《观赏植物采后生理与技术》课程教学资源（教案讲义）第一章观赏植物采后生理概论第3节切花开花和衰老生理.pdf_大学文库

1.3切花开花和衰老生理 1.3.1切花开花和衰老的概念 1)切花开花切花一般是在花蕾期采切，切花开花(opening)是指鲜花采切后花朵的开放过程。被子植物的花有的是单生，但多数是花序。花序可分为无限花序和有限花序两大类。无限花序的小花开放服序是由花序基部向上依次进行的：当花序轴短缩，各小花密集排列在一个平面或球面时，开花顺序则是由边缘开始向中央依次开放。有限花序最顶点或最中心的花先开，限制了花序轴顶端继续生长，因而以后开花顺序渐及下边或周围。 2)切花衰老衰老(senescence)是指植物个体发有的最后阶段，是导致死亡的衰退过程。自然界中，植物种类繁多，衰老类型也是多种多样的。Leopold(1961)曾提出植物衰老的四种类型：①整株衰老：由于系统生理机能丧失，整株植物衰老死亡；季节性或一年生草本植物多属此种类型。②地上部衰老：由于一定季节的到来，地上部衰老死亡，而后由地下部生长更新：大部分多年生草本和球茎类植物屈此种类型。③落叶衰老：由于季节性胁迫造成所有叶子衰老脱落，而茎和根仍保持生活力：落叶木本植物便属于这种变化。④渐进衰老：生理年龄相对较大的叶片和器官组织逐渐衰老退化或脱落死亡，新的器官和组织逐渐取而代之：大多数多年生木本植物便是如此。这里者重介绍花的衰老。花朵一般由萼片、花瓣（花冠）、雄蕊和雌蕊等组成。花部结构不同，衰老途径和速度也不一样。花瓣寿命一般比较短：而花萼在花裙菱酱或脱落时仍维持正常的生命活动：雌蕊内的胚珠则常在其他花部衰老时发有成为果实。由于各花部结构和生理过程差别较大，所以人们很少把整朵花作为衰老研究的对象，而常取花瓣为研究花衰老的材料。鲜切花是花卉植物体的一部分，虽然离开了母体，但它们是活的有机体，继续者与维持生命有关的呼吸和蒸腾作用等代谢过程，逐渐走向衰老。在商品花卉流通中常以花寿命作为有效寿命的指标：对花瓣衰老及其调控的研究，可为制订延长切花寿命的技术措施提供理论依据。 1.3.2切花开花和衰老进程中的生理生化变化 1)细胞膜的变化花！衰老时细胞膜的结构和功能都会发生一系列的变化。总的米说，衰老时花瓣中膜的流动性减小，透性增加，膜开始从液晶相向凝胶相转变，从而引起衰老组织的物质渗漏，导致花瓣菱蔫。 2)碳水化合物、蛋白质和核酸的变化

1 1.3 切花开花和衰老生理 1.3.1 切花开花和衰老的概念 1）切花开花切花一般是在花蕾期采切，切花开花（opening）是指鲜花采切后花朵的开放过程。被子植物的花有的是单生，但多数是花序。花序可分为无限花序和有限花序两大类。无限花序的小花开放顺序是由花序基部向上依次进行的；当花序轴短缩，各小花密集排列在一个平面或球面时，开花顺序则是由边缘开始向中央依次开放。有限花序最顶点或最中心的花先开，限制了花序轴顶端继续生长，因而以后开花顺序渐及下边或周围。 2）切花衰老衰老（senescence）是指植物个体发育的最后阶段，是导致死亡的衰退过程。自然界中，植物种类繁多，衰老类型也是多种多样的。Leopold（1961）曾提出植物衰老的四种类型：① 整株衰老：由于系统生理机能丧失，整株植物衰老死亡；季节性或一年生草本植物多属此种类型。② 地上部衰老：由于一定季节的到来，地上部衰老死亡，而后由地下部生长更新；大部分多年生草本和球茎类植物属此种类型。③ 落叶衰老：由于季节性胁迫造成所有叶子衰老脱落，而茎和根仍保持生活力；落叶木本植物便属于这种变化。④ 渐进衰老：生理年龄相对较大的叶片和器官组织逐渐衰老退化或脱落死亡，新的器官和组织逐渐取而代之；大多数多年生木本植物便是如此。这里着重介绍花的衰老。花朵一般由萼片、花瓣（花冠）、雄蕊和雌蕊等组成。花部结构不同，衰老途径和速度也不一样。花瓣寿命一般比较短；而花萼在花瓣萎蔫或脱落时仍维持正常的生命活动；雌蕊内的胚珠则常在其他花部衰老时发育成为果实。由于各花部结构和生理过程差别较大，所以人们很少把整朵花作为衰老研究的对象，而常取花瓣为研究花衰老的材料。鲜切花是花卉植物体的一部分，虽然离开了母体，但它们是活的有机体，继续着与维持生命有关的呼吸和蒸腾作用等代谢过程，逐渐走向衰老。在商品花卉流通中常以花瓣寿命作为有效寿命的指标；对花瓣衰老及其调控的研究，可为制订延长切花寿命的技术措施提供理论依据。 1.3.2 切花开花和衰老进程中的生理生化变化 1）细胞膜的变化花瓣衰老时细胞膜的结构和功能都会发生一系列的变化。总的来说，衰老时花瓣中膜的流动性减小，透性增加，膜开始从液晶相向凝胶相转变，从而引起衰老组织的物质渗漏，导致花瓣萎蔫。 2）碳水化合物、蛋白质和核酸的变化

