医学免疫学实验指导2023年3月
医学免疫学实验指导 2023 年 3 月
目录绪论·实验一血型鉴定.3实验二类风湿因子检测实验三酶联免疫吸附试验实验四HCG检测·-8实验五免疫血清的制备及效价测定..9实验六实验性动物过敏试验·.l........13实验七溶血空斑试验
目 录 绪论.1 实验一 血型鉴定.3 实验二 类风湿因子检测.4 实验三 酶联免疫吸附试验.5 实验四 HCG 检测.8 实验五 免疫血清的制备及效价测定.9 实验六 实验性动物过敏试验.11 实验七 溶血空斑试验. 13
绪论一、目的和要求1.．使学生加深理解并巩固医学免疫学理论知识，学习和掌握有关的实验操作技能，为以后的医学专业课学习打好基础。2．通过实验操作、标本观察和技术训练，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；培养严谨的科学作风及分析问题、解决问题的能力，为从事病原生物感染性疾病和免疫性疾病的诊断、流行病学调查及防治研究工作打下扎实的基础。二、实验室规则医学免疫学的实验对象涉及菌液、血清等生物制剂，具有一定的安全风险。为了防止病原生物感染自身、污染环境以及扩散传播，要求同学们必须严格遵守下列规则1.进入实验室时应保持肃静，遵守实验时间，必须穿着白实验服，离室时脱下反折白大衣要经常清洗消毒。2.与实验无关的物品不得带入实验室，在实验室内禁止饮食、吸烟，不可把任何东西放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。3.按照实验要求，在老师的指导下，认真进行实验技术操作，既要做到不怕脏、不怕臭，又要避免血、粪和其他体液对实验环境的污染，严格遵守操作规程，争取顺利地完成实验。4.实验中不得擅自移动示教标本，爱护仪器设备，使用完毕的器材和试剂，必须放回规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。5．避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立即报告教师，以便及时作适当处理。如菌液误入口中，应立即吐入消毒容器内，并用1：1000高锰酸钾溶液或3%过氧化氢（双氧水）漱口，并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。如菌液流酒在桌面，将适量2～3%甲酚皂溶液（来苏尔）或0.1%新洁尔火倒于污染面，浸泡30分钟后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。注意严格操作规程，防止产生实验室感染。6.每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒液泡手。用消毒液擦洗工作台面，并用紫外线灯照射。7.实验完毕后，将试剂、仪器、标本等实验材料整理好，如有损坏应及时报告指导教师，情赔偿。而且要按时完成作业，轮流做好值日，关好门、窗、水、电后离开实验室。1
1 绪论 一、目的和要求 1. 使学生加深理解并巩固医学免疫学理论知识，学习和掌握有关的实验操作技能，为 以后的医学专业课学习打好基础。 2. 通过实验操作、标本观察和技术训练，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题 的能力；培养严谨的科学作风及分析问题、解决问题的能力，为从事病原生物感染性疾病和 免疫性疾病的诊断、流行病学调查及防治研究工作打下扎实的基础。 二、实验室规则 医学免疫学的实验对象涉及菌液、血清等生物制剂，具有一定的安全风险。为了防止病 原生物感染自身、污染环境以及扩散传播，要求同学们必须严格遵守下列规则： 1. 进入实验室时应保持肃静，遵守实验时间，必须穿着白实验服，离室时脱下反折， 白大衣要经常清洗消毒。 2. 