第三章 细胞生物学实验技术 METHODS AND TECHNIQUES
第三章 细胞生物学实验技术 METHODS AND TECHNIQUES
第三节 细胞分离技术
第三节 细胞分离技术
一、离心技术 ➢ 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各 种大分子基本手段。 ➢ 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 ➢ 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。 ➢ 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心 力超过500Kg
一、离心技术 ➢ 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各 种大分子基本手段。 ➢ 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 ➢ 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。 ➢ 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心 力超过500Kg
（一）差速离心 Differential centrifugation ➢ 特点： ⚫ 介质密度均一； ⚫ 速度由低向高，逐级离心。 ➢ 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ➢ 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体—— 内质网与高基体——核蛋白体。 ➢ 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分 离纯化
（一）差速离心 Differential centrifugation ➢ 特点： ⚫ 介质密度均一； ⚫ 速度由低向高，逐级离心。 ➢ 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 ➢ 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体—— 内质网与高基体——核蛋白体。 ➢ 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分 离纯化
Low speed High speed Differential centrifugation
Low speed High speed Differential centrifugation
（二）密度梯度离心 ➢ 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细 胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使 细胞分层、分离。 ➢ 类型：速度沉降、等密度沉降。 ➢ 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 ➢ 分离活细胞的介质要求： ⚫ 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； ⚫ 2）PH中性或易调为中性； ⚫ 3）浓度大时渗透压不大； ⚫ 4）对细胞无毒
（二）密度梯度离心 ➢ 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细 胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使 细胞分层、分离。 ➢ 类型：速度沉降、等密度沉降。 ➢ 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 ➢ 分离活细胞的介质要求： ⚫ 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； ⚫ 2）PH中性或易调为中性； ⚫ 3）浓度大时渗透压不大； ⚫ 4）对细胞无毒
1、速度沉降 velocity sedimentation ➢ 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 ➢ 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被 分离生物颗粒的最小密度。 ➢ 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降 系数以不同的速度沉降而达到分离
1、速度沉降 velocity sedimentation ➢ 用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。 ➢ 特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被 分离生物颗粒的最小密度。 ➢ 原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降 系数以不同的速度沉降而达到分离
2.等密度沉降 isopycnic sedimentation ➢ 用途：分离密度不等的颗粒。 ➢ 特点： ⚫ 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最 大密度。 ⚫ 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速 离心。 ➢ 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离 心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到 平衡，从而将不同密度的成分分离
2.等密度沉降 isopycnic sedimentation ➢ 用途：分离密度不等的颗粒。 ➢ 特点： ⚫ 介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最 大密度。 ⚫ 所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速 离心。 ➢ 原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离 心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到 平衡，从而将不同密度的成分分离
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
二、流式细胞术 ➢ 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 ➢ 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成 包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出 散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算 机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度 的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘 液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）
二、流式细胞术 ➢ 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。 ➢ 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成 包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出 散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算 机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度 的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘 液，所用仪器称为流式细胞计（flow cytometer）