随着衰老，花瓣干重下降，这一方面是因为大分子物质如淀粉、蛋白质和核酸的水解及相应的水解产物重新分配到花的其它部分，另一方面是因为呼吸的消耗。随着淀粉的水解，可溶性糖含量的上升。由于花瓣中蔗糖水解酶保持较高活性，因此，大多数成熟和衰老花瓣中所含的糖主要是还原性糖，而不是蔗糖。 1.3.3切花开花和衰老与乙烯生成 1)切花开花和衰老中乙烯变化类型的划分 a乙烯跃变类型的划分 ①切花的开花和衰老与果实成熟类似呼吸作用变化的时间进程是果实成熟中众多生理生化变化中的一个重要标志，1922年英国科学家Kidd和West研究苹果采后呼吸强度变化时发现，在不同温度条件下，采后呼吸强度都出现上升形成峰形的现象，他们称之为呼吸跃变(respiratory climacteric), Halave©y(1986)建议根据在开花衰老进程中花瓣乙烯的大量生成与否，将花卉植物划分为跃变型和非跃变型两大类。 ②切花乙烯跃变类型的划分乙烯跃变型切花（简称跃变型切花，ethylene climacteric type of cut flowers) 切花在开花和衰老进程中乙烯生成量有突然升高的现象；切花的开花衰老能够由超过阅值的微最乙烯的处理而启动。诱导切花开花和衰老的阀值因切花的种类等略有差异，大多为0.1-0.3ppm: 在跃变前期除去切花环境中的微量乙烯则延缓切花的开花和衰老进程。代表种类为香石竹。非乙烯跃变型切花（简称非跃变型切花ethylene nonclimacteric type of cut fowers) 这种类型的切花的开花和衰老进程与乙烯没有直接的关联，在健全状态下切花开花衰老进程中并不生成具有生理意义的乙烯。但是，在遭到各种胁迫时，也会产生乙烯，并进而对切花的开花和衰老产生影响。代表种类如菊花乙烯末期上升型切花（简称末期上升型切花，ethylene production increasing type at later stage of cut flowers) 末期上升型的切花乙烯生成量随若开花和衰老的进程逐渐升高。代表种类如月季品种‘黄金时代，下面以月季切花为例进行划分，参考kuic等(1991)的标准，将月季切花蕾期至盛开末期划分为6个级数：0级，萼片水平：2级，萼片下垂，花瓣开始松散：3级，初开，外层花舞展开：4 级，盛开，多层花瓣展开，但尚未露心：5级，盛开末期，花朵露心。衰老标准为盛开前提前萎嵩、蓝变或弯头，以及盛开后花瓣翻卷萎或下垂、花朵弯头等。近年来，通过对14个切花月季品种不同开花级数花朵乙烯的生产量的测定，以明确了月季切

2 随着衰老，花瓣干重下降，这一方面是因为大分子物质如淀粉、蛋白质和核酸的水解及相应的水解产物重新分配到花的其它部分，另一方面是因为呼吸的消耗。随着淀粉的水解，可溶性糖含量的上升。由于花瓣中蔗糖水解酶保持较高活性，因此，大多数成熟和衰老花瓣中所含的糖主要是还原性糖，而不是蔗糖。 1.3.3 切花开花和衰老与乙烯生成 1）切花开花和衰老中乙烯变化类型的划分 a 乙烯跃变类型的划分 ① 切花的开花和衰老与果实成熟类似呼吸作用变化的时间进程是果实成熟中众多生理生化变化中的一个重要标志，1922 年英国科学家 Kidd 和 West 研究苹果采后呼吸强度变化时发现，在不同温度条件下，采后呼吸强度都出现上升形成峰形的现象，他们称之为呼吸跃变（respiratory climacteric）。 Halavey（1986）建议根据在开花衰老进程中花瓣乙烯的大量生成与否，将花卉植物划分为跃变型和非跃变型两大类。 ② 切花乙烯跃变类型的划分乙烯跃变型切花（简称跃变型切花, ethylene ethylene ethylene ethylene climacteric climacteric climacteric climacteric type of cut flowers flowers flowers flowers）切花在开花和衰老进程中乙烯生成量有突然升高的现象；切花的开花衰老能够由超过阈值的微量乙烯的处理而启动。诱导切花开花和衰老的阈值因切花的种类等略有差异，大多为 0.1-0.3ppm；在跃变前期除去切花环境中的微量乙烯则延缓切花的开花和衰老进程。代表种类为香石竹。非乙烯跃变型切花（简称非跃变型切花, ethylene ethylene ethylene ethylene nonclimacteric nonclimacteric nonclimacteric nonclimacteric type of cut flowers flowers flowers flowers）这种类型的切花的开花和衰老进程与乙烯没有直接的关联，在健全状态下切花开花衰老进程中并不生成具有生理意义的乙烯。但是，在遭到各种胁迫时，也会产生乙烯，并进而对切花的开花和衰老产生影响。代表种类如菊花。乙烯末期上升型切花（简称末期上升型切花, ethylene ethylene ethylene ethylene production production production production increas increas increas increasing type at later stage of cut flowers flowers flowers flowers）末期上升型的切花乙烯生成量随着开花和衰老的进程逐渐升高。代表种类如月季品种‘黄金时代’。下面以月季切花为例进行划分，参考 kuiper 等（1991）的标准，将月季切花蕾期至盛开末期划分为 6 个级数：0 级，萼片水平；2 级，萼片下垂，花瓣开始松散；3 级，初开，外层花瓣展开；4 级，盛开，多层花瓣展开，但尚未露心；5 级，盛开末期，花朵露心。衰老标准为盛开前提前萎蔫、蓝变或弯头，以及盛开后花瓣翻卷萎蔫或下垂、花朵弯头等。近年来，通过对 14 个切花月季品种不同开花级数花朵乙烯的生产量的测定，以明确了月季切

