仪器分析及其实验技术 讲义提纲 1引言 1.1光分析 1.1.1光的性质和光谱仪器的分类 光谱方法:基于测量辐射的波长和强度,每一个参数值对应于每一组分色,所记录的辐射值。 利用电磁辐射的本质,有:分子光谱、原子光谱法。根据辐射能传递方式,分为发射光谱 吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。 非光谱方法:利用电磁辐射与物质的相互作用,引起电磁辐射在方向上的改变,或物理性质 的变化,有:折射、反射、散射、干涉、衍射、偏振 光波、波长、频率、能量与光谱仪器的关系 能量100-1Mev1Kev-104cm12500033cm-1-1cm-1 波长46×105nm 光区X射线紫外 可见 红外 微波、射频 仪器X光谱仪紫外光谱仪 可见光谱仪 红外光谱仪 核磁共振谱仪 跃迁电子间跃迁外电子跃迁外电子跃迁分子振动 分子转动和自旋 光的物理性质和光谱仪器的关系 原子光谱 分子光谱 发射光谱发射光谱仪、 ICP-AES、原子荧光荧光、磷光、化学发光 吸收光谱 原子吸收 紫外可见、红外、拉曼 1.12光谱仪器框图 光源—被测物质—单色仪—信号接收—处理 1.1.3定性分析和定量分析依据 定性:波长 定量:光强 1.14有机四大谱 质谱、核磁共振、红外、紫外-可见 特别指出,质谱仪被列为光谱仪器,实为以质荷比为分析基础的仪器 12分离分析 色谱法也称之为色层法或层析法,利用混合物中各组份在两相间分配系数的差别,当两相做 相对移动时,各组份在两相间进行多次分配,从而使各组份得到分离。 1.2.1气相色谱
1 仪器分析及其实验技术 讲义提纲 1 引言 1.1 光分析 1.1. 1 光的性质和光谱仪器的分类 光谱方法：基于测量辐射的波长和强度，每一个参数值对应于每一组分色，所记录的辐射值。 利用电磁辐射的本质，有：分子光谱、原子光谱法。根据辐射能传递方式，分为发射光谱、 吸收光谱、荧光光谱、拉曼光谱等。 非光谱方法：利用电磁辐射与物质的相互作用，引起电磁辐射在方向上的改变，或物理性质 的变化，有：折射、反射、散射、干涉、衍射、偏振。 光波、波长、频率、能量与光谱仪器的关系 能量 100-1Mev 1Kev-104cm-1 25000-33 cm-1 -1cm-1 1cm-1 波长 14nm 13.6-400nm 400-800nm 800-4.6105nm 4.6105nm 光区 X 射线 紫外 可见 红外 微波、射频 仪器 X 光谱仪 紫外光谱仪 可见光谱仪 红外光谱仪 核磁共振谱仪 跃迁 电子间跃迁 外电子跃迁 外电子跃迁 分子振动 分子转动和自旋 光的物理性质和光谱仪器的关系 原子光谱 分子光谱 发射光谱 发射光谱仪、ICP-AES、原子荧光 荧光、磷光、化学发光 吸收光谱 原子吸收 紫外-可见、红外、拉曼 1.1.2 光谱仪器框图 光源 被测物质 单色仪 信号接收 处理 1.1.3 定性分析和定量分析依据 定性：波长 定量：光强 1.1.4 有机四大谱 质谱、核磁共振、红外、紫外-可见 特别指出，质谱仪被列为光谱仪器，实为以质荷比为分析基础的仪器。 1.2 分离分析 色谱法也称之为色层法或层析法，利用混合物中各组份在两相间分配系数的差别，当两相做 相对移动时，各组份在两相间进行多次分配，从而使各组份得到分离。 1.2.1 气相色谱
