第三章 细胞生物学实验技术 METHODS AND TECHNIQUES
第三章 细胞生物学实验技术 METHODS AND TECHNIQUES
第二节 生物化学与分子生物 学技术
第二节 生物化学与分子生物 学技术
➢ 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分 进行定性和定位研究。 ➢ （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸 等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙 酮缓冲液固定。 一、细胞化学技术
➢ 组织化学和细胞化学染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于对某些细胞成分 进行定性和定位研究。 ➢ （一）固定 1. 物理固定：血膜空气快速干燥、冷冻干燥。 2. 化学固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸 等试剂。显示多糖常用乙醇固定，显示酶类多用甲醛丙 酮缓冲液固定。 一、细胞化学技术
（二）显示方法 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最 终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品 红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反 应）。 3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再 将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质
（二）显示方法 1. 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最 终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 2. Schiff反应：细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品 红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反 应）。 3. 联苯胺反应：过氧化酶分解H202。产生新生氧，后者再 将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 4. 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 5. 茚三酮反应：显示蛋白质
二、免疫细胞化学 immunocytochemistry ➢ 概念：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行 定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 ➢ 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异 硫氰酸荧光素、罗丹明等。 ➢ 酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣 根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示 出抗原存在的部位
二、免疫细胞化学 immunocytochemistry ➢ 概念：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行 定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 ➢ 免疫荧光法（immunofluorescent technique）：常用的萤光素有异 硫氰酸荧光素、罗丹明等。 ➢ 酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣 根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示 出抗原存在的部位
三、显微光谱分析技术 ➢ 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、 蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的 吸收曲线。 ➢ 可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定 性和定量测定
三、显微光谱分析技术 ➢ 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、 蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的 吸收曲线。 ➢ 可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定 性和定量测定
四、放射自显影术 ➢ 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、 排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 ➢ 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过 一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光， 使乳胶感光。 ➢ 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3HUDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、 3H岩藻糖研究多糖。 ⚫ 14C半衰期为5730年， 3H为12.5年
四、放射自显影术 ➢ 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、 排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 ➢ 原理：将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过 一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光， 使乳胶感光。 ➢ 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3HUDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、 3H岩藻糖研究多糖。 ⚫ 14C半衰期为5730年， 3H为12.5年
五、分子杂交技术 ➢ 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当 条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或 RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子 核苷酸序列间是否具有互补关系。 ➢ （一）原位杂交（in situ hybridization）。 ➢ 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性 的DNA探针，后来又发明了免疫探针法
五、分子杂交技术 ➢ 具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当 条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或 RNA-RNA杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子 核苷酸序列间是否具有互补关系。 ➢ （一）原位杂交（in situ hybridization）。 ➢ 用于检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性 的DNA探针，后来又发明了免疫探针法
（二）Southern杂交 ➢ 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限 制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段， 经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再 用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探 针互补的特殊核苷序列。 ➢ 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交 ，则称为 Northern杂交
（二）Southern杂交 ➢ 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限 制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段， 经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再 用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探 针互补的特殊核苷序列。 ➢ 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交 ，则称为 Northern杂交
六、PCR 技术 ➢ PCR即：polymerase chain reaction。 ➢ 反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个 核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热 水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度75~80℃， 短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+ 。 ➢ 反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右； ③延伸：70-75℃；④重复 “变性——复性——延伸” 过程20-30次循环
六、PCR 技术 ➢ PCR即：polymerase chain reaction。 ➢ 反应体系：①样品DNA；②引物（primer），约15-20个 核苷酸；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，来自于嗜热 水生菌Thermus aquaticus，最适作用温度75~80℃， 短时间在95℃下不失活。⑤缓冲体系和Mg2+ 。 ➢ 反应过程：①变性：约90-95℃；②复性：约60℃左右； ③延伸：70-75℃；④重复 “变性——复性——延伸” 过程20-30次循环