Questions A、po萃取? B、胞内酶的萃取? C、包含体的pro复性?
Questions A、pro萃取？ B、胞内酶的萃取？ C、包含体的pro复性?
第11章双水相萃取 双水相系统 aqueous two- phase systen,ATPS) PEGPEG PEG PEG 十 KPi KPi Dⅹ Dⅹ PEG=聚已二醇( polyethylene glycol) Kpi=磷酸钾 1、Pro如何分布 DX=葡聚糖( dextran 2、影响因素 3、应用
第11章 双水相萃取 双水相系统(aqueous two-phase systen, ATPS) PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran) 1、Pro如何分布 2、影响因素 3、应用
第11章双水相萃取 1、ATPS相图 2、蛋白质的分配平衡 3、影响蛋白质m的综合因素 4、体系的选择和优化 5、 applications
第11章 双水相萃取 1、 ATPS相图 2、 蛋白质的分配平衡 3、 影响蛋白质m的综合因素 4、 体系的选择和优化 5、 Applications
1ATPS相图 双节线(bi-noda) 图中的曲线。双节线以下的区域为均相区,3 以上的区域为两相区,即ATPS 系线 tie line) 双节线上两点的直线 系线 tie line)反映的信息 A杠杆规则系线上各点均为分成组成相同 而体积不同的两相。两相体积近似服从杠 杆规 BM 10 B性质差异:系线的长度是衡量两相 相对差别的尺度,系线越长,两相间 性质差别越大;反之则越 B C临界点 critical-point):当系线长度趋 零时,两相差别消失任何溶质在两 KPi质量分数/% 相中的分配系数均为1。如K点。 双水相系统相图PEG6000/KPi
1 ATPS相图 双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线以下的区域为均相区, 以上的区域为两相区，即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上两点的直线。 系线(tie line)反映的信息 A 杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同， 而体积不同的两相。两相体积近似服从杠 杆规则 B 性质差异：系线的长度是衡量两相间 相对差别的尺度,系线越长,两相间的 性质差别越大；反之则越小. C 临界点(critical point)：当系线长度趋 于零时, 两相差别消失,任何溶质在两 相中的分配系数均为1。如K点
2蛋白质的分配平衡 1)、分配系数m x 木瓜蛋白酶 2)、m贡献因子 胰蛋白醇 ln三n肌十血,+ln a-胰凝乳蛋白酶 m和m2分别为静电、疏水和亲 和作用对溶质m的贡献 廠也离掘 卵白蛋白 3)、静电作用 0.5 铁传递蛋白 电中性p的m: mo=-M4y/RT a·淀粉酶 式中,M:溶质分子量;,AY:溶质在上下 两相表面自由能的差,Jmol 02 意义: 牛血清白蛋白 A不受静电作用的影响(因不带电)0 B一般△y>0,溶质1nm随M个而 C ATPS不同同溶质的Aγ也就不004t6+k 同,m随ATPS不同而改变 图是不同po在pH为各pro的p的ATPS M×104 中的m 双水相中溶质的分配系数与相对分子质量的关系 4.4%PEG80007%DxT500,20℃
2 蛋白质的分配平衡 1)、分配系数m 2)、m贡献因子 me、mb和ma分别为静电、疏水和亲 和作用对溶质m的贡献. 3)、静电作用 电中性pro的m0： 式中, M: 溶质分子量; : 溶质在上下 两相表面自由能的差,J/mol。 意义： A 不受静电作用的影响(因不带电); B 一般 > 0，溶质lnm随M而； C ATPS不同, 同一溶质的也就不 同，m随ATPS不同而改变。 图是不同pro在pH为各pro的pI的ATPS 中的m
2蛋白质的分配平衡 陶南电位(△q, Donnan potential) 实际APS中有电解质,当这些离子在两 相中m≠1),将两相间产生电位差△q RT 9 (Z+ZF m2+ 带电pro的m: m=1mn+△ R 意义: 0 A荷电溶质的分配系数的对数与溶质的 净电荷数成正比 核糖核酸酶的m与其电荷数的关系 B由于同一APS中添加不同的盐产生58%PEG6004%DxT50,20c 的△q不同故m与Z的关系因盐而异。 O)0.1mol/ dm KSCN; ( D)0. 05 mol/dm3 K2S04(()0. 1 mol/dm3 KCl
2 蛋白质的分配平衡 陶南电位(, Donnan potential) 实际ATPS中有电解质, 当这些离子在两 相中m 1), 将两相间产生电位差 带电pro的m: 意义： A 荷电溶质的分配系数的对数与溶质的 净电荷数成正比. B 由于同一ATPS中添加不同的盐产生 的不同,故m与Zpro的关系因盐而异