物质以气态被分离,流动相为气体。 22液相色谱 物质以液态被分离,流动相为液体。 123高效毛细管电泳 与液相色谱相辅 124其他色谱方法 纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、超临界流体色谱 2.5定性定量分析依据 定性:保留时间或特效检出 定量:峰高或峰面积 1.3电分析 电分析法通过电化学体系在特定条件下,电势、电流、电容及阻抗的变化来研究电化学体系 的特征、浓度、温度、反应速度等。 1.3.1电化学基本概念 原电池 13.2电分析仪器的分类 A电势法,在电流约为零下测电势,包括:电位测定法和电位滴定法 B库仑法,测量电解电量,包括:恒电流库仑法、恒电势库仑法和电重量法 C伏安法,恒变电位测电流,包括:极谱法和伏安法 D电导法:测电导 14联用技术 14.1分离仪器-特效检测器的联用 色谱质谱联用:GC-MS、LC-M 色谱红外光谱联用:GC-FTR 色谱-原子光谱联用:LC-AAS 142自动化系统与分离、检测系统联用 自动进样器 流动注射分析仪 143计算机的应用 自动化系统的控制 数据采集和处理 专家系统和数据库 2
2 物质以气态被分离，流动相为气体。 1.2.2 液相色谱 物质以液态被分离，流动相为液体。 1.2.3 高效毛细管电泳 与液相色谱相辅 1.2.4 其他色谱方法 纸色谱、薄层色谱、凝胶色谱、超临界流体色谱 1.2.5 定性定量分析依据 定性：保留时间或特效检出 定量：峰高或峰面积 1.3 电分析 电分析法通过电化学体系在特定条件下，电势、电流、电容及阻抗的变化来研究电化学体系 的特征、浓度、温度、反应速度等。 1.3.1 电化学基本概念 原电池 1.3.2 电分析仪器的分类 A 电势法，在电流约为零下测电势，包括：电位测定法和电位滴定法 B 库仑法，测量电解电量，包括：恒电流库仑法、恒电势库仑法和电重量法 C 伏安法，恒变电位测电流，包括：极谱法和伏安法 D 电导法：测电导 1.4 联用技术 1.4.1 分离仪器-特效检测器的联用 色谱-质谱联用：GC-MS、LC-MS 色谱-红外光谱联用：GC-FTIR 色谱-原子光谱联用：LC-AAS 1.4.2 自动化系统与分离、检测系统联用 自动进样器 流动注射分析仪 1.4.3 计算机的应用 自动化系统的控制 数据采集和处理 专家系统和数据库
2分光光度法(UvvS) 产生于价电子在电子能级间跃迁的光谱称紫外可见光谱 2.1有机化合物的电子光谱 能吸收UV-ⅥS的原子团或结构系统 本身不吸收,但使生色团的吸收峰向长波方向移动,并增加其吸收强度 红移:某些化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团后,吸收的最大波长向长波移动 这种效应称红移效应,这些基团称向红团 兰移:某些发色团的碳原子端引入一些取代基后,吸收的最大波长向短波方向移动。这种效 应称兰移效应,这些基团称向兰团。 能产生UVⅥS光谱的电子类型 A、形成单键的G电子一原子中的S、Px B、形成双键的π电子一原子中的Py、Pz电子 C、未成键的n电子一原子中的孤对电子 主要讨论的跃迁类型 远紫外一近紫外区 nn元 π*近紫外一可见光区 π*近紫外一可见光区 D、电荷转移跃迁近紫外一可见光区 内氧化一还原过程,使波长增长 配位体场吸收(d—d跃迁)可见光区 22光的吸收定律 朗伯定律A= loglo/lt=KL 当入射光强度和溶液浓度一定时,溶液的吸光度与溶液的厚度成正比。 比尔定律A=cbc(A=abc) 当入射光强度和溶液层厚度一定时,溶液的吸光度与溶液的浓度成j 2.3分光光度计 光源—单色仪一吸收池一检测器 读出 2.3.1光源 A、白炽光源:钨灯、碘钨灯波长:320-2500nm B、气体放电光源:氢灯、氘灯波长:200-350nm 232单色器 射狭缝、出射狭缝,各种透镜或反射镜,控制带宽 色散元件:棱镜或光栅,使不同波长的光以不同角度传播 光栅原理: A、衍射角与入射波长有关
