Pre ss Release:The 1993 Nobel Prize in Chemistry 13 October 1993 The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the 1993 Nobel Prize in Chemistry for contributions to the development of methods within DNA-based chemistry, with half to Dr Kary B.Mullis,La Jolla,California,U.S.A.,for his invention of the polymerase chain reaction(PCR) method, and half to Professor Michael Smith,University of British Columbia, Vancouver,Canada,for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based,site- directed mutagenesis and its development for protein studies. PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建香fineprint.com,cn
Press Release: The 1993 Nobel Prize in Chemistry 13 October 1993 The Royal Swedish Academy of Sciences has decided to award the 1993 Nobel Prize in Chemistry for contributions to the development of methods within DNA-based chemistry, with half to Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method, and half to Professor Michael Smith, University of British Columbia, Vancouver, Canada, for his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, sitedirected mutagenesis and its development for protein studies. PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿ香ÿ www.fineprint.com.cn
Introduction Polymerase chain reaction(PCR)has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology and for good reason:it is a rapid,inexpensive and simple means of producing relatively large numbers of copies of DNA molecules from minute quantities of source DNA material--even when the source DNA is of relatively poor quality.PCR involves preparation of the sample,the master mix and the primers,followed by detection and analysis of the reaction products PDF文件使用"pdfFactory Pro'”试用版本创建mm,fineprint.com,cn
Introduction Polymerase chain reaction (PCR) has rapidly become one of the most widely used techniques in molecular biology and for good reason: it is a rapid, inexpensive and simple means of producing relatively large numbers of copies of DNA molecules from minute quantities of source DNA material--even when the source DNA is of relatively poor quality. PCR involves preparation of the sample, the master mix and the primers, followed by detection and analysis of the reaction products PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 öwww.fineprint.com.cn
The applications of Mullis'PCR method are already many.It is for example possible using simple equipment to multiply a given DNA segment from a complicated genetic material millions of times in a few hours,which is of very great significance for biochemical and genetic research.The method offers new possibilities particularly in medical diagnostics,and is used, for example,for discovering HIV virus or faulty genes in hereditary diseases.Researchers can also produce DNA from animals that became extinct millions of years ago by using the PCR method on fossil material. PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建mw,fineprint..com,cn
The applications of Mullis' PCR method are already many. It is for example possible using simple equipment to multiply a given DNA segment from a complicated genetic material millions of times in a few hours, which is of very great significance for biochemical and genetic research. The method offers new possibilities particularly in medical diagnostics, and is used, for example, for discovering HIV virus or faulty genes in hereditary diseases. Researchers can also produce DNA from animals that became extinct millions of years ago by using the PCR method on fossil material. PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
原理简介：PCR技术的基本原理是 DNA的半保留复制。由于DNA复制是 半保留的，两条链都可以作为模板。在 体内，DNA复制是周期性的，所以基因 扩增的数量有限；PCR技术在体外利用 人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和 些合适的底物和因子，通过对温度的 控制，使DNA不断位于变性、复性和合 成的循环中，达到扩增DNA的目的。 PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建w,fineprint.com,cn
原理简介： PCR 技术的基本原理是 DNA的半保留复制。由于DNA复制是 半保留的，两条链都可以作为模板。在 体内，DNA复制是周期性的，所以基因 扩增的数量有限；PCR技术在体外利用 人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和 一些合适的底物和因子，通过对温度的 控制，使DNA不断位于变性、复性和合 成的循环中，达到扩增DNA的目的。 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
何为Pcr技术？ Pcr:Polymerase chain reaction 就是反复进行包括热变性—退火—引物延伸三步骤的循环过 程。 1.热变性：基因组DNA在95度下加热5分，双螺旋结构被热变性 解链为两股单链。 2.退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述单链DNA上 互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板—引物复合物。 3.引物延伸：迅速加入TagDNA聚合酶，混匀。置反应混合物于 7O摄氏度，一分钟，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从 引物3端开始，沿着5”一3的方向，按照模板链的序列，合成一 条新DNA链，其序列与模板序列互补。 经上述变性--退火-引物延伸这一循环，双链DNA拷贝数增加一 倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行25一30个 循环，拷贝数即扩增上百万倍。 PDF文件使用"pdfFactory Pro" 试用版本创建ww.fineprint.com.cn