欧洲荚迷 0 注：0乙烯气体处理和对照(0mgL-1)之问没有差异 ·乙烯气体处理产生不明显的伤害，瓶插寿命比对照省短10% ··乙烯气体处理产生伤害，瓶插寿命比对照缩短2050% ·······乙烯气体处理，对花材伤害明显 1.3.4乙烯的生物合成 1)乙烯的生物合成 a乙烯生物合成的途径植物组织中乙烯的生物合成是在严密的代谢控制下进行的，并由诱导因子如切花衰老和果实成熟所启动。切花的乙烯生物合成和其他高等植物一样，根据生成量的大小和性质可以划分为微量乙烯(System I-乙烯)和大量乙烯(System-乙烯)。所谓微量乙烯指的是非跃变型花卉或跃变型花卉在跃变前期所释放出的微量乙烯，而大量乙烯指的是跃变型花卉在跃变后期所释放出的大量乙烯。当System乙烯达到一定程度会诱导System II-乙烯生成，进而启动跃变型切花的整个衰老进程(Ga0等，1992). 在SystemⅡ-乙烯的生物合成中，前体蛋氨酸(Met)是由Liberman于l966年在苹果上首次证实的(Yang和Hoffman,1984)。1979年Yang和Adams利用乙烯生物合成过程中需氧这一特征，给苹果饲喂L-Mt-14C,追踪其在空气和氮气中的代谢，巧妙地证明了1-氨基环丙烷-1-羧酸 (ACC)是乙烯生物合成的直接前体物质。接着他们又开发了简便、高精度的ACC含量测定方法 (Lizada,Yang,1979)。目前应用的方法在此基础上有所改进(Nieder等，1986)。 b乙烯生物合成的主要酶类 ①ACC合成薛(ACC synthase,.ACS Adams和Yang(1979)阐明ACC是乙烯生物合成的直接前体后，Boller等(1979)和 Yu(1979)分别从番茄果肉组织匀浆中首次证明了ACC合成酶的存在。该酶是可溶性醇，存在于细胞质中(Adam和Yang,1979:Kende,1979),酶Km值为13μmoln,需磷酸吡哆醛作为轴基，能被AVG(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸，Ki-O.2 umol/1)、AOA(氨基氧乙酸，K=-0.2 umol/)抑制。ACC合成酵是一种以磷酸t哆醛为辅基的酶，对底物SAM(S-腺苷蛋氨酸)的磺酰中心和蛋氨酸半体的a-碳具有立体专一性(Khani-Oskonee等，1985)，在乙烯合成过程中起关键作用，是乙烯生物合成的限速酶。高浓度的SAM对ACC合成酶具有抑制作用(Boler等，1979：Nakajima 等，1986，Satoh和Yang,1989)。ACC合成酶在多数情况下限制乙烯的生成速度，当受到生长素诱导和各种促进乙烯生成的胁迫因子作用时，其活性会得到相应提高(Yang和Hoffman,. 1984)。 6

6 注：0 乙烯气体处理和对照（0mg.L-1）之间没有差异 · 乙烯气体处理产生不明显的伤害，瓶插寿命比对照缩短 10% ·· 乙烯气体处理产生伤害，瓶插寿命比对照缩短 20-50% ···/···· 乙烯气体处理，对花材伤害明显 1.3.4 乙烯的生物合成 1）乙烯的生物合成 a 乙烯生物合成的途径植物组织中乙烯的生物合成是在严密的代谢控制下进行的，并由诱导因子如切花衰老和果实成熟所启动。切花的乙烯生物合成和其他高等植物一样，根据生成量的大小和性质可以划分为微量乙烯（System I-乙烯）和大量乙烯（System II-乙烯）。所谓微量乙烯指的是非跃变型花卉或跃变型花卉在跃变前期所释放出的微量乙烯，而大量乙烯指的是跃变型花卉在跃变后期所释放出的大量乙烯。当 System I-乙烯达到一定程度会诱导 System II-乙烯生成，进而启动跃变型切花的整个衰老进程（Gao 等，1992）。在 System II-乙烯的生物合成中，前体蛋氨酸（Met）是由 Liberman 于 1966 年在苹果上首次证实的（Yang 和 Hoffman，1984）。1979 年 Yang 和 Adams 利用乙烯生物合成过程中需氧这一特征，给苹果饲喂 L-Met-14C，追踪其在空气和氮气中的代谢，巧妙地证明了 1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）是乙烯生物合成的直接前体物质。接着他们又开发了简便、高精度的 ACC 含量测定方法（Lizada，Yang，1979）。目前应用的方法在此基础上有所改进（Nieder 等，1986）。 b 乙烯生物合成的主要酶类 ① ACC 合成酶（ACC synthase synthase synthase synthase，ACS） Adams 和 Yang（1979）阐明 ACC 是乙烯生物合成的直接前体后，Boller 等（1979）和 Yu（1979）分别从番茄果肉组织匀浆中首次证明了 ACC 合成酶的存在。该酶是可溶性酶，存在于细胞质中（Adam 和 Yang，1979；Kende,1979），酶 Km 值为 13µmol/l，需磷酸吡哆醛作为辅基，能被 AVG（氨基乙氧基乙烯基甘氨酸，Ki=0.2µmol/l ）、AOA（氨基氧乙酸，Ki=0.2µmol/l）抑制。ACC 合成酶是一种以磷酸吡哆醛为辅基的酶，对底物 SAM（S-腺苷蛋氨酸）的磺酰中心和蛋氨酸半体的а-碳具有立体专一性（Khani-Oskonee 等，1985），在乙烯合成过程中起关键作用，是乙烯生物合成的限速酶。高浓度的 SAM 对 ACC 合成酶具有抑制作用（Boler 等，1979；Nakajima 等，1986，Satoh 和 Yang，1989）。ACC 合成酶在多数情况下限制乙烯的生成速度，当受到生长素诱导和各种促进乙烯生成的胁迫因子作用时，其活性会得到相应提高（Yang 和 Hoffman,， 1984）。欧洲荚迷 0