3 2 分光光度法（UV-VIS） 产生于价电子在电子能级间跃迁的光谱称紫外-可见光谱 2.1 有机化合物的电子光谱 生色团：能吸收 UV-VIS 的原子团或结构系统 助色团：本身不吸收，但使生色团的吸收峰向长波方向移动，并增加其吸收强度 红移：某些化合物经取代反应引入含有未共享电子对的基团后，吸收的最大波长向长波移动， 这种效应称红移效应，这些基团称向红团。 兰移；某些发色团的碳原子端引入一些取代基后，吸收的最大波长向短波方向移动。这种效 应称兰移效应，这些基团称向兰团。 能产生 UV-VIS 光谱的电子类型 A、 形成单键的电子—-原子中的 S、Px B、 形成双键的电子—-原子中的 Py、Pz 电子 C、 未成键的 n 电子—-原子中的孤对电子 主要讨论的跃迁类型 A、 n * 远紫外—近紫外区 B、 n * 近紫外—可见光区 C、 * 近紫外—可见光区 D、电荷转移跃迁 近紫外—可见光区 内氧化—还原过程，使波长增长 E、配位体场吸收（d d 跃迁） 可见光区 2.2 光的吸收定律 朗伯定律 A = logI0 /It = KL 当入射光强度和溶液浓度一定时，溶液的吸光度与溶液的厚度成正比。 比尔定律 A = bc (A = abc) 当入射光强度和溶液层厚度一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度成正比。 2.3 分光光度计 光源 单色仪 吸收池 检测器 读出 2.3.1 光源 A、白炽光源：钨灯、碘钨灯 波长：320-2500nm B、气体放电光源：氢灯、氘灯 波长：200-350nm 2.3.2 单色器 入射狭缝、出射狭缝，各种透镜或反射镜，控制带宽 色散元件：棱镜或光栅，使不同波长的光以不同角度传播 光栅原理： A、 衍射角与入射波长有关
B、分辨率与光栅刻度成正比 C、亮度随光栅上的总条纹数增加而增加 闪耀光栅:利用光栅槽面的平面反射作用,使衍射光集中到某一角度范围内,因而在某一角 度观察时,可得到特别明亮的光谱。适当选择线角度,可使闪耀角定向到所需的光域。 233吸收池 比色皿,玻璃(可见)、石英(可见、紫外) 234检测器 将光信号转化成电信号 光电管,光电倍增管,光伏电池 235读出系统 百分透光率T%,吸光度A 24定量分析 A=ebc ε值小时,须使被测物质与显色剂生成颜色较深的有色物质而进行测定。显色剂多为络合剂。 方法: A、标准曲线法 B、多组分混合物的同时测定 C、差示分光光度法 2.5实验技术 A、吸收波长的选择:绘制吸收光谱图 B、比尔定律的范围:A=0.2-0.8为佳,测量误差小 C、吸收池的校正。同一组池相互间的吸光度差值<0.5% 仪器的调整:波长的校正 D、试样的处理、显色 混浊溶液引起散射,正偏差,须过滤或离心 仪器操作 3荧光光度法 分子荧光:分子价电子跃迁 原子荧光:原子外层电子跃迁 X一荧光:原子内层电子跃迁 3.1荧光的产生 分子在辐射能的照射下,电子跃迁至单重激发态,并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态 的最低振动能级,由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光 基态和激发态 单重态和三重态:单重态的分子具有抗磁性,三重态的分子有顺磁性 跃迁分为:辐射跃迁(光)和无辐射跃迁(热) 必要条件: A、有吸收结构
