妥钠 17.0 g，溶解于蒸馏水中，加 1mol/L 盐酸 24.6ml，蒸馏水定容至 1L (用于凝胶配制) 。 3．10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠 称取 EDTA·Na2 372mg，溶解于蒸馏水中，并定容至 100ml。 4．5g/L 缓冲琼脂糖凝胶 称取琼脂糖 0.5g，加入 50ml pH 8.2 的巴比妥-盐酸缓冲液中， 再加入 EDTA·Na2 溶液 1.2ml，以及蒸馏水 48.8ml，隔水煮沸溶解，不时摇匀，趁热分装到 大试管中，冷后用塑料膜密封管口置冰箱备用。 5．8g/L 缓冲琼脂糖凝胶 称取琼脂糖 0.8g，加入 50ml pH 8.2 巴比妥-盐酸缓冲液中， 再加入 EDTA·Na2 溶液 2ml ，以及蒸馏水 48ml，配制方法同实际试剂 4。 6．显色试剂 (1) D-L-乳酸溶液：取 85%乳酸(AR)2ml，用 1mol/L NaOH 调 pH 至中性(约用 23.6ml)。 (2) 1 g/L 吩嗪二甲酯硫酸盐(LPMS)：称取 50mg PMS，加蒸馏水 50ml 溶解。 (3) 10g/L NAD+ ：称取 100mg NAD+溶解于 10ml 新鲜蒸馏水中。 (4) 1 g/L 氯化碘代硝基四唑蓝(INT)：称取 30mg INT，溶解于 30ml 蒸馏水中。 上述试剂需要贮存于棕色瓶中，置 4℃保存。除 10g/L NAD+外，其余均可保存 3 个月以 上。 (5) 底物-显色液(临用前配制)：取上述各试剂按下列比例混合而成。 取①液 4.5ml；②液 1.2ml；③液 4.5ml(或 NAD+ 45mg 溶解于 4.5ml 蒸馏水中)；④液 12.0ml。将上述 4 液混匀，共 22.2ml。 7．固定漂洗液 按乙醇：水：冰醋酸＝14：5：1(V/V/V)的比例混合，或按 95%乙醇： 冰醋酸＝98：2 的比例混合而成。 【操作步骤】 1．制备琼脂糖凝胶玻片 取冰箱保存的 5g/L 缓冲琼脂糖凝胶一管，置沸水浴中加热融 化。用吸管吸取已融化的凝胶液约 1.2ml，均匀铺在干净的 7.5cm×2.5cm 玻片上，冷却凝固 后，于凝胶板阴极端约 1～1.5cm 处挖槽，滤纸吸干槽内水分
2．加样用微量加样器加约40u1血清于槽内。3.电泳电压75~100V，电流8~10mA/片，电泳30~40min，待清蛋白部分泳动3~4cm即可。色在电泳结束前5~10min，将底物显色液与沸水浴融化的8g/L缓冲琼脂糖凝胶4.显色按4:5的比例混合，制成显色凝胶液，置50℃热水中备用，注意避光终止电泳后，取下凝胶玻片，置于铝盒内，立即用滴管吸取显色凝胶约1.2ml，迅速滴加在凝胶玻片上，使其自然展开覆盖全片，待显色凝胶凝固后，加盖避光，铝盒在37℃水浴中浮于水面保温1h。5．固定和漂洗取出显色的凝胶玻片，浸入固定漂洗液中20~40min，直至背景无黄色为止，再于蒸馏水漂洗多次，每次10~15min。【结果观察】1.目视观察根据在碱性介质中LD同工酶由负极向正极泳动速率递减的顺序，电泳条带由正极到负极依次为：LD(H4)、LD2(H:M)、LD:(H2M2)、LD4(HM)和LD;(M4)。按各区带呈色的深浅，比较LD各同工酶区带呈色强度的关系。正常人LD同工酶电泳图象上呈色深浅关系为LD2>LDi>LD;>LD4>LD5。LDs显色很浅。2．光密度计扫描求相对百分率用光密度计在570nm波长下扫描，求出各同工酶区带吸光度所占百分比。3.在不具备光密度计条件下，如果需要进行定量，可将各区带切开，分别装入试管中，加入400g/L尿素4ml，于沸水浴中加温5~10min，取出冷却后以570nm波长比色。空白管取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。比色后根据各管吸光度计算各同工酶的百分率。【计算】吸光度总和Aa=A1+A2+A3+A4+As式中，Ai～As为各同工酶区带的吸光度。各同工酶百分率(%)为：LD(%)=4×100LD:(%)= 4×100LD,(%)= 4×100Aa
