2018/4/28重组DNA技术发展史重组DNA技术诞生的理论基础第八章分子生物学研究方法（1）40年代-—遗传的物质基础是DNA50年代—DNA分子的双螺旋结构模型和半保一、重组DNA技术发展史留复制。50年代末和60年代—--“中心法则”，操纵子二、基因工程（重组DNA技术）主要操作学说、成功地破译遗传密码。70年代初——重组DNA技术-重组DNA技术（基因工程）的概念重组DNA技术的基本步骤1、四大要素E:重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）：①外源基因是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增②载体和察殖，以获得该DNA的大量拷贝。工具酶E.基因克隆（genecloning)④受体细胞分子克隆(molecularcloning)E?0+2、需组DNA技术的基本步骤以敬体外测重组DNA分子质DNA粒分（离目的基因)转化减转染为<载细腐（割目的基因和载体）切纵重组DNA增验体888的向接（连目的基因和载体）细菌在培养液DNA99中繁殖后，在固竞转(化宿主细胞）体培养基生长体隆过系筛(选阳性克隆）勇选含惠组程质腔医塑费表 (达目的基因)1
2018/4/28 1 第八章 分子生物学研究方法（1） 一、重组DNA技术发展史 二、基因工程（重组DNA技术）主要操作 一、 重组DNA技术发展史 40年代-遗传的物质基础是DNA 50年代-DNA 分子的双螺旋结构模型和半保 留复制。 50年代末和60年代-“中心法则”、操纵子 学说、成功地破译遗传密码。 70年代初-重组DNA技术 重组DNA技术诞生的理论基础 重组DNA技术(recombinant DNA technique): 是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组, 再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增 和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。 基因克隆(gene cloning) 分子克隆(molecular cloning) 重组DNA技术（基因工程）的概念 重组DNA技术的基本步骤 1、四大要素 ①外源基因 ②载体 ③工具酶 ④受体细胞 “ 纵 向 ” 体 系 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 表（达目的基因） 2、重组DNA技术的基本步骤 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
2018/4/28基因工程为什么需要载体？目的基因的来源载体的基本条件■·天然DNA(染色体DNA、病毒1. 能自主复制;DNA、噬菌体DNA、原核细胞2.具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选质粒DNA、线粒体真核细胞：cDNA或gDNA文库和鉴定；DNA和叶缘体DNA）3.有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一■人工合成DNA切位点，称为多克隆位点；4.分子量小，以容纳较大的外源DNAPCR扩增目的基因！多克隆位点克隆载体（cloningvector）可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自MCS我复制的DNA分子。A表达载体(expressionvector)复制起始点遗传标记or号在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。基因载体自的基因原核表达载体的构建及蛋白诱导表达和分离鉴个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小CRA■质粒：10kb■入噬菌体：23kbN■黏粒：45kbRM（单NX）-BAC,350kb怕性YAC:1000kbNRPH表达产物检测RR特化大口2
2018/4/28 2 目的基因的来源 天然DNA 原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA文库 人工合成DNA PCR扩增目的基因 （染色体DNA、病毒 DNA、噬菌体DNA、 质粒DNA、线粒体 DNA和叶绿体DNA） 载体的基本条件 1.能自主复制； 2.具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选 和鉴定； 3.有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一 酶切位点，称为多克隆位点； 4.分子量小，以容纳较大的外源DNA。 基因工程为什么需要载体？ 多克隆位点 复制起始点 ori 遗传标记 Amp MCS 基因载体 克隆载体(cloning vector) 可携带插入的目的DNA进入宿主细胞内并能自 我复制的DNA分子。 表达载体(expression vector) 在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件 （如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够 表达的载体。 个克隆载体所容纳的外原DNA片段的大小 质粒：10kb λ噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb
2018/4/282.碱裂解法抽提质粒1.菌种纯化B分区划线法连续刘线净38e3.体结构4.PCR技术incL,PCR怎样使目的基因扩增很多倍？而其它DNA序列不扩增？》作为裁体的质粒应当XrmlBglll具备的条件？rmBTIT》为什么载体上的多克引物基因组隆位点有多种酶的单Hindll--S'pBV220HinallCIt857一切点？Amg3.3666bp5引物反应体系■模板DNA：待扩增的目的片段■特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补的寡核苷酸片段，15-30bpDNA聚合醇-dNTP■含有Mg2*的缓冲液3
2018/4/28 3 图2-1划线法分离纯化菌种-含质粒pBV220菌落 1.菌种纯化 2. 碱裂解法抽提质粒 3.载体结构 作为载体的质粒应当 具备的条件？ 为什么载体上的多克 隆位点有多种酶的单 一切点？ 4.PCR技术 引物 引物 3’ 5’ 5’ 5’ 基因组 PCR怎样使目的基因扩增很多倍？而其它DNA序列不扩增？ 反应体系 模板DNA：待扩增的目的片段 特异性引物：人工合成的与待扩增的靶DNA两端序列互补 的寡核苷酸片段，15-30bp DNA聚合酶 dNTP 含有Mg2+的缓冲液
2018/4/28PCR引物设计1.一对引物，分别与5／和3'增互补PCR的反应程序70~75-F02.长度：15~30个核苷酸3.引物内、引物间不应有互补序列变性 90~95℃ 50s引物与非特异扩增区无同源性4.口退火 40~60℃ 50s6.可在引物的5'端加限制性核酸内切醇的识别序列，为口延伸72℃50s目的基因的醇切和连接准备。上述三个步骤为一个循环，经25-30次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。-PCR产物的分析鉴定是否为特异性扩增，必须进行才能得出结论基因上游基因下游■凝胶电泳分析：PCR产物经电泳分离，产物片段的大小应有义链5端符合预计的大小。反向引特R■酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶切位点，酶切后正向引物F无义链3瑞电泳分离，应获得符合理论的片段。■分子杂交：检测PCR产物的特异性。■核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。为什么DNA分子可以在电场中移5.核酸电泳动？如何“看到"DNA分子？根据核酸分子大小选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物→制胶板一点样一电冰一柔色一照相或扫描3988ppnh1234图4-1PCR产物电泳图3-1pBV220质粒电泳图1-4.PCR产物;5.marken1-2:marker，3-5:质粒用澳化乙绽（ethidiumide,EB）染鱼的核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ngDNA条带
2018/4/28 4 PCR的反应程序 变性 90～95℃ 50s 退火 40～60℃ 50s 延伸 72℃ 50s 变性 延伸 退火 90～95℃ 70～75℃ 40～60℃ 上述三个步骤为一个循环，经25-30次循环后，可将模板DNA 扩增达百万倍。 PCR引物设计 1. 一对引物，分别与5 ′和3′端互补 2. 长度：15～30个核苷酸 3. 引物内、引物间不应有互补序列 4. 引物与非特异扩增区无同源性 5. 可在引物的5’端加限制性核酸内切酶的识别序列，为 目的基因的酶切和连接准备。 F R PCR产物的分析鉴定 是否为特异性扩增，必须进行才能得出结论 凝胶电泳分析：PCR产物经电泳分离，产物片段的大小应 符合预计的大小。 酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶切位点，酶切后 电泳分离，应获得符合理论的片段。 分子杂交：检测PCR产物的特异性。 核酸序列分析：是检测PCR产物特异性的最可靠方法。 根据核酸分子大小选择琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作支持物→制 胶板→点样→电泳→染色→照相或扫描 用溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染 色的核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能 看到约50ng DNA条带 5.核酸电泳 为什么DNA分子可以在电场中移 动？如何“看到”DNA分子？ 1 2 3 4 5 图3-1 pBV220质粒电泳图 1-2: marker，3-5: 质粒. 图4-1 PCR产物电泳 1-4. PCR产物; 5. marker 1 2 3 4 5