4 B、 分辨率与光栅刻度成正比 C、 亮度随光栅上的总条纹数增加而增加 闪耀光栅：利用光栅槽面的平面反射作用，使衍射光集中到某一角度范围内，因而在某一角 度观察时，可得到特别明亮的光谱。适当选择线角度，可使闪耀角定向到所需的光域。 2.3.3 吸收池 比色皿，玻璃（可见）、石英（可见、紫外） 2.3.4 检测器 将光信号转化成电信号 光电管，光电倍增管，光伏电池 2.3.5 读出系统 百分透光率 T%，吸光度 A 2.4 定量分析 A = bc 值小时，须使被测物质与显色剂生成颜色较深的有色物质而进行测定。显色剂多为络合剂。 方法： A、 标准曲线法 B、 多组分混合物的同时测定 C、 差示分光光度法 2.5 实验技术 A、 吸收波长的选择：绘制吸收光谱图 B、 比尔定律的范围：A = 0.2-0.8 为佳，测量误差小 C、 吸收池的校正。同一组池相互间的吸光度差值0.5% 仪器的调整：波长的校正 D、 试样的处理、显色 混浊溶液引起散射，正偏差，须过滤或离心 E、仪器操作 3 荧光光度法 分子荧光：分子价电子跃迁 原子荧光：原子外层电子跃迁 X—荧光：原子内层电子跃迁 3.1 荧光的产生 分子在辐射能的照射下，电子跃迁至单重激发态，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态 的最低振动能级，由此再跃回基态或基态中其它振动能级时所发出的光。 基态和激发态 单重态和三重态：单重态的分子具有抗磁性，三重态的分子有顺磁性 跃迁分为：辐射跃迁（光）和无辐射跃迁（热） 必要条件： A、 有吸收结构
B、入射光频率=特征频率 C、有高的荧光效率 3.2荧光光谱曲线 激发光谱:固定发射波长,改变激发波长,测荧光强度和激发光波长的关系 荧光光谱:固定激发波长为最大激发波长处,测不同波长时的荧光强度 选择合适的激发波长(根据物质激发光谱曲线来确定),固定激发光波长,然后测定不同波长 时所发射的荧光强度 33荧光的影响因素 A、荧光效率(量子产率)φ 小9=发射荧光的分子数/激发分子总数 分子结构 是否有共轭双键体系,共轭高,荧光效率高 是否有刚性平面结构,刚性平面使荧光效率高 取代基类型,给电子基团使荧光增强,吸电子基团使荧光减弱 C、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强 含重原子的溶剂( e.g. CBr4)使荧光减弱 D、荧光猝灭 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用,使能量转移,荧光强度减弱甚至消失 E、温度影响 温度上升,荧光减弱 34定量分析 F=pKlOCL =KCL q莢光效率,K:仪器常数,C:浓度,lo:吸收光强 分光法与荧光法定量比较 UVS分光法 荧光法 定量基础 A=lglo/l F∝C 两个较大信号o和I的微小差别叠加在很小背景值上的荧光信号 灵敏度 与ε有关 与qE有关 检测限 10-6-10 3.5荧光光度计 与UVVS的两个差异 A、90°角接收光信号—一去除透射 B、两个单色器(激发单色器、发射单色器)—去除杂散光
5 B、 入射光频率=特征频率 C、 有高的荧光效率 3.2 荧光光谱曲线 激发光谱：固定发射波长，改变激发波长，测荧光强度和激发光波长的关系。 荧光光谱：固定激发波长为最大激发波长处，测不同波长时的荧光强度。 