7 2．加样 用微量加样器加约 40μl 血清于槽内。 3．电泳 电压 75～100V，电流 8～10mA/片，电泳 30～40min，待清蛋白部分泳动 3～ 4cm 即可。 4．显色 在电泳结束前 5～10min，将底物显色液与沸水浴融化的 8g/L 缓冲琼脂糖凝胶 按 4:5 的比例混合，制成显色凝胶液，置 50℃热水中备用，注意避光。 终止电泳后，取下凝胶玻片，置于铝盒内，立即用滴管吸取显色凝胶约 1.2ml，迅速滴 加在凝胶玻片上，使其自然展开覆盖全片，待显色凝胶凝固后，加盖避光，铝盒在 37℃水浴 中浮于水面保温 1 h。 5．固定和漂洗 取出显色的凝胶玻片，浸入固定漂洗液中 20～40min，直至背景无黄色 为止，再于蒸馏水漂洗多次，每次 10～15min。 【结果观察】 1．目视观察 根据在碱性介质中 LD 同工酶由负极向正极泳动速率递减的顺序，电泳条 带由正极到负极依次为：LD1(H4)、LD2(H3M)、LD3(H2M2)、LD4(HM3)和 LD5(M4)。 按各区带呈色的深浅，比较 LD 各同工酶区带呈色强度的关系。正常人 LD 同工酶电泳 图象上呈色深浅关系为 LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。LD5显色很浅。 2．光密度计扫描求相对百分率 用光密度计在 570nm 波长下扫描，求出各同工酶区带 吸光度所占百分比。 3．在不具备光密度计条件下，如果需要进行定量，可将各区带切开，分别装入试管中， 加入 400 g/L 尿素 4ml，于沸水浴中加温 5～10min，取出冷却后以 570nm 波长比色。空白管 取大小相同但无同工酶区带的凝胶，用上述相同的方法处理。比色后根据各管吸光度计算各 同工酶的百分率。 【计算】 吸光度总和 A 总＝A1+A2+A3+A4+A5 式中，A1～A5 为各同工酶区带的吸光度。 各同工酶百分率(%)为： % 100 1 1 = 总 （ ） A A LD % 100 2 2 = 总 （ ） A A LDLD % 100 3 3 = 总 （ ） A A
)=4×100LD(%) =AeLD,(%) = 4 ×100【参考范围】各实验室对正常人LD同工酶琼脂糖电泳结果的报告不一致，建议根据各实验室条件自行测定。但大多数学者认为健康成年人血清中LD同工酶百分比有下述规律：LD2>LDi>LD3>LD4>LD5.【临床意义】按照LD同工酶的分布可将组织分为3类：①以LDI1为主，这类组织以心肌为代表，其中LDI占组织LD总活性的一半以上，肾、胰、隔肌、红细胞次之；②以LDs为主，这类组织以肝脏为代表，LDs占组织LD总活性50%以上。皮肤、骨髓、关节滑液、白细胞、血小板、胆汁次之；③以LD3为主，以肺、脾为代表，脑、肠、淋巴液、内分泌腺次之。当组织损伤时，其中所含的同工酶就释放到血液中，引起同工酶活性的变化，因此，测定血清中各同工酶的相对活性有助于鉴别诊断相应的病变组织。电泳同工酶分析在临床上常用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时LDI与LD2活性均升高，但LDI升高更早、更明显，导致LDi/LD2比值增大，但溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清LDI和 LD2的活性也可增高。肝炎、急性肝细胞损伤、心肌梗死并发充血性心力衰竭时LDs增高。急性肺损伤、白血病、胶原病、心包炎以及病毒感染时LD2和 LD3会增高。胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种LD同工酶均可升高，但以LD:增高最为显著。骨骼肌损伤时 LD4和 LDs都会增高。【注意事项】1.红细胞中LDi与LD2活性很高，因此标本严禁溶血。2.LD4与LDs(尤其是LDs)对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过50℃，否则易变性失活。