与实验无关的物品不得带入实验室，在实验室内禁止饮食、吸烟，不可把任何东西 放入嘴中，也不要用手抚摸头面等部位。 3. 按照实验要求，在老师的指导下，认真进行实验技术操作，既要做到不怕脏、不怕 臭，又要避免血、粪和其他体液对实验环境的污染，严格遵守操作规程，争取顺利地完成实 验。 4. 实验中不得擅自移动示教标本，爱护仪器设备，使用完毕的器材和试剂，必须放回 规定的位置。废弃物必须按规定进行处理或归放于指定的容器内，不能随便乱丢乱放。 5. 避免任何有菌材料的溅出，若不慎污染了工作台、手、眼、衣服和地面等处，应立 即报告教师，以便及时作适当处理。如菌液误入口中，应立即吐入消毒容器内，并用1:1000 高锰酸钾溶液或3%过氧化氢（双氧水）漱口，并根据菌种不同，服用抗菌药物预防感染。如 菌液流洒在桌面，将适量2～3%甲酚皂溶液（来苏尔）或0.1%新洁尔灭倒于污染面，浸泡30 分钟后抹去。若手上有活菌，亦应浸泡于上述消毒液3分钟后，再用肥皂和水清洗。注意严 格操作规程，防止产生实验室感染。 6. 每次实验后均要用肥皂洗手，必要时用消毒液泡手。用消毒液擦洗工作台面，并用 紫外线灯照射。 7. 实验完毕后，将试剂、仪器、标本等实验材料整理好，如有损坏应及时报告指导教 师，酌情赔偿。而且要按时完成作业，轮流做好值日，关好门、窗、水、电后离开实验室
三、实验报告的书写实验报告书写时要尊重事实与实验结果。实验报告要求内容完整，条理分明，文字简练，书写整洁，措辞注意科学性和逻辑性。实验报告封面填写姓名、专业、班级、组别、日期，实验内容包括：1.实验题目简练明确。2.实验目的掌握、熟悉和了解内容。3.实验原理简明扼要表述。4.实验材料动物、试剂药品、器材。5.实验方法操作步骤阐述明确，条理性强。6.实验结果实验过程中所得到的结果需要进行整理和分析，可用表格或绘图表示。7.分析讨论应针对实验中所观察到的现象与结果联系课堂讲授的理论知识，进行分析归纳，切忌离开实验结果去空谈理论。对影响实验的因素进行分析，尤其是结果出现异常，应具体分析其可能原因。2
2 三、实验报告的书写 实验报告书写时要尊重事实与实验结果。实验报告要求内容完整，条理分明，文字简练， 书写整洁，措辞注意科学性和逻辑性。实验报告封面填写姓名、专业、班级、组别、日期， 实验内容包括： 1. 实验题目 简练明确。 2. 实验目的 掌握、熟悉和了解内容。 3. 实验原理 简明扼要表述。 4. 实验材料 动物、试剂药品、器材。 5. 实验方法 操作步骤阐述明确，条理性强。 6. 实验结果 实验过程中所得到的结果需要进行整理和分析，可用表格或绘图表示。 7. 分析讨论 应针对实验中所观察到的现象与结果联系课堂讲授的理论知识，进行分 析归纳，切忌离开实验结果去空谈理论。对影响实验的因素进行分析，尤其是结果出现异常， 应具体分析其可能原因
实验一血型鉴定ABO血型鉴定一、实验目的通过学习ABO血型抗原的检测，使学生掌握红细胞膜上的抗原分子及凝集反应的发生机制，结合理论上所学的抗原抗体反应的类型及特点，为临床上指导输血及交叉配血工作打好基础。二、实验原理血型抗原有40余种抗原系统，最常见的是ABO血型系统和Rh血型系统。在ABO血型系统中，根据人红细胞表面有无A或B血型抗原，可将人ABO血型分为A型、B型、AB型和0型四种，血清中存在天然的血型抗体（IgM类抗体）。A型血红细胞膜上有A抗原，血清中含有抗B抗体；B型血红细胞膜上有B抗原，血清中含有抗A抗体：AB型血红细胞膜上有A和B两种抗原，血清中既无抗A抗体又无抗B抗体：而O型血A与B两种抗原均无，血清中既有抗A抗体又有抗B抗体。利用直接凝集反应的原理，将已知标准的抗A和抗B试剂与受试者血液混合，观察有无凝集现象，从而检测受试者红细胞表面有无A或B抗原，从而将人血型分为A、B、AB、O型四种。三、实验材料1.试剂标准抗A、抗B试剂（即抗体）。2.器材载玻片、酒清棉球、采血针、牙签。四、实验方法1.