选择合适的激发波长（根据物质激发光谱曲线来确定），固定激发光波长，然后测定不同波长 时所发射的荧光强度 3.3 荧光的影响因素 A、荧光效率（量子产率） = 发射荧光的分子数 / 激发分子总数 B、分子结构 是否有共轭双键体系，共轭高，荧光效率高 是否有刚性平面结构，刚性平面使荧光效率高 取代基类型，给电子基团使荧光增强，吸电子基团使荧光减弱 C、溶剂的影响 增大溶剂的极性使荧光增强 含重原子的溶剂（e.g. CBr4）使荧光减弱 D、荧光猝灭 激发分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用，使能量转移，荧光强度减弱甚至消失 E、温度影响 温度上升，荧光减弱 3.4 定量分析 F = KI0CL = K’CL :荧光效率，K：仪器常数，C：浓度，I0：吸收光强 分光法与荧光法定量比较 UV-VIS 分光法 荧光法 定量基础 A = lgI0 /I F C 两个较大信号 I0 和 I 的微小差别 叠加在很小背景值上的荧光信号 灵敏度 与 有关 与 有关 检测限 10-6-10-9 10- 9-10- 12 3.5 荧光光度计 与 UV-VIS 的两个差异： A、 90角接收光信号——去除透射 B、两个单色器（激发单色器、发射单色器）——去除杂散光
3.51光源 白炽灯:钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯:氢、氙、汞,常用氙灯(波长:200-700nm) C、激光光源 3.52单色器 闪耀光栅 3.53检测器 光电倍增管 36实验技术 36.1经常用标准基准物质校正仪器波长 362选择溶剂 由于偶极、氢键作用,激发光谱和发射光谱发生位移.增大溶剂极性可使荧光强度增强 363浓度效应(内滤效应) 荧光物质浓度大时,光强与浓度不成线性关系。原因:A、发光集中在一边B、自吸收效应 3.64温度的影响 低温荧光 3.7荧光法的应用 同步荧光法 对多组分的测定 混合物荧光光谱比较复杂不易分开。使激发和发射光波长保持一固定差距,对试样进行扫描, 获得荧光信号。因为激发和发射光谱均一样的物质不多,因而可提高选择性和分辨率。 例如,对环境样品中PAH的同步荧光测定 4磷光和发光光度法 4.1磷光 4.1.1磷光的产生和磷光光谱 激发态电子由第一激发单重态的最低振动能级以系间窜跃方式转至第一激发三重态,再经过 振动弛豫,转至其最低振动能级,由此激发态跃回至基态时,便发射磷光 固定激发光波长为其最大处,测不同波长下的磷光强度,得磷光光谱曲线。 磷光的产生涉及到激发单重态经系间窜跃转至激发三重态(S T1)和由激发三重态经 禁阻跃迁回到基态(T1S0),在动力学上处于不利的情况,所以很容易受其他辐射或无辐射 跃迁的干扰而使磷光强度减弱,甚至完全消失。T1S0跃迁过程是自旋禁阻的,其发光速率 较慢,约为10-4100s,强度相对较弱
6 3.5.1 光源 A、白炽灯：钨灯、卤钨灯 B、气体放电灯：氢、氙、汞，常用氙灯（波长：200-700nm） C、激光光源 3.5.2 单色器 闪耀光栅 3.5.3 检测器 光电倍增管 3.6 实验技术 3.6.1 经常用标准基准物质校正仪器波长 3.6.2 选择溶剂 由于偶极、氢键作用，激发光谱和发射光谱发生位移．增大溶剂极性可使荧光强度增强 3.6.3 浓度效应（内滤效应） 荧光物质浓度大时，光强与浓度不成线性关系。原因：A、发光集中在一边 B、自吸收效应 3.6.4 温度的影响 低温荧光 3.7 荧光法的应用 同步荧光法 对多组分的测定 混合物荧光光谱比较复杂不易分开。使激发和发射光波长保持一固定差距，对试样进行扫描， 获得荧光信号。因为激发和发射光谱均一样的物质不多，因而可提高选择性和分辨率。 