3.LD4和LDs对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于25℃条件下保存，一般可保存2～3d。4.PMS对光敏感，故底物-显色液须避光，否则显色后凝胶板背景颜色较深。5.可用0.5~1.0mol/L的乳酸锂溶液(pH7.0)代替上述乳酸钠溶液。乳酸锂化学性质稳定易称量，还可避免乳酸钠长期放置后产生的酮类物质对酶促反应造成的抑制作用。【评价】琼脂糖电泳是目前进行LD同工酶分离的常用方法，操作简便、重复性好标本用量少，适合于临床实验室采用，但明显的溶血会导致假阳性，另外标本量较大会很费18
8 % 100 4 4 = 总 （ ） A A LD (%) 100 5 5 = A总 A LD 【参考范围】 各实验室对正常人 LD 同工酶琼脂糖电泳结果的报告不一致，建议根据 各实验室条件自行测定。但大多数学者认为健康成年人血清中 LD 同工酶百分比有下述规律： LD2＞LD1＞LD3＞LD4＞LD5。 【临床意义】 按照 LD 同工酶的分布可将组织分为 3 类：①以 LD1 为主，这类组织以 心肌为代表，其中 LD1 占组织 LD 总活性的一半以上，肾、胰、膈肌、红细胞次之；②以 LD5 为主，这类组织以肝脏为代表，LD5 占组织 LD 总活性 50%以上。皮肤、骨髓、关节滑液、 白细胞、血小板、胆汁次之；③以 LD3 为主，以肺、脾为代表，脑、肠、淋巴液、内分泌腺 次之。 当组织损伤时，其中所含的同工酶就释放到血液中，引起同工酶活性的变化，因此，测 定血清中各同工酶的相对活性有助于鉴别诊断相应的病变组织。电泳同工酶分析在临床上常 用于急性心肌梗死的诊断，在急性心肌梗死时 LD1 与 LD2 活性均升高，但 LD1 升高更早、更 明显，导致 LD1/LD2 比值增大，但溶血性疾病、幼红细胞贫血症、肾坏死、以及假性肥大性 肌营养不良、活动性风湿性心肌炎、急性病毒性心肌炎患者血清 LD1 和 LD2 的活性也可增高。 肝炎、急性肝细胞损伤、心肌梗死并发充血性心力衰竭时 LD5 增高。急性肺损伤、白血病、 胶原病、心包炎以及病毒感染时 LD2 和 LD3 会增高。胃癌、结肠癌和胰腺癌患者血清中五种 LD 同工酶均可升高，但以 LD3 增高最为显著。骨骼肌损伤时 LD4和 LD5都会增高。 【注意事项】 1．红细胞中 LD1 与 LD2 活性很高，因此标本严禁溶血。 2．LD4 与 LD5(尤其是 LD5)对热很敏感，因此底物-显色液的温度不能超过 50℃，否则易 变性失活。 3．LD4 和 LD5 对冷不稳定，容易失活，应采用新鲜标本测定。如果需要，血清应放置于 25℃条件下保存，一般可保存 2～3d。 4．PMS 对光敏感，故底物-显色液须避光，否则显色后凝胶板背景颜色较深。 5．可用 0.5～1.0mol/L 的乳酸锂溶液(pH 7.0)代替上述乳酸钠溶液。乳酸锂化学性质稳定， 易称量，还可避免乳酸钠长期放置后产生的酮类物质对酶促反应造成的抑制作用。 【评价】 琼脂糖电泳是目前进行 LD 同工酶分离的常用方法，操作简便、重复性好、 标本用量少，适合于临床实验室采用，但明显的溶血会导致假阳性，另外标本量较大会很费
时。实验95连续监测法测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase，G-6-PD)是磷酸戊糖氧化途径的关键酶，广泛分布于各种细胞的胞核和胞浆中，其中以红细胞中含量最为丰富，小量存在于肝、肾、心和骨骼肌中，正常情况下血清仅有少量。可用比色法和连续监测法测定其总活性，也可用电泳法测定其同工酶的活性。【原理】红细胞中G-6-PD能催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)脱氢生成6-磷酸葡萄糖-8-内酯后者很快氧化成6-磷酸葡萄糖酸(6-PGA)，同时将NADP+还原为NADPH。