用已知抗A、抗B试剂各一滴，分别滴在玻片两端，标明A端、B端。2.用酒精棉球消毒耳垂或手指，以消毒采血针刺破皮肤，用采血针取适当血加入玻片两端的血清上，用牙签混匀，2～10min观察结果，根据有无凝集现象判定血型。五、实验结果1.抗A和抗B试剂都无凝集现象者为“0”型血。2.抗A和抗B试剂都有凝集现象者为“AB”型血。3.只有抗A试剂凝集为“A”型血。4.只有抗B试剂凝集为“B”型血。六、注意事项1.请勿用牙签同一端混匀A端、B端。2.挤压耳垂或手指皮肤时应注意手法，以保证新鲜血液的一次性顺利挤出。七、思考题3
3 实验一 血型鉴定 ABO 血型鉴定 一、实验目的 通过学习 ABO 血型抗原的检测，使学生掌握红细胞膜上的抗原分子及凝集反应的发生 机制，结合理论上所学的抗原抗体反应的类型及特点，为临床上指导输血及交叉配血工作打 好基础。二、实验原理 血型抗原有 40 余种抗原系统，最常见的是 ABO 血型系统和 Rh 血型系统。在 ABO 血型系 统中，根据人红细胞表面有无 A 或 B 血型抗原，可将人 ABO 血型分为 A 型、B 型、AB 型和 O 型四种，血清中存在天然的血型抗体（IgM 类抗体）。A 型血红细胞膜上有 A 抗原，血清中含 有抗 B 抗体；B 型血红细胞膜上有 B 抗原，血清中含有抗 A 抗体；AB 型血红细胞膜上有 A 和 B 两种抗原，血清中既无抗 A 抗体又无抗 B 抗体；而 O 型血 A 与 B 两种抗原均无，血清中 既有抗 A 抗体又有抗 B 抗体。 利用直接凝集反应的原理，将已知标准的抗 A 和抗 B 试剂与受试者血液混合，观察有无 凝集现象，从而检测受试者红细胞表面有无 A 或 B 抗原，从而将人血型分为 A、B、AB、O 型四种。三、实验材料 1．试剂 标准抗 A、抗 B 试剂（即抗体）。 2．器材 载玻片、酒清棉球、采血针、牙签。 四、实验方法 1．用已知抗 A、抗 B 试剂各一滴，分别滴在玻片两端，标明 A 端、B 端。 2．用酒精棉球消毒耳垂或手指，以消毒采血针刺破皮肤，用采血针取适当血加入玻片 两端的血清上，用牙签混匀，2～10min 观察结果，根据有无凝集现象判定血型。 五、实验结果 1．抗 A 和抗 B 试剂都无凝集现象者为“O”型血。 2．抗 A 和抗 B 试剂都有凝集现象者为“AB”型血。 3．只有抗 A 试剂凝集为“A”型血。 4．只有抗 B 试剂凝集为“B”型血。 六、注意事项 1．请勿用牙签同一端混匀 A 端、B 端。 2．挤压耳垂或手指皮肤时应注意手法，以保证新鲜血液的一次性顺利挤出。 七、思考题
1.ABO血型鉴定的原理是什么？2.不同ABO血型之间输血时为何会发生输血反应？Rh血型鉴定一、实验目的通过学习Rh血型抗原的检测，使学生掌握红细胞膜上的抗原分子、Rh抗体以及凝集反应的发生机制，结合理论上所学的抗原抗体反应的类型及特点，为临床上科学地指导输血工作及新生儿溶血症的预防工作打好基础。三、实验原理Rh是恒河猴（Rhesusmacacus）外文名称的头两个字母。兰德斯坦纳等科学家在1940年做动物实验时，发现恒河猴和多数人体内的红细胞上存在Rh血型的抗原物质，故而命名。Rh血型抗原中，以D抗原免疫原性最强，出现频率最高，所以临床上一般只作D抗原的鉴定，受检者红细胞能与抗D血清凝集者为Rh阳性，不凝集者为阴性。Rh血型抗体多系不完全抗体，属IgG型。因分子短小，与红细胞上的抗原作用后，不能使红细胞靠拢凝集。木瓜酶能破坏红细胞表面上的睡液酸，降低其表面电荷，减少红细胞之间的排斥力，使红细胞得以靠拢，在不完全抗体的作用下，红细胞便出现凝集。随着对Rh血型的不断研究，认为Rh血型系统是红细胞血型中最为复杂的一个血型系统。Rh血型的发现，对更加科学地指导输血工作和进一步提高新生儿溶血病的实验诊断和维护母婴健康，都有非常重要的作用。Rh阳性血型在我国汉族及大多数民族人中约占99.7%，Rh阴性血型汉族人所占的比例极少，属稀有血型。三、实验材料1.试剂抗Rh试剂（抗RhD试剂)。2.器材载玻片、酒清棉球、采血针、牙签。四、实验方法1.用已知抗Rh试剂一滴，滴在玻片上。2.用酒精棉球消毒耳垂或手指，以消毒采血针刺破皮肤，用采血针取适当血加入玻片试剂中，用牙签混匀，2～10min观察结果，根据有无凝集现象判定血型。五、实验结果抗Rh试剂凝集则为Rh（D）阳性，不凝集则为Rh（D）阴性。六、思考题1．根据实验结果，试分析凝集反应的发生机制。2.Rh血型抗体属于何种抗体？实验二类风湿因子检测4