例如，对环境样品中 PAH 的同步荧光测定 4 磷光和发光光度法 4.1 磷光 4.1.1 磷光的产生和磷光光谱 激发态电子由第一激发单重态的最低振动能级以系间窜跃方式转至第一激发三重态，再经过 振动弛豫，转至其最低振动能级，由此激发态跃回至基态时，便发射磷光。 固定激发光波长为其最大处，测不同波长下的磷光强度，得磷光光谱曲线。 磷光的产生涉及到激发单重态经系间窜跃转至激发三重态（S1 T1）和由激发三重态经 禁阻跃迁回到基态（T1 S0），在动力学上处于不利的情况，所以很容易受其他辐射或无辐射 跃迁的干扰而使磷光强度减弱，甚至完全消失。T1 S0 跃迁过程是自旋禁阻的，其发光速率 较慢，约为 10-4—100S，强度相对较弱
41.2磷光的定性和定量分析 类同于荧光的定性和定量分析 定性:磷光光谱图 定量:工作曲线法 4.1.3磷光计 与荧光计相似,在荧光计中,可以配上磷光分析附件。 区别 A、液槽,低温装置 B、斩波片,为了区别磷光和荧光 4.14磷光实验技术 A、低温磷光法,置样品于液氮中,减少质点间的碰撞几率,以减少无辐射跃迁。 B、固体磷光法,可将溶剂除去,在薄层色谱板上进行斑点磷光分析。 C、形成分子缔合物,表面活性剂与被测物质形成胶束缔合物,可增强刚性,减少因碰撞而 引起的能量损失 D、重原子效应,在含有重原子的溶剂如碘乙烷中,有利于系间窜跃,即S1T1跃迁 使磷光得到加强。 E、敏化磷光,分析物质的激发三重态T1将能量转移至能量受体的激发三重态T1,然后当 受体从T1跃回至基态So时,产生磷光。这种分析方法中,分析物本身不发磷光,而是 引发受体发磷光 4.2化学发光 由化学反应激发物质电子所产生的光辐射 42.1化学发光的基本原理 化学反应提供能量使电子激发。激发态跃迁回基态时发出一定波长的光 必要条件: A、化学反应放出足够能量 B、能量用于产生激发态分子 C、有一定化学发光效率 42.2化学发光的定量分析 qC=发射光子数/参加反应的分子数 42.3鲁米诺一过氧化氢体系 在碱性介质中,过氧化氢氧化鲁米诺,经不稳定桥式六元环过氧化物,形成激发态氨基苯二 甲酸离子,经辐射光能转化成一般的氨基苯二甲酸盐 该反应可被一些痕量的过渡族金属离子(Co,Cu,NiCr,Fe)所催化,或被一些金属离子(AgTi, Ce,Th)猝灭,可用于这些离子的检出
7 4.1.2 磷光的定性和定量分析 类同于荧光的定性和定量分析 定性：磷光光谱图 定量：工作曲线法 4.1.3 磷光计 与荧光计相似，在荧光计中，可以配上磷光分析附件。 区别： A、液槽，低温装置 B、斩波片，为了区别磷光和荧光 4.1.4 磷光实验技术 A、 低温磷光法，置样品于液氮中，减少质点间的碰撞几率，以减少无辐射跃迁。 B、 固体磷光法，可将溶剂除去，在薄层色谱板上进行斑点磷光分析。 C、 形成分子缔合物，表面活性剂与被测物质形成胶束缔合物，可增强刚性，减少因碰撞而 引起的能量损失。 D、 重原子效应，在含有重原子的溶剂如碘乙烷中，有利于系间窜跃，即 S1 T1 跃迁， 使磷光得到加强。 E、敏化磷光，分析物质的激发三重态 T1 将能量转移至能量受体的激发三重态 T’1，然后当 受体从 T’1 跃回至基态 S’0 时，产生磷光。这种分析方法中，分析物本身不发磷光，而是 引发受体发磷光。 4.2 化学发光 由化学反应激发物质电子所产生的光辐射 4.2.1 化学发光的基本原理 化学反应提供能量使电子激发。激发态跃迁回基态时发出一定波长的光。 必要条件： A、 化学反应放出足够能量 B、 能量用于产生激发态分子 C、 有一定化学发光效率 4.2.2 化学发光的定量分析 Cl = 发射光子数 / 参加反应的分子数 4.2.3 鲁米诺—过氧化氢体系 在碱性介质中，过氧化氢氧化鲁米诺，经不稳定桥式六元环过氧化物，形成激发态氨基苯二 甲酸离子，经辐射光能转化成一般的氨基苯二甲酸盐。 该反应可被一些痕量的过渡族金属离子（Co, Cu, Ni, Cr, Fe）所催化，或被一些金属离子(Ag, Ti, Ce, Th)猝灭，可用于这些离子的检出