随者乙烯在果实成熟和鲜切花衰老中作用机理研究的深入，ACC合成酶的纯化和活性表达便成为人们研究的热点之一，但该酶的纯化和定性较为闲难，首先是组织中ACC合成酶的浓度非常低，一般为总蛋白的0.0001%：其次是稳定性差，半寿期短，一般为0-50分钟（刘愚，1992）， AC℃合成酶最初的定性纯化工作是用创伤和LiCI处理，促进番茄果肉组织酶活性条件下进行的(Bomer,.1984,Ramalingman等，1885)。在此基础上Blecker等(1986)，Nakajima和 Imaseki(1986)通过繁殖的步骤获得纯度较高的ACC合成酶，后来Privalle和Grabam(1987), Mhta等(1988)建立的方法虽较为简单，但纯化倍数不高：胡建军等(1995)开发的方法既较为简单，又可获得较高纯度的ACC合成酶。上述不同的实验室分别得到的ACC合成酶分别是分子量不尽相同的多酞，从成熟和伤诱导的番茄果实中纯化ACC合成酶差异较大，分子量依次有 45KD,50KD和67KD等。造成这种差异的可能有：一是纯化过程中蛋白水解酶的剪切作用，这种现象在蛋白酶抑制剂存在的条件下也可能发生(Van Der Streaten,1990:Satoh等，1991)；是翻译后的蛋白酶修饰，蛋白糖基化导致分子量增加：三是ACC合成酶特异性，这一点可能是造成ACC合成酶分子量多态性的主要原因，植物体内可能存在分别与伤诱导、生长素诱导以及与成熟有关ACC合成酶的同工酶(Nakagawa等，1988：Dong等，1991)。香石竹上鉴定ACC合成酶 cARACC3和cARAS分别在花瓣和花柱中表达，说明ACC合成酶的差异性也表现在同一种植物不同的器官水平上(Van Altorst和Boy,1995) 目前己从苹果和番茄等许多植物中克隆了ACC合成酶基因。在花卉上，己从荷兰石竹、兰花、天竺葵、香石竹等提取并鉴定了ACC合成酶基因。被研究的所有植物都存在一个以上的ACC 合成酵基因。克隆的所有ACC合成酶基因的编码区都有一定的同源性，其DNA序列同源性约为 60%,氨基酸序列同源性约为70%。ACC合成酶基因之间存在很大的差异性，这有利于形成多种结构和性质，以适应各种生理条件，受不同生理条件诱导的不同的ACC合成酶基因的5”和3’端非编码区同源性较低，这说明存在不同的调控机理。番茄果实成熟期间表达两种ACC合成酶，编码它们的基因分别是LE-ACC2和LE-ACC4,其中LE-ACC2既与成熟有关，又被创伤诱导，利用LE-ACC2的cDNA构建的反义RNA,导入番茄后，几乎完全抑制上述两个基因的表达。 ②ACC氧化酶(ACCoxidase,ACO) 乙烯形成酶(EFE)又被称作ACC氧化酶(ACO),是乙烯生物合成途径中最后一个酶，催化ACC向乙烯转化，即：ACC+O,+抗坏血酸-C,L+CO,+HCN+脱氢抗坏血酸+2H,O。 AC0对底物具有高度的立体专一性。AC0也存在多种同工酶，编码AC0的基因也是多基因家族。以前由于植物组织一经匀浆，ACC氧化酶活性立即丧失。能影响细胞膜功能的试剂Tritonx- 100、渗透胁迫、磷酸胆碱等都能抑制ACC转化为乙烯。因此，过去一直认为ACC氧化酶要求组织和细胞膜完整性，且可能是膜结合酶(Yang和Hoffman,1984),ACC氧化酶纯化和生化鉴定工作因此而一直停滞不前。对ACC氧化酶取得突破性的认识，来源于与成熟有关的cDNA克隆 ACC氧化酶最初是在凭借果实成熟和伤诱导促进乙烯生成的情况下进行系统查找与定位的。 Amilton等(1991)从与番茄成熟有关的基因克隆中筛选到一个克隆pTOM13并置于花椰菜花叶病毒355RNA启动子的控制之下，通过农杆南转化番茄，获得转基因植株。这种番茄在成熟过程中乙

7 随着乙烯在果实成熟和鲜切花衰老中作用机理研究的深入，ACC 合成酶的纯化和活性表达便成为人们研究的热点之一，但该酶的纯化和定性较为困难，首先是组织中 ACC 合成酶的浓度非常低，一般为总蛋白的 0.0001%；其次是稳定性差，半寿期短，一般为 0-50 分钟（刘愚，1992）。 ACC 合成酶最初的定性纯化工作是用创伤和 LiCl 处理，促进番茄果肉组织酶活性条件下进行的（Boller，1984，Ramalingman 等，1885）。在此基础上 Bleeker 等（1986），Nakajima 和 Imaseki（1986）通过繁殖的步骤获得纯度较高的 ACC 合成酶，后来 Privalle 和 Grabam（1987）， Mehta 等（1988）建立的方法虽较为简单，但纯化倍数不高；胡建军等（1995）开发的方法既较为简单，又可获得较高纯度的 ACC 合成酶。上述不同的实验室分别得到的 ACC 合成酶分别是分子量不尽相同的多酞，从成熟和伤诱导的番茄果实中纯化 ACC 合成酶差异较大，分子量依次有 45KD，50KD 和 67KD 等。造成这种差异的可能有：一是酶纯化过程中蛋白水解酶的剪切作用，这种现象在蛋白酶抑制剂存在的条件下也可能发生（Van Der Streaten，1990；Satoh 等，1991）；二是翻译后的蛋白酶修饰，蛋白糖基化导致分子量增加；三是 ACC 合成酶特异性，这一点可能是造成 ACC 合成酶分子量多态性的主要原因，植物体内可能存在分别与伤诱导、生长素诱导以及与成熟有关 ACC 合成酶的同工酶（Nakagawa 等，1988；Dong 等，1991）。香石竹上鉴定 ACC 合成酶 cARACC3 和 cARAS 分别在花瓣和花柱中表达，说明 ACC 合成酶的差异性也表现在同一种植物不同的器官水平上（Van Altorst 和 Bovy，1995）。目前已从苹果和番茄等许多植物中克隆了 ACC 合成酶基因。在花卉上，已从荷兰石竹、兰花、天竺葵、香石竹等提取并鉴定了 ACC 合成酶基因。被研究的所有植物都存在一个以上的 ACC 合成酶基因。克隆的所有 ACC 合成酶基因的编码区都有一定的同源性，其 DNA 序列同源性约为 60%，氨基酸序列同源性约为 70%。ACC 合成酶基因之间存在很大的差异性，这有利于形成多种结构和性质，以适应各种生理条件。受不同生理条件诱导的不同的 ACC 合成酶基因的 5’和 3’端非编码区同源性较低，这说明存在不同的调控机理。番茄果实成熟期间表达两种 ACC 合成酶，编码它们的基因分别是 LE-ACC2 和 LE-ACC4，其中 LE-ACC2 既与成熟有关，又被创伤诱导。利用 LE-ACC2 的 cDNA 构建的反义 RNA，导入番茄后，几乎完全抑制上述两个基因的表达。 ② ACC 氧化酶（ACC oxidase oxidase oxidase oxidase，ACO）乙烯形成酶（EFE）又被称作 ACC 氧化酶（ACO），是乙烯生物合成途径中最后一个酶，催化 ACC 向乙烯转化，即：ACC + O2 + 抗坏血酸→C2H4 + CO2 + HCN + 脱氢抗坏血酸 + 2H2O。 ACO 对底物具有高度的立体专一性。ACO 也存在多种同工酶，编码 ACO 的基因也是多基因家族。以前由于植物组织一经匀浆，ACC 氧化酶活性立即丧失。能影响细胞膜功能的试剂 Tritonx- 100、渗透胁迫、磷酸胆碱等都能抑制 ACC 转化为乙烯。因此，过去一直认为 ACC 氧化酶要求组织和细胞膜完整性，且可能是膜结合酶（Yang 和 Hoffman，1984），ACC 氧化酶纯化和生化鉴定工作因此而一直停滞不前。对 ACC 氧化酶取得突破性的认识，来源于与成熟有关的 cDNA 克隆。 ACC 氧化酶最初是在凭借果实成熟和伤诱导促进乙烯生成的情况下进行系统查找与定位的。 Amilton 等（1991）从与番茄成熟有关的基因克隆中筛选到一个克隆 pTOM13 并置于花椰菜花叶病毒 355RNA 启动子的控制之下，通过农杆菌转化番茄，获得转基因植株。这种番茄在成熟过程中乙