4 1．ABO 血型鉴定的原理是什么？ 2．不同 ABO 血型之间输血时为何会发生输血反应？ Rh 血型鉴定 一、实验目的 通过学习 Rh 血型抗原的检测，使学生掌握红细胞膜上的抗原分子、Rh 抗体以及凝集反 应的发生机制，结合理论上所学的抗原抗体反应的类型及特点，为临床上科学地指导输血工 作及新生儿溶血症的预防工作打好基础。 三、实验原理 Rh 是恒河猴（Rhesus macacus）外文名称的头两个字母。兰德斯坦纳等科学家在 1940 年做动物实验时，发现恒河猴和多数人体内的红细胞上存在 Rh 血型的抗原物质，故而命名。 Rh 血型抗原中，以 D 抗原免疫原性最强，出现频率最高，所以临床上一般只作 D 抗原的鉴 定，受检者红细胞能与抗 D 血清凝集者为 Rh 阳性，不凝集者为阴性。 Rh 血型抗体多系不完全抗体，属 IgG 型。因分子短小，与红细胞上的抗原作用后，不 能使红细胞靠拢凝集。木瓜酶能破坏红细胞表面上的唾液酸，降低其表面电荷，减少红细胞 之间的排斥力，使红细胞得以靠拢，在不完全抗体的作用下，红细胞便出现凝集。 随着对Rh血型的不断研究，认为Rh血型系统是红细胞血型中最为复杂的一个血型系统。 Rh 血型的发现，对更加科学地指导输血工作和进一步提高新生儿溶血病的实验诊断和维护 母婴健康，都有非常重要的作用。Rh 阳性血型在我国汉族及大多数民族人中约占 99.7%，Rh 阴性血型汉族人所占的比例极少，属稀有血型。 三、实验材料 1．试剂 抗 Rh 试剂（抗 Rh D 试剂）。 2. 器材 载玻片、酒清棉球、采血针、牙签。 四、实验方法 1．用已知抗 Rh 试剂一滴，滴在玻片上。 2．用酒精棉球消毒耳垂或手指，以消毒采血针刺破皮肤，用采血针取适当血加入玻片 试剂中，用牙签混匀，2～10min 观察结果，根据有无凝集现象判定血型。 五、实验结果 抗 Rh 试剂凝集则为 Rh（D）阳性，不凝集则为 Rh（D）阴性。 六、思考题 1. 根据实验结果，试分析凝集反应的发生机制。 2. Rh 血型抗体属于何种抗体？ 实验二 类风湿因子检测
一、实验目的通过学习类风湿因子检测，使学生掌握间接凝集反应的原理，熟悉间接凝集法检测类风湿因子的方法，了解类风湿因子检测的临床意义。二、实验原理将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上形成致敏颗粒，然后与相应的抗体结合出现的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性更高，可用于血清中微量抗原或抗体的检查。类风湿因子（rheumatoidfactor，RF）是由于细菌、病毒等感染引起体内产生的以变性IgG为抗原的一种自身抗体。一般医院主要采用胶乳凝集法测定类风湿因子。将IgG吸附于聚苯乙烯胶乳上，RF与其反应可产生凝集现象。此方法只能定性或以滴度半定量，其灵敏度和特异性均不高。三、实验材料1.试剂类风湿因子测定试剂盒（胶乳凝集法），包括胶乳液（人IgG包被胶乳）、阳性对照、阴性对照、反应片（6孔/板）；待检标本（模拟患者血清）、生理盐水。2.器材移液器、吸头、Ep管。四、实验方法1.加样本：在反应片孔中加入待检样本50ul（待检标本以生理盐水倍比稀释，稀释倍数为1：2、1：4、1：8、1：16），余2孔各加阴性对照、阳性对照1滴（约50u1）。