424发光的测量仪器 A、进样装置和反应装置,样品和试剂混合 B、检测器,光电倍增管 C、读出装置,显示屏,记录仪 4.3生物发光 生物体内的生物化学反应产生的发光 4.3.1酶促反应+发光反应 磷酸腺苷的测定:在荧光素酶和镁作用下,AP和荧光素反应,生成磷酸腺苷AM荧光 素和荧光素酸的复合物,复合物与氧反应,产生化学发光。 4.3.2细菌发光 明亮发光杆菌的发光反应:FMNH2和FMN之间的转化起到了传递氢的作用,FMNH2分子 中有两个NH-基,易于其它分子形成氢键。毒物分子可能与FMNH2分子发生氢键结合,阻碍了 氢的传递过程,从而干扰了正常的发光反应,致使发光减弱。 43.3生物发光检测仪器 同化学发光
8 4.2.4 发光的测量仪器 A、 进样装置和反应装置，样品和试剂混合 B、 检测器，光电倍增管 C、 读出装置，显示屏，记录仪 4.3 生物发光 生物体内的生物化学反应产生的发光 4.3.1 酶促反应+发光反应 三磷酸腺苷的测定：在荧光素酶和镁作用下，ATP 和荧光素反应，生成磷酸腺苷 AMP 荧光 素和荧光素酸的复合物，复合物与氧反应，产生化学发光。 4.3.2 细菌发光 明亮发光杆菌的发光反应：FMNH2 和 FMN 之间的转化起到了传递氢的作用，FMNH2 分子 中有两个-NH-基，易于其它分子形成氢键。毒物分子可能与 FMNH2 分子发生氢键结合，阻碍了 氢的传递过程，从而干扰了正常的发光反应，致使发光减弱。 4.3.3 生物发光检测仪器 同化学发光
5红外吸收光谱法 51基本原理 分子的振动—转动光谱。研究在振动中伴有偶极距变化的化合物(无偶极距变化的为拉曼光 谱)。 偶极距:两个电荷中,一个电荷的电量与这两个电荷间的距离的乘积。分子中的正负电荷排 列不对称,就会引起电性不对称。使分子的一部分有较显著的阳性,另一部分有较显著的阴性 5.1.1双原子分子的振动 谐振子振动和非谐振子振动 512多原子分子的振动 伸缩振动νs:原子沿着价键方向来回运动,键长变,键角不变。 剪式振动δs 面内变形振动 平面摇摆振动p 变形振动键长不变,键角变 面外变形振动 非平面摇摆o 扭曲振动τ 51.3基本振动的理论数 理论上,一个振动自由度产生一个基频吸收带。实际上,红外谱峰数小于理论值。 原因 A、无偶极距变化的无红外吸收 B、相同频率的吸收重叠即简并 C、仪器的检测能力和范围限制 5.1.4基团频率和特征吸收峰 组成分子的各种基团,有特定的红外吸收频率和吸收峰。 官能团区;40001300cm-1伸缩振动 指纹区:1300600cm-1单键伸缩,变形振动 未知物结构不饱和度的计算:9=1+N4+(N3-N1)/2 52色散型红外光谱仪 光源—狭缝—样品池—单色仪—检测器—读出 521光源 碳棒、能斯特灯 522单色器 光栅
9 5 红外吸收光谱法 5.1 基本原理 分子的振动—转动光谱。研究在振动中伴有偶极距变化的化合物（无偶极距变化的为拉曼光 谱）。 偶极距：两个电荷中，一个电荷的电量与这两个电荷间的距离的乘积。分子中的正负电荷排 列不对称，就会引起电性不对称。使分子的一部分有较显著的阳性，另一部分有较显著的阴性。 5.1.1 双原子分子的振动 谐振子振动和非谐振子振动 5.1.2 多原子分子的振动 伸缩振动s ： 原子沿着价键方向来回运动，键长变，键角不变。 