烯释放被抑制了97%：在伤害处理叶片中，ACC氧化酶活性被抑制了93%。因此人们认为Ptom13 可能与ACC氧化酶有关(Hamilton,l991)。经过校正的Ptoml3在酵母中得到表达，其蛋白质可以象植物一样立体专一地将ACC转化成乙烯(Hamilton,.1991)。Spaua等(1991)利用Ptom13月番茄细胞培养物中克隆了ACC氧化酶cDNA,将其注入爪蟾卵母细胞后，导致爪鹅卵细胞ACC氧化酶的合成。根据pTOM13的核苷酸序列推导出氨基酸序列具有黄烷酮-3羟化酶的同源序列。根据黄烷酮-3-羟化的测定方法，Ververidis和John(1991)首次从甜瓜中分离到了有活性的ACC 氧化酶。在提取过程中，需要加入Fε2+和抗坏血酸，并证实ACC氧化酶是一种类似黄烷酮-3-羟化酶的可溶性酶，进一步研究表明ACC氧化酶是一种依赖于2-酮戊二酸的与双加氧酶类似的酶。 ACC氧化酶不需要酮戊二酯作辅助因子。在一些植物系统中，活体ACC氧化酶活性因CO2处理而提高，但离体ACC氧化酶活性却完全依赖于CO2的存在(Dog等，1992)。该酶Km值为 6 Oumol/L,最适pH为7.5。ACC转化为乙烯的化学反应式如下： ACC+12O,+抗坏血酸 C,H,+CO,+HCN+脱氢抗坏血酸+2HO 目前，在香石竹上克隆了ACC氧化酶的CDNA PSR120。伴随花瓣衰老产生乙烯跃变的同时 pSRI20相应的mRNA也相应增加。香石竹花瓣的ACC氧化酶是可溶性酶(Wang和Woodson 1991:Mariska等，1994)。在天竺葵(Tam-wei和Arteca.1995)、矮牵牛(Wang和Voodson. 1993)、兰科(Nadeau和O'Niell,.1995)中分离鉴定了ACC氧化酶，并且酶基因的表达存在差异性，由此推测ACC氧化酶基因属于多基因家族。此外，ACO的cDNA已被从番茄、苹果等数种不同的植物中分离获得，其氨基酸的同源性高达9O%。Hamilton等用反义ACO RNA抑制了ACO活性。在纯合的转基因番茄果实中，乙烯的形成被抑制了97%。转基因植株果实的者色时间与正常果实基本相同，但着色的速度变慢。贮存在室温下的反义番茄比正常对照果实更耐过熟和皱缩。 2)乙烯生物合成的调节 a乙烯对乙烯生成的调节乙烯对切花乙烯生成的调节，包括乙烯的自我催化(autocatalysis)和乙烯的自我抑制 (autoinhibition)(Yang fl Hoffman,1984)a ①乙烯的自我催化又称为正反馈调节(positive feedback),指乙烯对乙烯生物合成的诱导是跃变型切花衰老和跃变型果实成熟的重要特征(G0等，1994)。Mayak等(1977)用乙烯激活类似物丙烯处理香石竹，增加了乙烯生成量。乙烯处理香石竹花瓣增加了乙烯生成量和ACC含量的积累(Hiroshih等，1990)。Mor等(1985)用乙烯处理香石竹，发现ACC合成酶活性增加了 90-100倍。Woodson等(1992)用乙烯处理未衰老香石竹花瓣，6小时后测得ACC合成南和ACC 氧化酶基因的转录。香石竹花瓣经乙烯处理后，乙烯生成能力增强，处理1小时后测得ACC氧化酶活性增加，约5小时后乙烯生成量开始增加，ACC合成酶活性提高，这都依赖于外源乙烯的存在，用a-鹅膏菌素(a-amanitin)和环己酰亚胺预先处理的花瓣该酶活性会受到部分抑制，由此可