2.加胶乳液：每孔加1滴胶乳液于各样本中，轻微晃动反应片充分混匀。3.数分钟后仔细观察凝集反应发生情况。五、实验结果以出现白色凝集颗粒为阳性，说明待检标本中存在RF，若不凝集则无RF。六、注意事项1.注意样本及胶乳液加样量的比例。2.本试剂样本血清加样量和阴性、阳性对照加样量均为50ul，保证液滴大小一致。3.若阴阳性对照结果出现异常，则试剂不可使用。4.试剂盒贮存于2～10℃，受热会导致试剂阳性率偏高，切勿冷冻。七、思考题1.间接凝集反应和直接凝集反应的区别？2.检测到类风湿因子就一定是类风湿关节炎吗？5
5 一、实验目的 通过学习类风湿因子检测，使学生掌握间接凝集反应的原理，熟悉间接凝集法检测类风 湿因子的方法，了解类风湿因子检测的临床意义。 二、实验原理 将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上形成致敏颗粒，然后与相应的抗体结 合出现的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性更高，可用于 血清中微量抗原或抗体的检查。 类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是由于细菌、病毒等感染引起体内产生的以变 性 IgG 为抗原的一种自身抗体。一般医院主要采用胶乳凝集法测定类风湿因子。将 IgG 吸附 于聚苯乙烯胶乳上，RF 与其反应可产生凝集现象。此方法只能定性或以滴度半定量，其灵 敏度和特异性均不高。 三、实验材料 1. 试剂 类风湿因子测定试剂盒（胶乳凝集法），包括胶乳液（人 IgG 包被胶乳）、阳 性对照、阴性对照、反应片（6 孔/板）；待检标本（模拟患者血清）、生理盐水。 2. 器材 移液器、吸头、Ep 管。 四、实验方法 1．加样本：在反应片孔中加入待检样本 50ul（待检标本以生理盐水倍比稀释，稀释倍 数为 1：2、1：4、1：8、1：16），余 2 孔各加阴性对照、阳性对照 1 滴（约 50ul）。 2. 加胶乳液：每孔加 1 滴 胶乳液于各样本中，轻微晃动反应片充分混匀。 3. 数分钟后仔细观察凝集反应发生情况。 五、实验结果 以出现白色凝集颗粒为阳性，说明待检标本中存在 RF，若不凝集则无 RF。 六、注意事项 1．注意样本及胶乳液加样量的比例。 2. 本试剂样本血清加样量和阴性、阳性对照加样量均为 50ul，保证液滴大小一致。 3. 若阴阳性对照结果出现异常，则试剂不可使用。 4. 试剂盒贮存于 2～10 ℃，受热会导致试剂阳性率偏高，切勿冷冻。 七、思考题 1．间接凝集反应和直接凝集反应的区别？ 2．检测到类风湿因子就一定是类风湿关节炎吗？
实验三酶联免疫吸附试验一、实验目的通过学习酶联免疫吸附试验双抗体夹心法，掌握酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）的基本原理，熟悉利用ELISA双抗体夹心法测定乙肝病毒表面抗原的操作，了解乙肝病毒抗原抗体检测的临床意义，了解主要免疫标记技术的的基本原理和应用，为从事临床免疫工作打基础。二、实验原理免疫酶测定法是一种用酶标记抗原或抗体检测特异性抗体或抗原的方法。该法将抗原抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用有效地结合起来，通过酶分解底物产生有色物质，用酶标仪测定光密度值（OD），以反映抗原或抗体的含量。常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶免疫组化技术。ELISA用于检测溶液中抗原或抗体，酶免疫组化技术用于测定组织或细胞中的抗原。ELISA检测技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。ELISA常用测定方法有间接ELISA和双抗体夹心ELISA，间接法是常用的一种检测抗体的方法，双抗体夹心法是常用的一种检测抗原的方法（图1）。双抗体夹心法间接法图1ELISA示意图双抗体夹心ELISA（sandwichELISA）适用于检测血清、脑脊液、胸水、腹水等各种液相中的可溶性抗原。其基本原理是先将已知抗体包被到固相载体上，洗去未吸附的抗体；加6