2蛋白质的分配平衡 4)、疏水作用 相间疏水因子(HF, hydrophobic factor) PEG PEG/DX和 PEG/KPi等ATPS上相(PEG相) KPi 疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示 HF可通过测定疏水性已知的a在其p处 的mn测算 n HF(RH +B) T RH-aa相对疏水性( (relative hydrophobicity)) Ty 是通过测定a在水和已醇中溶解度的差 Met Pl 别确定的,并设疏水性最小的Gly的 Thr val RH0所以,上式中的B为 Gly B=Inm./HF ma为(y分配系数所以,pHpL时aa在 RH/(k】/mo) ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关 系,直线的斜率就是该双水相系统的HF 双水相系统疏水性的测定: 值.图为测定实例 氨基酸的分配系数与RH的关系 14%PEG4000/14%KPi, pHpI
2 蛋白质的分配平衡 4)、疏水作用 相间疏水因子(HF,hydrophobic factor) PEG/DX和PEG/KPi等ATPS上相(PEG相) 疏水性较大,相间的疏水性差用HF表示. HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处 的maa测算: RH-aa相对疏水性(relative hydrophobicity). 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差 别确 定的,并设 疏水性最小的 Gly 的 RH=0.所以,上式中的B为: mGly为Gly分配系数. 所以, pH=pL时aa在 ATPS中的分配系数与其RH值呈线性关 系,直线的斜率就是该双水相系统的HF 值.图为测定实例
h=团+B蛋白质的分配平衡 Pro表面疏水性(HS, HF of surface) 利用上式可确定不同ATPS的HF值如在pH pl的ATPS中,pro的m与HF值之间呈 线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白 质的HFS R lnmn=HF×HFS 图为蛋白质的m与HF的实测关系图。图的 结果示:pro的HFS随NaC浓度的增大 而增大。将盐对pro的H影响上式得 HF(HFS+△HFS 0,0 其中Δ HFS sal1为盐增加而引起的HS值增量 0.02 040.06 因此,m的一般形式 HF/(mol/kJ) hnm=/0 RT 》0 意义: 盐对血红蛋白分配系数的影响 PEG/Dx, pH=-pI FZ NaCl(mol/kg):(○)0 Inm=HF(HFS+ AHFSsait)+nm 4p 口)0.6;(●)1;(△)2
2 蛋白质的分配平衡 Pro表面疏水性(HFS,HF of surface) 利用上式可确定不同ATPS的HF值.如在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之间呈 线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋白 质的HFS 图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。图的 结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增大 而增大。将盐对pro的HF影响上式得： 其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式 意义：
3影响蛋白质m的综合因素 1)、成相聚合物浓度和M 分子量M:若降低聚合物的M,则pro分 配于富含该聚合物的相中。如 PEG/DX系统,若降低DX的M,则m 咸小。这一规律具有普遍意义 成相系统的总浓度:增大时系统远离洲 临界点系线长度增加,两相性质的差售 别(疏水性等增大蛋白质分子的分配图 系数将偏离临界点处的值(m=1)即大 于1或小于1因此,成相物质的总浓度0 越高,系线越长,蛋白质越容易分配于 其中的某一相 FZ lm=HF(F+△EFS)+-m△9 R KP质量分数/% 实验结果 ↓ 双水相系统相图PEG600/KFi
3 影响蛋白质m的综合因素 1)、成相聚合物浓度和M 分子量M: 若降低聚合物的M，则pro分 配于富含该聚合物的相中 。 如 PEG/DX系统，若降低DX的M，则m 减小。这一规律具有普遍意义。 成相系统的总浓度：增大时,系统远离 临界点,系线长度增加,两相性质的差 别(疏水性等)增大,蛋白质分子的分配 系数将偏离临界点处的值(m=1),即大 于1或小于1.因此,成相物质的总浓度 越高,系线越长,蛋白质越容易分配于 其中的某一相. . 实验结果
3影响蛋白质m的综合因素 10 实验结果 nm=HF(HFS+△HFS)+ R 1)、成相聚合物浓度和M0 0.5 存在问题:当系线长度增加时,系4 统的表面张力增大可能导致溶 0.2 藻红蛋白 质在界面上的吸附这种现象在 血清亡蛋白 处理含细胞和固体微粒的料液1 1o 时尤为严重细胞或固体微粒容 △Dx/% 易集中在界面上给萃取操作带 蛋白质在PEG6000/DxD-48 来因难,但对于可溶性蛋白质 系统的分配系数 0.01mol/dm3磷酸盐,pH6.8 这种界面吸附现象很少发生 0.01m/dm3磷酸盐,0.lmol/dm3NaCl 般可不考虑 pH6.8
3 影响蛋白质m的综合因素 1)、成相聚合物浓度和M 存在问题：当系线长度增加时,系 统的表面张力增大,可能导致溶 质在界面上的吸附.这种现象在 处理含细胞和固体微粒的料液 时尤为严重,细胞或固体微粒容 易集中在界面上,给萃取操作带 来因难,.但对于可溶性蛋白质. 这种界面吸附现象很少发生,一 般可不考虑。 实验结果