8 烯释放被抑制了 97%；在伤害处理叶片中，ACC 氧化酶活性被抑制了 93%。因此人们认为 Ptom13 可能与 ACC 氧化酶有关（Hamilton,1991）。经过校正的 Ptom13 在酵母中得到表达，其蛋白质可以象植物一样立体专一地将 ACC 转化成乙烯（Hamilton,1991）。Spaua 等（1991）利用 Ptom13 从番茄细胞培养物中克隆了 ACC 氧化酶 cDNA，将其注入爪蟾卵母细胞后，导致爪蟾卵细胞 ACC 氧化酶的合成。根据 pTOM13 的核苷酸序列推导出氨基酸序列具有黄烷酮-3-羟化酶的同源序列。根据黄烷酮-3-羟化酶的测定方法，Ververidis 和 John（1991）首次从甜瓜中分离到了有活性的 ACC 氧化酶。在提取过程中，需要加入 Fe2+和抗坏血酸，并证实 ACC 氧化酶是一种类似黄烷酮-3-羟化酶的可溶性酶，进一步研究表明 ACC 氧化酶是一种依赖于 2-酮戊二酸的与双加氧酶类似的酶。 ACC 氧化酶不需要酮戊二酯作辅助因子。在一些植物系统中，活体 ACC 氧化酶活性因 CO2 处理而提高，但离体 ACC 氧化酶活性却完全依赖于 CO2 的存在（Dong 等，1992）。该酶 Km 值为 60μmol/L，最适 pH 为 7.5。ACC 转化为乙烯的化学反应式如下： ACC+1/2O2+抗坏血酸 C2H2+CO2+HCN+脱氢抗坏血酸+2H2O 目前，在香石竹上克隆了 ACC 氧化酶的 cDNA pSR120。伴随花瓣衰老产生乙烯跃变的同时， pSR120 相应的 mRNA 也相应增加。香石竹花瓣的 ACC 氧化酶是可溶性酶（Wang 和 Woodson， 1991；Mariska 等，1994）。在天竺葵（Tzam-wei 和 Arteca,1995）、矮牵牛（Wang 和 Woodson， 1993）、兰科（Nadeau 和 O’Niell,1995）中分离鉴定了 ACC 氧化酶，并且酶基因的表达存在差异性，由此推测 ACC 氧化酶基因属于多基因家族。此外，ACO 的 cDNA 已被从番茄、苹果等数种不同的植物中分离获得，其氨基酸的同源性高达 90%。Hamilton 等用反义 ACO RNA 抑制了 ACO 活性。在纯合的转基因番茄果实中，乙烯的形成被抑制了 97%。转基因植株果实的着色时间与正常果实基本相同，但着色的速度变慢。贮存在室温下的反义番茄比正常对照果实更耐过熟和皱缩。 2）乙烯生物合成的调节 a 乙烯对乙烯生成的调节乙烯对切花乙烯生成的调节，包括乙烯的自我催化（autocatalysis）和乙烯的自我抑制（autoinhibition）（Yang 和 Hoffman，1984）。 ① 乙烯的自我催化又称为正反馈调节（positive feedback），指乙烯对乙烯生物合成的诱导，是跃变型切花衰老和跃变型果实成熟的重要特征（Gao 等，1994）。Mayak 等（1977）用乙烯激活类似物丙烯处理香石竹，增加了乙烯生成量。乙烯处理香石竹花瓣增加了乙烯生成量和 ACC 含量的积累（Hiroshih 等，1990）。Mor 等（1985）用乙烯处理香石竹，发现 ACC 合成酶活性增加了 90-100 倍。Woodson 等（1992）用乙烯处理未衰老香石竹花瓣，6 小时后测得 ACC 合成酶和 ACC 氧化酶基因的转录。香石竹花瓣经乙烯处理后，乙烯生成能力增强，处理 1 小时后测得 ACC 氧化酶活性增加，约 5 小时后乙烯生成量开始增加，ACC 合成酶活性提高，这都依赖于外源乙烯的存在，用α-鹅膏菌素（α-amanitin）和环己酰亚胺预先处理的花瓣该酶活性会受到部分抑制，由此可 Fe2+CO2

以推测香石竹对外源乙烯的反应首先表现为酶活性的提高，其次是与此相关的mRNA的增加。利用这一原理，人为地用乙烯处理香石竹、满天星等跃变型切花，促使花朵整齐一致开放。早在1931年，Zimmerman等(1930)指出照明气体中高浓度乙烯会引起月季切花有些品种过早开放，而使另外一些品种在开放之前花蕾和叶片脱落。高浓度的乙烯利(500ppm)促进切花月季‘Sonia'和‘Victory Parade'花瓣和叶片脱落，低浓度乙烯利无同样的作用(DeStigter,1.l981 Serek,l993)。但低浓度乙烯(1~10ppm)促进‘Forever Yours'开花(Melean等，1981)，抑制 ‘Sonia'开花(Goszezynska和Reid,198s):更低浓度(0.lppm)乙烯可以促进‘Sonia'花蕾边到商业成熟，不减少其瓶插寿命(Goszczynska和Reid,1985)。切花月季‘Merecedes'开花衰老进程中乙烯生成量有峰值出现，峰值出现的时间早于离子渗透的出现，也早于衰老症状的出现。乙烯处理促进该品种离子渗透率增加，并促进衰老(Farogher,.l984)。Reid(1989)用0-lppm乙烯处理不同切花月季品种，结果发现不同品种反应不一，从彻底抑制开放到明显促进开花，有的开花衰老进程则不受影响，还有些品种出现花朵变形或萼片和花梗黄化。而跃变型切花香石竹则不然，从低浓度乙烯(0.1ppm)到饱和浓度(850ppm)反应都很一致，表现为乙烯促进衰老 (Wolteering等，1993) ②乙烯的自我抑制又称为负反馈调节(negative feedback),是指由乙烯作用抑制剂或乙烯感受突变体使乙烯生物合成解偶联，并且乙烯处理反而抑制乙烯的生成(K©dc,l993)。用降冰片烯(NBD)处理促进柑橘叶片外植体(Sisler等，1985)和深水稻节间(Bleecker,1987)的乙烯生成：硫代硫酸银(STS)和硝酸银以及乙烯作用拮抗剂也促进绿色番茄果实组织(Aa-Ay等 1987)、拟南芥(Guzman和Echer.I990)的乙烯生成。一般认为乙烯的自我抑制是因为乙烯抑制 ACC合成和促进ACC生产丙二酰基ACC(MACC),从而导致ACC供给不足。 b花器官各组织之间乙烯生成的调节以香石竹为例，从花朵花器官各组织来看，香石竹花朵乙烯大部分（约80%）是由花瓣生成，但是按单位鲜重乙烯的生成量来计算，则雌蕊的乙烯生成量大于花瓣的乙烯生成量，并且雌蕊的乙烯生成早于花瓣的乙烯生成(Hyodo,1989),Charlesdeng(1984)试验结果表明，香石竹花瓣乙烯生成量变化动态呈现典型的跃变特征，跃变峰值较前期要高出1000倍，而且外层花瓣和内层花瓣的乙烯峰值出现时间较为一致，但外层花避较内层花瓣的乙烯峰值要高。Nickols(1977)发现香石竹开花和衰老过程中，雌蕊群和花托的乙烯生成量与乙烯跃变相一致，花柱、子房和花瓣都有乙烯生成。但整朵花的乙桥主要来自花柱和花静。而目花瓣基部的乙烯生成速率较顶部题快目早。进一步的试验表明，花瓣基部的乙烯生成量是顶部的4倍，基部的ACC可向项部转移(Overbeek和 Woltering,1990,Woltering等，l991)。乙烯生成量的增加与花朵不同部位中ACC含量的增加相一致(Hsieh和Sacalis,1987)。Bufler(1980)试验结果表明花瓣的ACC含量在跃变峰期较跃变前增加了30倍。Hsich和Sacalis(1986)发现香石竹花朵不同部位中除花萼在整个期间ACC含量始终保持较低水平外，其它各部分ACC含量都有较明显的峰值出现，花托表现得尤其明显，花属基部的ACC增长速率较顶部大且早，但二者峰值出现的时间都比花柱、子房和花托略晚。花柱。子房、花托和花瓣在第6-10天都有明显峰值出现，但在第2-4天只有花托出现另一个峰值。由此推测花托可能在ACC转移中起着重要的作用(Hsich和Sacalis,1987)。在采收时去除花瓣会导致