6 实验三 酶联免疫吸附试验 一、实验目的 通过学习酶联免疫吸附试验双抗体夹心法，掌握酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的基本原理，熟悉利用 ELISA 双抗体夹心法测定乙肝病毒表 面抗原的操作，了解乙肝病毒抗原抗体检测的临床意义，了解主要免疫标记技术的的基本原 理和应用，为从事临床免疫工作打基础。 二、实验原理 免疫酶测定法是一种用酶标记抗原或抗体检测特异性抗体或抗原的方法。该法将抗原抗 体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用有效地结合起来，通过酶分解底物产生有色 物质，用酶标仪测定光密度值（OD），以反映抗原或抗体的含量。常用的方法有酶联免疫吸 附试验（ELISA）和酶免疫组化技术。ELISA 用于检测溶液中抗原或抗体，酶免疫组化技术 用于测定组织或细胞中的抗原。 ELISA 检测技术的特点是敏感性高，特异性强，操作简易，结果容易观察。ELISA 常用 测定方法有间接 ELISA 和双抗体夹心 ELISA，间接法是常用的一种检测抗体的方法，双抗体 夹心法是常用的一种检测抗原的方法（图 1）。 双抗体夹心 ELISA（sandwich ELISA）适用于检测血清、脑脊液、胸水、腹水等各种液 相中的可溶性抗原。其基本原理是先将已知抗体包被到固相载体上，洗去未吸附的抗体；加 图 1 ELISA 示意图 间接法 双抗体夹心法
入待检标本，充分作用后，标本中的相应抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加入底物后，酶分解底物产生显色反应，根据颜色的深浅判定待测标本中抗原的量。本实验以双抗体夹心ELISA检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）为例介绍。实验原理是采用单克隆抗-HBs包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP，当标本存在HBsAg时，该HBsAg与包被抗-HBs结合并与抗-HBs-HRP结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP复合物，加入TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。在实验中，以辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）标记抗体。当抗体与相应抗原结合后，标记的酶则可催化底物辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）起显色反应，形成蓝色产物，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。三、实验材料1.试剂HBsAg检测试剂盒一已包被抗体的酶标条（单克隆抗-HBs）、阳性对照、阴性对照、酶结合物（HRP-抗HBs）、洗涤液、显色剂A和显色剂B（底物TMB和0.03%H,02）、终正液（1mo1/LH,SO,）：待测标本、样本稀释液（pH7.40.02mo1/LPBS缓冲液）。2.器材、移液器、吸头、Ep管、酶标板架、三角烧瓶、糖瓷盒、洗瓶、吸水纸、37℃培养箱，酶标仪。四、实验方法1.实验准备从冷藏环境中取出试剂盒各试剂，室温平衡30min，同时将浓缩洗涤液稀释（注：若浓缩洗涤液出现结晶时，请放置37℃至溶解）。