第六章 双重或多重免疫组 化标记 (p111)
第六章 双重或多重免疫组 化标记 (p111)
基本原理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞 化学原理,在同一张切片上同时采用或先 后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物, 或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示 踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的 项标记染色技术
一 、 基 本 原 理 双重或多重标记是利用免疫学和细胞 化学原理，在同一张切片上同时采用或先 后采用不同颜色的荧光色素或酶促产物， 或采用不同直径大小颗粒胶体金来原位示 踪组织或细胞内不同抗原大分子物质的一 项标记染色技术
由于此项技术可在同一张切片上同时 显示两种或两种以上不同抗原成分(定性 定位、定量),因而使组织内不同抗原成分 相互间功能关系的观察更加直观,操作需 遵循的原则和要求基本上与单标免疫组化 方法雷同,但差异是流程长,脱片机率更 高,前后重染色试剂间有交叉干扰等
由于此项技术可在同一张切片上同时 显示两种或两种以上不同抗原成分(定性、 定位、定量)，因而使组织内不同抗原成分 相互间功能关系的观察更加直观，操作需 遵循的原则和要求基本上与单标免疫组化 方法雷同，但差异是流程长，脱片机率更 高，前后重染色试剂间有交叉干扰等
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二、技术类型 ()双重或多重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍, 分别标记不同的抗体,再通过各自与同 切片上的相应抗原特异性结合而加以区别 显示所建立起来的双重或多重免疫组化染 色技术
二、技术类型 （一）双重或多重免疫荧光标记染色 采用呈现不同颜色的荧光色素配伍， 分别标记不同的抗体，再通过各自与同一 切片上的相应抗原特异性结合而加以区别 显示所建立起来的双重或多重免疫组化染 色技术
荧光素配伍:异硫氰酸荧光素 (FITO 翠绿色,常与罗丹明(RB200) 或异硫氰酸四甲基罗丹明(TRIC)配伍, 后者呈红色。 方法敏感、特异,需选用各自特定的 激发滤光片分别观察或二次曝光显影,样 本不能长期保存,组织结构背景不清晰
荧光素配伍：异硫氰酸荧光素 (FITC）——翠绿色，常与罗丹明(RB200) 或异硫氰酸四甲基罗丹明（TRITC）配伍， 后者呈红色。 方法敏感、特异，需选用各自特定的 激发滤光片分别观察或二次曝光显影，样 本不能长期保存，组织结构背景不清晰
技术类型有直接法和间接法之分。前 者特异、快速,后者敏感、多用 所用抗体试剂可为异种动物抗体,也 可为同种动物抗体。 异种动物抗体常混合应用,操作步骤 ,脱片率相对较低
技术类型有直接法和间接法之分。前 者特异、快速，后者敏感、多用。 所用抗体试剂可为异种动物抗体，也 可为同种动物抗体。 异种动物抗体常混合应用，操作步骤 少，脱片率相对较低
同种动物抗体多分别应用,操作步骤 加倍,脱片机率相对较高,前后重免疫荧 光标记交叉重叠机会多,需用酸性洗脱或 多聚甲醛蒸气处理
同种动物抗体多分别应用，操作步骤 加倍，脱片机率相对较高，前后重免疫荧 光标记交叉重叠机会多，需用酸性洗脱或 多聚甲醛蒸气处理
操作举例:垂体腺瘤--ACTH与GH 双重免疫荧光标记染色(间接法) (1)石蜡切片,厚5μm,常规二甲苯脱 蜡,梯度酒精水化,入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)
操作举例：垂体腺瘤----ACTH与GH 双重免疫荧光标记染色（间接法） (1)石蜡切片，厚5µ m，常规二甲苯脱 蜡，梯度酒精水化，入PBS(pH7.4, 0.01mol/L)