9 以推测香石竹对外源乙烯的反应首先表现为酶活性的提高，其次是与此相关的 mRNA 的增加。利用这一原理，人为地用乙烯处理香石竹、满天星等跃变型切花，促使花朵整齐一致开放。早在 1931 年，Zimmerman 等（1930）指出照明气体中高浓度乙烯会引起月季切花有些品种过早开放，而使另外一些品种在开放之前花蕾和叶片脱落。高浓度的乙烯利（500ppm）促进切花月季‘Sonia’和‘Victory Parade’花瓣和叶片脱落，低浓度乙烯利无同样的作用（De Stigter,1981； Serek,1993）。但低浓度乙烯（1~10ppm）促进‘Forever Yours’开花（Mclean 等，1981），抑制 ‘Sonia’开花（Goszczynska 和 Reid,1985）；更低浓度（0.1ppm）乙烯可以促进‘Sonia’花蕾达到商业成熟，不减少其瓶插寿命（Goszczynska 和 Reid,1985）。切花月季‘Merecedes’开花衰老进程中乙烯生成量有峰值出现，峰值出现的时间早于离子渗透的出现，也早于衰老症状的出现。乙烯处理促进该品种离子渗透率增加，并促进衰老（Farogher,1984）。Reid（1989）用 0-1ppm 乙烯处理不同切花月季品种，结果发现不同品种反应不一，从彻底抑制开放到明显促进开花，有的开花衰老进程则不受影响，还有些品种出现花朵变形或萼片和花梗黄化。而跃变型切花香石竹则不然，从低浓度乙烯(0.1ppm)到饱和浓度（850ppm）反应都很一致，表现为乙烯促进衰老（Wolteering 等，1993）。 ② 乙烯的自我抑制又称为负反馈调节（negative feedback），是指由乙烯作用抑制剂或乙烯感受突变体使乙烯生物合成解偶联，并且乙烯处理反而抑制乙烯的生成（Kende,1993）。用降冰片二烯（NBD）处理促进柑橘叶片外植体（Sisler 等，1985）和深水稻节间（Bleecker,1987）的乙烯生成；硫代硫酸银（STS）和硝酸银以及乙烯作用拮抗剂也促进绿色番茄果实组织（Atta-Aly 等， 1987）、拟南芥（Guzman 和 Echer,1990）的乙烯生成。一般认为乙烯的自我抑制是因为乙烯抑制 ACC 合成和促进 ACC 生产丙二酰基 ACC（MACC），从而导致 ACC 供给不足。 b 花器官各组织之间乙烯生成的调节以香石竹为例，从花朵花器官各组织来看，香石竹花朵乙烯大部分（约 80%）是由花瓣生成，但是按单位鲜重乙烯的生成量来计算，则雌蕊的乙烯生成量大于花瓣的乙烯生成量，并且雌蕊的乙烯生成早于花瓣的乙烯生成（Hyodo，1989）。Charlesdeng（1984）试验结果表明，香石竹花瓣乙烯生成量变化动态呈现典型的跃变特征，跃变峰值较前期要高出 1000 倍，而且外层花瓣和内层花瓣的乙烯峰值出现时间较为一致，但外层花瓣较内层花瓣的乙烯峰值要高。Nickols（1977）发现香石竹开花和衰老过程中，雌蕊群和花托的乙烯生成量与乙烯跃变相一致，花柱、子房和花瓣都有乙烯生成，但整朵花的乙烯主要来自花柱和花瓣，而且花瓣基部的乙烯生成速率较顶部要快且早。进一步的试验表明，花瓣基部的乙烯生成量是顶部的 4 倍，基部的 ACC 可向顶部转移（Overbeek 和 Woltering，1990，Woltering 等，1991）。乙烯生成量的增加与花朵不同部位中 ACC 含量的增加相一致（Hsieh 和 Sacalis，1987）。Bufler（1980）试验结果表明花瓣的 ACC 含量在跃变峰期较跃变前增加了 30 倍。Hsieh 和 Sacalis（1986）发现香石竹花朵不同部位中除花萼在整个期间 ACC 含量始终保持较低水平外，其它各部分 ACC 含量都有较明显的峰值出现，花托表现得尤其明显，花瓣基部的 ACC 增长速率较顶部大且早，但二者峰值出现的时间都比花柱、子房和花托略晚。花柱、子房、花托和花瓣在第 6-10 天都有明显峰值出现，但在第 2-4 天只有花托出现另一个峰值。由此推测花托可能在 ACC 转移中起着重要的作用（Hsieh 和 Sacalis，1987）。在采收时去除花瓣会导致