2.加待测标本在已包被抗体的酶标条孔内加入待测标本（待检标本以PBS倍比稀释，稀释倍数为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32)，每孔50ul,并设对照3孔，分别加入阳性对照1滴、阴性对照1滴，空白对照不加。3.加酶标抗体每孔1滴，空白对照不加，充分混匀，置37℃孵育30min。4洗板弃去反应板条内液体，吸水纸上拍干；用洗涤液注满每孔，静置5～10s，弃去孔内洗涤液拍干，如此反复5次，拍干（注：吸水纸勿反复使用）。5.加底物加显色剂A和和显色剂B各1滴，充分混匀，放置37℃避光孵育15min。6.终止反应每孔加入终正液1滴，混匀既可放入仪器进行测定（注：实验结果判定须在10min内完成）。7
7 入待检标本，充分作用后，标本中的相应抗原与固相上已知抗体结合，洗去未结合的抗原成 分；加入已知的酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加入底物后，酶分解底物产生显色反 应，根据颜色的深浅判定待测标本中抗原的量。 本实验以双抗体夹心 ELISA 检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）为例介绍。实验原理是采 用单克隆抗-HBs 包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗-HBs-HRP，当标本存在 HBsAg 时，该 HBsAg 与包被抗- HBs 结合并与抗-HBs-HRP 结合形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs-HRP 复合 物，加入 TMB 底物产生显色反应，反之则无显色反应。 在实验中，以辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记抗体。当抗体与 相应抗原结合后，标记的酶则可催化底物辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 起显色反应，形成蓝色产物，从而指示特异性抗原抗体反应的存在。 三、实验材料 1．试剂 HBsAg检测试剂盒—已包被抗体的酶标条（单克隆抗-HBs）、阳性对照、阴 性对照、酶结合物（HRP-抗HBs）、洗涤液、显色剂A和显色剂B（底物TMB和0.03%H2O2）、终 止液（1mol/L H2SO4）；待测标本、样本稀释液（pH7.4 0.02mol/L PBS缓冲液）。 2．器材 移液器、吸头、Ep管、酶标板架、三角烧瓶、搪瓷盒、洗瓶、吸水纸、37℃ 培养箱，酶标仪。 四、实验方法 1. 实验准备 从冷藏环境中取出试剂盒各试剂，室温平衡 30min，同时将浓缩洗涤液 稀释（注：若浓缩洗涤液出现结晶时，请放置 37℃至溶解）。 2. 加待测标本 在已包被抗体的酶标条孔内加入待测标本（待检标本以 PBS 倍比稀释， 稀释倍数为 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32），每孔 50ul,并设对照 3 孔，分别加入阳性 对照 1 滴、阴性对照 1 滴，空白对照不加。 3. 加酶标抗体 每孔 1 滴，空白对照不加，充分混匀，置 37℃孵育 30min。 4. 洗板 弃去反应板条内液体，吸水纸上拍干；用洗涤液注满每孔，静置 5～10s，弃 去孔内洗涤液拍干，如此反复 5 次，拍干（注：吸水纸勿反复使用）。 5. 加底物 加显色剂 A 和和显色剂 B 各 1 滴，充分混匀，放置 37℃避光孵育 15min。 6. 终止反应 每孔加入终止液 1 滴，混匀既可放入仪器进行测定（注：实验结果判定 须在 10min 内完成）