2018/4/28外-8EDN6.DNA重组怎样构成重组DNA分子？>为什么要把质粒和目的基因双醇切？人工楼头限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶EcoRIEcoRCCGAATTCGG5-BamHIGGCTTAAGCO3GGATCCG+GATCC我体CCTAGGCCTAGG分类：I、II、III重组体DNA分子（基因工程技术中常用II型）定向重组DNA连接酶：通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片0断连接成一个整体DNA分子。T-DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶RT-DNA连接酶只按一个方向连接如果目的基因和载体分别用两种醇切财自的基和载体召育一轻连携方。“目的囊围和裂肩端不能性摄国HR彩地NPCH图的物息想一想#RONAPR产销（日的转园）7.转化（transformation）：1.如何纯化菌种？服产物电动检日的送时公产锁将外源DNA分子导入受体细胞的过程2.碱法抽提质粒的原理？TBDNA感受态细胞（Competentcells）：3.作为载体的质粒应当具备的条件经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。4.为什么载体上的多克隆位点有多种酶的单一切点？5.PCR怎样使目的基因扩增很多倍？而其它DNA序列不扩增？如大肠杆菌经CaC1，处理，就成为容易受质粒DNA6.为什么DNA分子可以在电场中移动？如何“看到DNA分子？转化的细胞。7.怎样把目的基因和蒙体构成重组DNA分子？8.为什么要把质粒和目的基因双酶切？5
2018/4/28 5 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE) 能识别和切割双链DNA分子中特定碱基序列的核酸水解酶 分类: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型） 6. DNA重组 怎样构成重组DNA分子？ 为什么要把质粒和目的基因双酶切？ DNA连接酶: 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片 断连接成一个整体DNA分子。 T4¯DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶 T7¯DNA连接酶 定向重组 1. 如何纯化菌种？ 2. 碱法抽提质粒的原理？ 3. 作为载体的质粒应当具备的条件？ 4. 为什么载体上的多克隆位点有多种酶的单一切点？ 5. PCR怎样使目的基因扩增很多倍？而其它DNA序列不扩增？ 6. 为什么DNA分子可以在电场中移动？如何“看到”DNA分子？ 7. 怎样把目的基因和载体构成重组DNA分子？ 8. 为什么要把质粒和目的基因双酶切？ 想一想 7.转化（transformation） ： 感受态细胞（Competent cells） ： 经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。 如大肠杆菌经CaCl2处理，就成为容易受质粒DNA 转化的细胞。 将外源DNA分子导入受体细胞的过程
2018/4/28受体细胞转化方法化学转化原理：在0C冷冻处理时，处于CaCI，低渗溶液中的大肠杆特殊处理■CaCl诱导转化菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热■电穿孔细胞膜特性冲击（42C）下，细胞吸收外源DNA，然后在培养改变■PEG介导转化基内复原并增殖，表达外源基因。■人工体外包装克隆的筛选7.筛选阳性克隆>遗传检测用重组DNA转化感受态细胞之后会有什么结果？抗药性选择蓝白斑法（B-半乳糖苷醇法）怎样筛选出你想要的阳性克隆？电泳鉴定PCR鉴定、酵切鉴定OC苗落杂交筛选法用探针免疫化学检测法用抗原一抗体反应DNA序列检测α-互补筛选抗药性检测和菌体PCR检测■质粒：含β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列，表达α片段■宿主细胞染色体：含编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列，表达片段。α和a片段互补具有酶活性，在含有IPTG/X-gal123能型:高的率节变病的培养基上形成蓝色菌落（蓝斑）程达不阳模变量PCP后糖血的01.20006
2018/4/28 6 转化方法 CaCl2诱导转化 电穿孔 PEG介导转化 人工体外包装 特殊处理 受体细胞 细胞膜特性 改变 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的热 冲击（42 ℃）下，细胞吸收外源DNA ，然后在培养 基内复原并增殖，表达外源基因。 7.筛选阳性克隆 用重组DNA转化感受态细胞之后会有什么结果？ 怎样筛选出你想要的阳性克隆？ 克隆的筛选 遗传检测 抗药性选择 蓝白斑法（ß-半乳糖苷酶法） 电泳鉴定 PCR鉴定、酶切鉴定 菌落杂交筛选法 用探针 免疫化学检测法 用抗原-抗体反应 DNA序列检测 图 3 转化后，在含氨苄青霉素 培养基上长出的单菌落 1 2 3 4 5 6 7 图9-3 pBVIL1阳性克隆PCR产物电泳检测 1～6为挑取6个阳性克隆 7、DNA Marker DL 2000 抗药性检测和菌体PCR检测 -互补筛选 质粒: 含 β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端 （N端）146个氨基酸编码序列，表达片段 宿主细胞染色体： 含编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列，表达 片段。 和片段互补具有酶活性，在含有IPTG/X-gal 的培养基上形成蓝色菌落（蓝斑）