子房和花托中ACC含量的增长。将用14C标记的ACC注入柱头，24小时内就可以在花瓣中发现有近13带14C标记的ACC,而同一时间内，花托中却几乎没有发现带14C标记的ACC存在。 Bufler等(198O)根据试验推测ACC由雌蕊群合成并向花瓣转移。现在普遍承认这一观点，即 ACC在雌蕊群中合成，通过花托向花瓣转移，在花瓣中生成乙烯，进而启动和促进整个花朵的衰老。月季切花衰老过程中，乙烯生成量绝大部分来自花朵，而叶片只占很少比例，可以忽略（高钧平等，1994)。月季切花衰老主要表现在花朵，尤其是花瓣。了解花朵乙烯生成的主要来源和 ACC合成的部位，花瓣和花瓣以外其余部分对花朵衰老的影响是研究月委切花衰老的内容之一以上结果表明，花朵的各个部位都能合成ACC并生成乙烯，花瓣乙烯生产量在整朵花中所占比例最大，花托和子房次之，雄蕊、花柱和花萼较低，可见完整花朵从蕾期至衰老期乙桥生成主要来自花瓣，花瓣与整朵花的开放和衰老关系密切，而花瓣以外其余部分可能通过调节花瓣的乙烯生物合成来影响整朵花的开花衰老进程。 c各种胁迫对乙烯生成的调节鲜切花在采收、预处理、包装、运输、贮藏、销售等各个流通环节中，不可避免要遭到各种胁迫(st©sss)。胁迫种类很多，有物理的（创伤、挤压、辐射、冻结、低温和高温伤害），化学的 (重金属离子、CO、O,以及其他污染)以及生物的（昆虫和病原菌的侵入）(Yang和Hoffman, 1984)。当切花遭到胁迫后，即使是通常只生成system I乙烯的花卉，也能诱发产生systemⅡ乙烯，进而促进衰老进程。胁迫诱导乙烯生成一般只有10-30分钟的带后期，数小时后达到高峰，然后逐渐降低(Yang和Hoffman,1984)。mascki(1992)指出，创伤诱导合成的ACC合成酵基因不同于成熟和生长素透导的。Inaa等(1991)发现了一种新的助迫即直流电透导乙烯的生物合成。他们以非跃变型果实为试材，用0.5-30mA直流电进行处理，在诱变黄瓜果实乙烯生成的同时，ACC合成酶和ACC氧化酶活性也都被透导，但是，同样强度的交流电却没有透导效果。从而证明，直流电诱导的乙烯生成遵循ACC-乙烯途径。目前，他们已分离出4种直流电诱导的ACC 合成酶基因。 d温度和湿度对乙烯生成的调节 ①温度与呼吸不同，乙烯生成量与温度之间没有明确的相关关系。这里着重介绍冷害和冻害ciig and freezing stress对乙烯生成的影响.。热带植物和亚热带植物在遭受一定程度的低温时容易发生冷害。产品如黄瓜在发生冷害的温度下，只能积累ACC但不能生成乙烯。当把受到冷害的组织放回到不受冷害的温度时，产品便生成大量的乙烯。胁迫乙烯的产生是初期冷害的一个很好的标志。冷害作为引起乙烯产生的一种胁迫方式，对乙烯的产生有两种影响，第一种是增加ACC的合成，另一种是破坏膜结构，降低EFE的活性。不同植物对冷害的忍受力差异较大，比较敏感的热带草本类只能忍受1小时低温，而黄瓜和热带水果则能忍受数日。此外，果实遭受轻度冻害也可引起乙烯的大量产生。 ②湿度

10 子房和花托中 ACC 含量的增长。将用 14C 标记的 ACC 注入柱头，24 小时内就可以在花瓣中发现有近 1/3 带 14C 标记的 ACC，而同一时间内，花托中却几乎没有发现带 14C 标记的 ACC 存在。 Bufler 等（1980）根据试验推测 ACC 由雌蕊群合成并向花瓣转移。现在普遍承认这一观点，即 ACC 在雌蕊群中合成，通过花托向花瓣转移，在花瓣中生成乙烯，进而启动和促进整个花朵的衰老。月季切花衰老过程中，乙烯生成量绝大部分来自花朵，而叶片只占很少比例，可以忽略（高俊平等，1994）。月季切花衰老主要表现在花朵，尤其是花瓣。了解花朵乙烯生成的主要来源和 ACC 合成的部位，花瓣和花瓣以外其余部分对花朵衰老的影响是研究月季切花衰老的内容之一。以上结果表明，花朵的各个部位都能合成 ACC 并生成乙烯，花瓣乙烯生产量在整朵花中所占比例最大，花托和子房次之，雄蕊、花柱和花萼较低，可见完整花朵从蕾期至衰老期乙烯生成主要来自花瓣，花瓣与整朵花的开放和衰老关系密切，而花瓣以外其余部分可能通过调节花瓣的乙烯生物合成来影响整朵花的开花衰老进程。 c 各种胁迫对乙烯生成的调节鲜切花在采收、预处理、包装、运输、贮藏、销售等各个流通环节中，不可避免要遭到各种胁迫（stresses）。胁迫种类很多，有物理的（创伤、挤压、辐射、冻结、低温和高温伤害），化学的（重金属离子、CO、O3以及其他污染）以及生物的（昆虫和病原菌的侵入）（Yang 和 Hoffman， 1984）。当切花遭到胁迫后，即使是通常只生成 system I 乙烯的花卉，也能诱发产生 system II 乙烯，进而促进衰老进程。胁迫诱导乙烯生成一般只有 10-30 分钟的滞后期，数小时后达到高峰，然后逐渐降低（Yang 和 Hoffman，1984）。Imaseki（1992）指出，创伤诱导合成的 ACC 合成酶基因不同于成熟和生长素诱导的。Inaba 等（1991）发现了一种新的胁迫即直流电诱导乙烯的生物合成。他们以非跃变型果实为试材，用 0.5-3.0mA 直流电进行处理，在诱变黄瓜果实乙烯生成的同时，ACC 合成酶和 ACC 氧化酶活性也都被诱导，但是，同样强度的交流电却没有诱导效果。从而证明，直流电诱导的乙烯生成遵循 ACC-乙烯途径。目前，他们已分离出 4 种直流电诱导的 ACC 合成酶基因。 d 温度和湿度对乙烯生成的调节 ① 温度与呼吸不同，乙烯生成量与温度之间没有明确的相关关系。这里着重介绍冷害和冻害 cilling and freezing stress 对乙烯生成的影响。热带植物和亚热带植物在遭受一定程度的低温时容易发生冷害。产品如黄瓜在发生冷害的温度下，只能积累 ACC 但不能生成乙烯。当把受到冷害的组织放回到不受冷害的温度时，产品便生成大量的乙烯。胁迫乙烯的产生是初期冷害的一个很好的标志。冷害作为引起乙烯产生的一种胁迫方式，对乙烯的产生有两种影响，第一种是增加 ACC 的合成，另一种是破坏膜结构，降低 EFE 的活性。不同植物对冷害的忍受力差异较大，比较敏感的热带草本类只能忍受 1 小时低温，而黄瓜和热带水果则能忍受数日。此外，果实遭受轻度冻害也可引起乙烯的大量产生。 ② 湿度

《观赏植物采后生理与技术》课程教学资源（教案讲义）第一章 观赏植物采后生理概论 第3节 切花开花和衰老生理

《观赏植物采后生理与技术》课程教学资源（教案讲义）第一章观赏植物采后生理概论第3节切花开花和衰老生理