在340nm波长下监测NADPH的生成量，即可反映红细胞中G-6-PD的活性另外红细胞中还含有6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)，能够催化6-磷酸葡萄糖酸脱羧，生成核酮糖-5-磷酸(R-5-P)，同时可使NADP+还原成NADPH。因此，由6-PGA和G6P组成的底物系统所测得的活性，应减去单独6-PGA底物测得的酶的活性，才代表了真正的G-6-PD活性。【试剂】1.6mmol/L葡萄糖-6-磷酸二钠(G6P）称取葡萄糖-6-磷酸二钠21.5mg，加10ml蒸馏水溶解。2.2mmol/LNADP+(临用前配制）称取NADP+10mg，加6.5ml蒸馏水溶解。3.0.1mol/LMgCl2称取MgClz-6H205.08g，蒸馏水溶解并定容至250ml。4.Tris-HCI-EDTA缓冲液(pH8.0,Tris-HCI1mol/L，EDTA5mmol/L)称取30.25gTrisEDTA-Na20.42g(或EDTA-Na2-2H200.465g），加蒸馏水约200ml，溶解，用5mol/LHCI调节pH至8.0(25℃)最后用蒸馏水定容至250ml。5.6mmol/L6-磷酸葡萄糖酸三钠(6-PGA）称取6-PGANa320.6mg，加蒸馏水10ml溶解。上述试剂可于一20℃存放数月。【操作步骤】1.溶血液制备新鲜抗凝血离心去上清液及白细胞层，用生理盐水洗涤2次，加生理盐水使压积细胞约为30%。将此红细胞悬液置冰水浴备用。用时以蒸馏水稀释25倍，即为溶血液。用氰化血红蛋白法测定溶血液中血红蛋白浓度。2.酶活性的测定按表14-3操作
9 时。 实验 95 连续监测法测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-PD)是磷酸戊糖氧化途径 的关键酶，广泛分布于各种细胞的胞核和胞浆中，其中以红细胞中含量最为丰富，小量存在 于肝、肾、心和骨骼肌中，正常情况下血清仅有少量。可用比色法和连续监测法测定其总活 性，也可用电泳法测定其同工酶的活性。 【原理】 红细胞中 G-6-PD 能催化葡萄糖-6-磷酸(G6P)脱氢生成 6-磷酸葡萄糖-δ-内酯， 后者很快氧化成 6-磷酸葡萄糖酸(6-PGA)，同时将 NADP＋还原为 NADPH。在 340nm 波长下 监测 NADPH 的生成量，即可反映红细胞中 G-6-PD 的活性。 另外红细胞中还含有 6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)，能够催化 6-磷酸葡萄糖酸脱羧， 生成核酮糖-5-磷酸(R-5-P)，同时可使 NADP+还原成 NADPH。因此，由 6-PGA 和 G6P 组成 的底物系统所测得的活性，应减去单独 6-PGA 底物测得的酶的活性，才代表了真正的 G-6-PD 活性。 【试剂】 1．6mmol/L 葡萄糖-6-磷酸二钠(G6P) 称取葡萄糖-6-磷酸二钠 21.5mg，加 10ml 蒸馏水 溶解。 2．2mmol/L NADP+ (临用前配制) 称取 NADP+ 10mg，加 6.5ml 蒸馏水溶解。 3．0.1mol/L MgCl2 称取 MgCl2·6H2O 5.08 g，蒸馏水溶解并定容至 250ml。 4．Tris-HCl-EDTA 缓冲液(pH 8.0，Tris-HCl 1mol/L， EDTA 5mmol/L) 称取 30.25g Tris、 EDTA·Na2 0.42g(或 EDTA·Na2·2H2O 0.465g)，加蒸馏水约 200ml，溶解，用 5mol/LHCl 调节 pH 至 8.0 (25℃)最后用蒸馏水定容至 250ml。 5． 6mmol/L 6-磷酸葡萄糖酸三钠(6-PGA) 称取 6-PGA Na3 20.6mg，加蒸馏水 10ml 溶 解。 上述试剂可于－20℃存放数月。 【操作步骤】 1．溶血液制备 新鲜抗凝血离心去上清液及白细胞层，用生理盐水洗涤 2 次，加生理 盐水使压积细胞约为 30%。将此红细胞悬液置冰水浴备用。用时以蒸馏水稀释 25 倍，即为溶 血液。用氰化血红蛋白法测定溶血液中血红蛋白浓度。 2．酶活性的测定 按表 14-3 操作