何为Pcr技术？ Pcr:Polymerase chain reaction 就是反复进行包括热变性——退火——引物延伸三步骤的循环过 程。 1.热变性：基因组DNA在95度下加热5分，双螺旋结构被热变性 解链为两股单链。 2.退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述单链DNA上 互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板——引物复合物。 3.引物延伸：迅速加入TaqDNA 聚合酶，混匀。置反应混合物于 70摄氏度，一分钟，在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从 引物3’端开始，沿着5’—3’的方向，按照模板链的序列，合成一 条新DNA链，其序列与模板序列互补。 经上述变性---退火---引物延伸这一循环，双链DNA拷贝数增加一 倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行25—30个 循环，拷贝数即扩增上百万倍。 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
The PCR method can be used for reduplicating a segment of a DNA molecule,e.g.from a blood sample.The procedure is repeated 20-60 times,which can give millions of DNA copies in a few hours. ing.The stat yesisof ew DNA te help of the DNA Polymerase enzyme. 一New DNA strands are formed,which in tum can reduplicate 2----- replic PDF文件使用"pdfFactory Pro'”试用版本创建um,fineprint.com,cn
The PCR method can be used for reduplicating a segment of a DNA molecule, e.g. from a blood sample. The procedure is repeated 20-60 times, which can give millions of DNA copies in a few hours. PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
PCR:Polymerase Chain Reaction 30-40 cycles of 3 steps: 484040484 Step 1:denaturation 1 minut 94C MmmTTTTimmTiTT 山u山uy头u兴 sTMmTTTWTTTTmTT3 Step 2:annealing LLS 35 45 seconds 54C mmn3 u兴g forward and reverse primers!!! smTTmTTmT 、人二 5 Step 3:extension 11八11- 、1八 、八 2 minutes 72C m产3 only dNTP's 子u兴uu兴： (Andy PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建ww.fineprint.com.cn
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4th cycle -wanted gene Exponential amplification Ist cyele ...-.35th cyele template DNA 23-=< 4 copics 8 copies 16 copies 32 copic 268 billion copies Andy Vicrstracte 1999） PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建wm,fineprint.com,cn
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CM瑰1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供 种合适的条件--模板DNA,寡核苷酸引物，DNA聚合酶， 合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善Mullis:最初使用的DNA聚合酶是大肠 杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶 不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。② 引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间 的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不 均一。 此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备 许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进 行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成 个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。后 来，从耐热菌株Thermus aquaticus:纯化出耐热的DNA聚合 酶TaqDNA Polymerase,具有极好的热稳定性。 PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建ww,fineprint..com.c如
PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的 Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于 DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一 种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶， 合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间。 PCR的改进与完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠 杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶 不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。② 引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间 的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不 均一。 此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备 许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进 行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一 个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。后 来，从耐热菌株Thermus aquaticus纯化出耐热的DNA聚合 酶TaqDNA Polymerase,具有极好的热稳定性。 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
操作步骤 1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10XPCR buffer 5u1 dNTP mix (2mM) 4μ1 引物1(10pM) 2μ1 引物2(10pM) 2μ1 Tag酶(2U/μI) 1μ1 DNA模板(50ng-1μg/μI) 1μ1 加ddH2O至 50μ1 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行 扩增。一般：在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段：93℃40s→ 58℃30s→72℃60s,循环30-35次，最后在72℃保温7min。 3.结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4.PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μI氯仿进行 抽提反应混合液，以除去石蜡油：否则，直接取5-10μ电泳检测。 PDF文件使用"pdfFactory Pro”试用版本创建ww,fineprint.com.cn
操作步骤 1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix （2mM） 4 μl 引物1（10pM） 2 μl 引物2（10pM） 2 μl Taq酶 （2U/μl） 1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl 加ddH2O至 50 μl 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2． 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行 扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。 3． 结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4．PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行 抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 ÿwww.fineprint.com.cn