剪式振动 s 面内变形振动 平面摇摆振动 变形振动 键长不变，键角变。 面外变形振动 非平面摇摆 扭曲振动 5.1.3 基本振动的理论数 理论上，一个振动自由度产生一个基频吸收带。实际上，红外谱峰数小于理论值。 原因： A、 无偶极距变化的无红外吸收 B、 相同频率的吸收重叠即简并 C、 仪器的检测能力和范围限制 5.1.4 基团频率和特征吸收峰 组成分子的各种基团，有特定的红外吸收频率和吸收峰。 官能团区；4000-1300cm-1 伸缩振动 指纹区：1300-600 cm-1 单键伸缩，变形振动 未知物结构不饱和度的计算: = 1 + N4 + (N3 – N1) / 2 5.2 色散型红外光谱仪 光源 狭缝 样品池 单色仪 检测器 读出 5.2.1 光源 硅碳棒、能斯特灯 5.2.2 单色器 光栅
52.3检测器:高真空热电偶 测热辐射计、高莱池气胀式检测器 光电导检测器(FT) 53富里叶变换红外光谱仪 干涉器:迈克尔逊干涉仪 由光源发出的两束光,经过不同路程后再聚到一点上,发生干涉。当两束光的光程差为入/2 的偶数倍时,相干光相互叠加,产生明线,其相干光强有最大值。相反,当两束光的光程差为入2 的奇数倍时,相干光相互抵消,产生暗线,相干光强有最小值。干涉强度对光程差S或时间T的 函数图称干涉图。 干涉图得到的时间域(光程差)的信息,可以反映频率域的问题。实际上干涉仪并没有把光 按频率分开,而只是将各种频率的光信号经干涉作用调制为干涉图函数,再由计算机进行富里叶 逆变换计算出原来的光谱 迈克尔逊干涉仪的工作原理 动镜在动,使所有波长的光都有相加强和相消弱的机会。动镜的一次来回,就得到所有频率 的一次信息,这同光栅的一次扫描全过程得到的信息是一样的。由于样品吸收了其中某些频率的 能量,使得干涉图的强度发生变化。通过富里叶数学变换而不是通过逐点测量而得到连续光谱 54定性分析 在官能团区搜寻官能团的特征伸缩振动,根据“指纹区”的吸收情况,进一步确认 55实验技术 A、样品的制备 气体—气槽液体—液膜(选择溶剂)固体—压片(KBr) B、注意防潮 在红外灯下准备样品 56应用举例 A、石油烃的指纹鉴定 B、有害气体的红外线分析仪 测定碳氧化物、硫化物等
10 5.2.3 检测器：高真空热电偶 测热辐射计、高莱池气胀式检测器 光电导检测器（FT） 5.3 富里叶变换红外光谱仪 干涉器：迈克尔逊干涉仪 由光源发出的两束光，经过不同路程后再聚到一点上，发生干涉。当两束光的光程差为/2 的偶数倍时，相干光相互叠加，产生明线，其相干光强有最大值。相反，当两束光的光程差为/2 的奇数倍时，相干光相互抵消，产生暗线，相干光强有最小值。干涉强度对光程差 S 或时间 T 的 函数图称干涉图。 干涉图得到的时间域（光程差）的信息，可以反映频率域的问题。实际上干涉仪并没有把光 按频率分开，而只是将各种频率的光信号经干涉作用调制为干涉图函数，再由计算机进行富里叶 逆变换计算出原来的光谱。 迈克尔逊干涉仪的工作原理： 动镜在动，使所有波长的光都有相加强和相消弱的机会。动镜的一次来回，就得到所有频率 的一次信息，这同光栅的一次扫描全过程得到的信息是一样的。由于样品吸收了其中某些频率的 能量，使得干涉图的强度发生变化。通过富里叶数学变换而不是通过逐点测量而得到连续光谱。 5.4 定性分析 在官能团区搜寻官能团的特征伸缩振动，根据“指纹区”的吸收情况，进一步确认。 5.5 实验技术 A、样品的制备 气体 气槽 液体 液膜（选择溶剂） 固体 压片（KBr） B、注意防潮 在红外灯下准备样品 5.6 应用举例 A、 石油烃的指纹鉴定 B、 有害气体的红外线分析仪 测定碳氧化物、硫化物等