五、实验结果1.定性法的结果判定阴性对照孔为无色，未加终止液前呈蓝色，加终止液后呈黄色或橙色，为阳性反应。2.定量法的结果判定用酶标仪读数，选择单波长450nm（以空白孔较零）或双波长450/630nm，读取各孔OD值。以阴性对照孔平均OD值×2.1为阴性对照临界值（cutoff），标本OD值大于等于此值为阳性，小于此值为阴性。六、注意事项1.试剂盒应于2～8℃保存，使用时从冷藏环境中取出应平衡30min至室温。2．加样应加在板孔的底部，但不要触碰孔底，并避免产生气泡。3.孵育的时间和温度要严格控制。4.洗涤时各孔均需加满洗液，洗涤必须彻底，防止孔口有游离酶不能洗净产生假阳性。5.结果判读请在15min内完成。七、思考题1.双抗体夹心法还可用于检测哪些物质？2.ELISA的影响因素有哪些？如何控制这些因素？3.简述ELISA的结果判断及临床应用？实验四HCG检测一、实验目的通过实验，使学生掌握胶体金免疫层析技术检测HCG原理，了解检测HCG的临床意义，即通过定性检测人体尿液中HCG用于妊娠的早期诊断。二、实验原理人绒毛膜促性腺激素（HumanChorionicGonadotrophin，HCG）检测，又称为早早孕快速诊断。用胶体金标记抗体，与相应抗原特异性结合而显色。HCG是妇女妊娠期由胎盘产生的一种糖蛋白激素，可在孕早期孕妇尿液中检验到，是早期检测怀孕的最好标志。应用胶体金免疫层析双抗体夹心法的原理，试纸条用胶体金标记的抗HCGMcAb、抗HCGpAb、和羊抗鼠pAb固定于硝酸纤维膜上。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗HCGMcAb时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗HCGpAb时，形成双抗体夹心胶体金复合物，在包被条带处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠8
8 五、实验结果 1．定性法的结果判定 阴性对照孔为无色，未加终止液前呈蓝色，加终止液后呈黄色 或橙色，为阳性反应。 2．定量法的结果判定 用酶标仪读数，选择单波长 450nm（以空白孔较零）或双波长 450/630nm，读取各孔 OD 值。以阴性对照孔平均 OD 值×2.1 为阴性对照临界值（cutoff）， 标本 OD 值大于等于此值为阳性，小于此值为阴性。 六、注意事项 1. 试剂盒应于 2～8℃保存，使用时从冷藏环境中取出应平衡 30min 至室温。 2. 加样应加在板孔的底部，但不要触碰孔底，并避免产生气泡。 3. 孵育的时间和温度要严格控制。 4. 洗涤时各孔均需加满洗液，洗涤必须彻底，防止孔口有游离酶不能洗净产生假阳性。 5. 结果判读请在 15min 内完成。 七、思考题 1．双抗体夹心法还可用于检测哪些物质？ 2．ELISA 的影响因素有哪些？如何控制这些因素？ 3．简述 ELISA 的结果判断及临床应用？ 实验四 HCG 检测 一、实验目的 通过实验，使学生掌握胶体金免疫层析技术检测 HCG 原理，了解检测 HCG 的临床意义， 即通过定性检测人体尿液中 HCG 用于妊娠的早期诊断。 二、实验原理 人绒毛膜促性腺激素（Human Chorionic Gonadotrophin，HCG）检测，又称为早早孕快 速诊断。用胶体金标记抗体，与相应抗原特异性结合而显色。HCG 是妇女妊娠期由胎盘产生 的一种糖蛋白激素，可在孕早期孕妇尿液中检验到，是早期检测怀孕的最好标志。 应用胶体金免疫层析双抗体夹心法的原理，试纸条用胶体金标记的抗 HCG McAb、抗 HCG pAb、和羊抗鼠 pAb 固定于硝酸纤维膜上。检测时，当被检尿样虹吸通过胶体金标记抗 HCG McAb 时，形成抗原抗体胶体金复合物，复合物继续爬行，通过包被的抗 HCG pAb 时，形成 双抗体夹心胶体金复合物，在包被条带处呈现色带，过量的胶体金抗体继续爬行，和羊抗鼠