表14-3连续监测法测定G6PD活性试剂(ml)6-PGD测定6-PGD+G6PD测定1(B)2(U)3(B)4(U)Tris-HCI-EDTA 缓冲液0.30.30.30.30.30.30.30.3 0.1mol/LMgC/h2 溶液0.3 0.30.3 0.3 NADP+溶液溶血液0.060.060.060.062.042.04蒸馏水1.741.44混匀，37℃水浴10minG6P 溶液-0.36-PGA 溶液-0.3-0.3 混匀，于37℃在340nm波长处每隔1min读取1次吸光度，共读6次(由5min吸光度的变化，求每分钟吸光度增加的平均值，即^A/min)。以B管调零，读U管吸光度。【计算】单位定义：每升溶血液每分钟催化反应产生1umol的NADPH为1个国际单位，再换算成每克血红蛋白的酶活性先分别求6-PGD和(6PGD+G6PD)的活性，再求出G6PD的活性△A×1000酶活力（UIL)=*0.066.22= AA×8040或AA×8040酶活力（UIgHb)=Hb(g/L)G-6-PD 活性=(6PGD+G6PD)一6PGD式中，6.22：NADPH的毫摩尔吸光系数；3.0：反应液总体积(ml)；0.06：溶血液体积(ml)。【参考范围】G-6-PD活性(已校正6PGD)为8.34±1.59 U/gHb(37C)【临床意义】临床上测定红细胞 G-6-PD 活性主要用于诊断有关的溶血性贫血。红细胞G-6-PD催化反应所产生的NADPH是谷胱甘肽还原酶的辅酶，而还原型的谷胱甘肽是保持血红蛋白稳定性和红细胞膜完整性的必要条件。红细胞 G-6-PD缺乏者在服用某些药物如伯氨喹啉、磺胺类等，以及食用蚕豆后，代谢产生的自由基会使谷胱甘肽氧化，使Hb、红细胞0
10 表 14-3 连续监测法测定 G6PD 活性 试剂(ml) 6-PGD 测定 6-PGD+G6PD 测定 1(B) 2(U) 3(B) 4(U) Tris-HCl-EDTA 缓冲液 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1mol/L MgCl2 溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 NADP+溶液 0.3 0.3 0.3 0.3 溶血液 0.06 0.06 0.06 0.06 蒸馏水 2.04 1.74 2.04 1.44 混匀，37℃水浴 10min G6P 溶液 － － － 0.3 6-PGA 溶液 － 0.3 － 0.3 混匀，于 37℃在 340nm 波长处每隔 1min 读取 1 次吸光度，共读 6 次(由 5min 吸光度的 变化，求每分钟吸光度增加的平均值，即ΔA/min)。以 B 管调零，读 U 管吸光度。 【计算】 单位定义：每升溶血液每分钟催化反应产生 1μmol 的 NADPH 为 1 个国际 单位，再换算成每克血红蛋白的酶活性。 先 分 别 求 6-PGD 和 (6PGD ＋ G6PD) 的 活 性 ， 再 求 出 G6PD 的 活 性 。 0.06 3 6.22 ΔA 1000 / 酶活力（U L）= ＝ΔA×8040 或 Hb(g/L) ΔA 8040 / 酶活力（U gHb）= G-6-PD 活性＝(6PGD+G6PD)－6PGD 式中，6.22：NADPH 的毫摩尔吸光系数；3.0：反应液总体积(ml)；0.06：溶血液体积(ml)。 【参考范围】 G-6-PD 活性(已校正 6PGD)为 8.34±1.59 U/gHb(37℃) 【临床意义】 临床上测定红细胞 G-6-PD 活性主要用于诊断有关的溶血性贫血。红细 胞 G-6-PD 催化反应所产生的 NADPH 是谷胱甘肽还原酶的辅酶，而还原型的谷胱甘肽是保持 血红蛋白稳定性和红细胞膜完整性的必要条件。红细胞 G-6-PD 缺乏者在服用某些药物如伯 氨喹啉、磺胺类等，以及食用蚕豆后，代谢产生的自由基会使谷胱甘肽氧化，使 Hb、红细胞