2018/4/28蓝白斑法（B-半乳糖苷酶法）Lac ZOO中事春X-gal蓝色化合物N.HCOOH0片段α片段CloningVector.-pUC19ReIASCSSaelXimatXxbalBspMSi3ApUcI9aO22.686koSRdCSePara质粒大小2686bp质粒标答：tacz原族抗性：#下宵莓克AmpPint22充降药校：DH5αBeal 培养条件：37C，有年，LBMISFTGTAAACGACGGCAGT5期序引物：pUC183测序引物;M13R:CAGGAAACAGCTATGACC2686bpPUC18装体质粒图谱和多克降位点信息AEPC际动8e111pUC18E2686bp招练理理理送理1
2018/4/28 7 蓝白斑法（ß-半乳糖苷酶法） 半乳糖苷酶法） Amp lacZ' N2H 片段 COOH 片段 X-gal Lac Z 蓝色化合物
2018/4/28电泳检测法蓝白斑筛选LacZ,IPTGDNAMarkerX-galX+gal空质粒（白色）（蓝色）加样孔重组质粒重组质粒酶切LacZ（失活）,IPTG重组质粒的PCR扩增片段X-galX-gal（白色）（白色）pr pei症医较双酶切产物10分期为1号：2903号单克路-萌落杂交韩选法免疫化学检测法滤膜（固定抗体）原位杂交放射性抗体检测法DNA序列检测8.外源基因在宿主细胞中的表达L.+？目的基因的mRNApBV220td表达蛋白质3666bp1大肠杆菌（E.coll)）吴体细胞DBV220的物理图落48
2018/4/28 8 蓝白斑筛选 Lac Z , IPTG X-gal X + gal （白色） （蓝色） Lac Z（失活）,IPTG X-gal X-gal （白色） （白色） 电泳检测法 加 样 孔 空质粒 DNA Marker 重组质粒 重组质粒酶切 重组质粒的 PCR扩增片段 1 2 3 4 图9-1 pBVIL1转化后质粒双酶切产物 1.DNA Marker DL 2000 2-4分别为1号，2号，3号单克隆 原位杂交 菌落杂交筛选法 免疫化学检测法 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + DNA序列检测 A C T G A A G G C T 8.外源基因在宿主细胞中的表达 重组 DNA目的基因的 mRNA 表达蛋白质 大肠杆菌（ E.coli）受体细胞
2018/4/289.目的基因表达产物的检测1.蛋白质为什么会在电场中移对照样品Marker动？移动的快慢与什么有关？31kD20.1kD2.通过电泳怎么知道你的目A的基因表达了？图10-1pBVL1表达产物的SDS（12%）整定3.电泳时一般要加分子量2h来达的白：6为的性竞登的未导对marker，为什么？蛋白质的SDS-PAGE表达蛋白生物学功能检测97.4.66.2.43.9,30.014.4图2pBV-Dps~6His重组子诱导表达鉴定的SDSPAOEAS主未诱导pBV220停体可落性蛋白对照；2-7:诱号的1、3、5.7、8、9号单克降菌体蛋白；M淀粉酶基因表达妖分子量标准蛋自10.目的蛋白的分离纯化kD97.466.2.分子筛B888943.9亲和柱30.020.1离子交换14.4.日的蛋白抗原抗体图3纯化的Dps-6his蛋白的SDS-PAGE诱导的pBV-Dps-6His工程全常脂白2透导的pBV-Dps-6His主程间上组分：34：争让组分1、2；5:50mM味唑洗脱组分：6-9.特持孕性洗脱组分1.2.3.4（对应媒浓度为100、150、200、250mM）；M：低分子量标准蛋白nAnAnn9
2018/4/28 9 9.目的基因表达产物的检测 目的基因表达产物的检测 蛋白质的SDS-PAGE 对照 样品 Marker 1.蛋白质为什么会在电场中移 动？移动的快慢与什么有关？ 2. 通过电泳怎么知道你的目 的基因表达了？ 3. 电泳时一般要加分子量 marker，为什么？ 94.7kD 66.2 kD 43 kD 31 kD 20.1 kD 14.4 kD 图10-1 pBVIL1表达产物的SDS-PAGE(12%)鉴定 1 为标准分子量蛋白质Marker；2～5分别为3h 6h 9h 12h表达的蛋白；6 为阳性克隆的未诱导对照 表达蛋白生物学功能检测 淀粉酶基因表达 10.目的蛋白的分离纯化 目的蛋白的分离纯化 分子筛 亲和柱 离子交换 抗原抗体 目的蛋白
2018/4/28DNA克强（单莓路）想一想阳性充发障产物1.怎样把重组后的DNA导入到受体细胞？表达产物检测2.感受态细胞是怎样诱导的？3.用重组DNA转化感受态细胞之后会有什么结果？4.怎样筛选出你想要的阳性克隆？5.怎样进行诱导表达？10
2018/4/28 10 1. 怎样把重组后的DNA导入到受体细胞？ 2. 感受态细胞是怎样诱导的？ 3. 用重组DNA转化感受态细胞之后会有什么结果？ 4. 怎样筛选出你想要的阳性克隆？ 5. 怎样进行诱导表达？ 想一想