实验九、畜禽原虫病 内容： 1.伊氏锥虫形态观察及实验室诊断。 牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛泰勒虫形态观察。 目的 ，能够鉴别其主要形态特征并掌握伊氏锥虫的常规诊断法 evansi在分类学上属于鞭毛虫纲Mastigophora锥虫科 Trypano somatidae属Trypanos 宿主与寄生部位：寄生于马、驴、骡、牛、水牛、骆驼和犬等家畜的血浆内 形态特征：伊氏锥虫为单形锥虫。 长1834微米，宽12微米， 平均为24×2微米，前端比后 健盗膜发热薇多策电游高豫毛长6微发内细胞核〈主核)位于虫休中尖椭圆形的 少革 核的染 多在枚的 在姬氏染色的血片中，核 传播老 蝇及蝇是其主要传播者 伊氏锥虫病实验室诊断 (1)全血压滴标本检查法 在洁净的载玻片上滴病畜血液一小滴，与放在载玻片上的一滴生理盐水混合后，覆以盖玻 片，用400600倍高倍镜观察，如有锥虫，多在血细胞间活泼地运动。但每次镜检必须观察100200 入视野以上。 冬季室温过低时，锥虫活动力减弱不易观察到， 这时可将玻片放在酒精灯上稍稍加 量体粉强维晒被牛外，在血液干调后检在，维虫往往死亡影咱检查结果。此法在血内 时，染色标本检查法 从耳静脉平 至心作二张以上涂片 兰色，细胞核和鞭毛染成淡红紫色。 虫体原生质染成淡 「容易得到阳性结果 (3)血液厚滴涂片标本检查法 取血 一大滴放在载玻片中央处，用另一玻片角将血液堆成直径约1厘米的涂面，在空气中自 然干燥，然后用冰醋酸1毫升，加蒸馏水100毫升配成的液体处理数分钟将红细胞全部溶解后，再使 涂片干燥。以甲醇固定后，再用姬萨染色镜检，此法比涂片染色标本容易找到虫体。 感在预先装有枸修酸钠每毫升血约用5毫克)的沉淀管内， 标不检于 可在 这管然 23小时 取红细胞层表面物少量，滴一小滴于载玻片上，作成压滴标本镜检，每头牛作2>4个压滴标本，每个 压滴标本应观察100个以上的视野 活锥虫集结试验（团集反 滴置于载玻片上，再加入 容里病则薇镜行若到虫体就以后编相家，有鞭毛的一 备忠有锥 可取可疑动物的血液，接种于实验动物（小白鼠0.21.0毫 接种后第二天开始用压滴法检查尾血中是否有锥虫出现，至少要持续检查 丹的皮下求腹腔大发体可过不粉看为明性。此法出率较高，一 个月。如 (7)间接血疑试验 ①致敏血球悬液的制造： 锥虫抗原的制备：用小白鼠从疫区采回虫种， 分别保种于海猪备用，用时再取海猪心 用任两株的混合里 )保程 余下 中渣可用型
实验九、畜禽原虫病 一．内容： 1．伊氏锥虫形态观察及实验室诊断。 2．牛双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、牛泰勒虫形态观察。 3．弓形体形态观察。 4．鸡、兔球虫形态观察。 5．住肉抱子虫形态观察。 二．目的：通过上述虫体观察，能够鉴别其主要形态特征并掌握伊氏锥虫的常规诊断法。 三．参考资料： 1．伊氏锥虫Trypanosoma evansi在分类学上属于鞭毛虫纲Mastigophora锥虫科 Trypanosomatidae属Trypanosoma。 宿主与寄生部位：寄生于马、驴、骡、牛、水牛、骆驼和犬等家畜的血浆内。 形态特征：伊氏锥虫为单形锥虫。长18~34微米，宽1~2微米，平均为24×2微米，前端比后 端尖；波动膜发达，宽而多皱曲，游离鞭毛长6微米，细胞核（主核）位于虫体中央，呈椭圆形，动 基体距虫体后端约1.5微米，呈圆形或短杆形，胞浆内含有少量的空泡；核的染色质颗粒多在核的前 部。在压滴血液标本中，原地运动时相当活泼，而前进运动时比较迟缓，在姬氏染色的血片中，核 与动基体呈深红紫色，鞭毛呈红色，波动膜呈粉红色，原生质呈淡天兰色。 传播者：虻、螫蝇及虱蝇是其主要传播者。 伊氏锥虫病实验室诊断： （１）全血压滴标本检查法 在洁净的载玻片上滴病畜血液一小滴，与放在载玻片上的一滴生理盐水混合后，覆以盖玻 片，用400~~600倍高倍镜观察，如有锥虫，多在血细胞间活泼地运动。但每次镜检必须观察100~200 个视野以上。冬季室温过低时，锥虫活动力减弱不易观察到，这时可将玻片放在酒精灯上稍稍加 温，以增强锥虫的活动力。此外，在血液干涸后检查，锥虫往往死亡，影响检查结果。此法在血内 虫体较少时，往往不易被发现。 （２）血涂片染色标本检查法 从耳静脉采血，至少作二张以上涂片，染色后镜检有无虫体用姬姆萨染色后，虫体原生质染成淡 兰色，细胞核和鞭毛染成淡红紫色。本法于病初体温升高时，采血作涂片，容易得到阳性结果。 （３）血液厚滴涂片标本检查法 取血一大滴放在载玻片中央处，用另一玻片角将血液堆成直径约1厘米的涂面，在空气中自 然干燥，然后用冰醋酸１毫升，加蒸馏水100毫升配成的液体处理数分钟将红细胞全部溶解后，再使 涂片干燥。以甲醇固定后，再用姬萨染色镜检，此法比涂片染色标本容易找到虫体。 （４）集虫检查法 自颈静脉采血约５毫升，盛在预先装有枸橼酸钠（每毫升血约用５毫克）的沉淀管内，混 合后，以1500转/分速度，离心沉淀3~5分钟，此时红细胞沉淀于管底，白细胞在红细胞上面。由于 虫体比重与白细胞相近，故虫体集中于白细胞层中。用吸管取白细胞层的材料作成压滴标本检查， 可以提高虫体的检出率。在没有离心机的情况下，可在5~10毫升的试管中预先放入２％枸橼酸钠生 理盐水2~5毫升，从颈静脉采血2~5毫升，轻轻摇匀，放置在试管架上，自然沉淀2~3小时，用吸管吸 取红细胞层表面物少量，滴一小滴于载玻片上，作成压滴标本镜检，每头牛作2~4个压滴标本，每个 压滴标本应观察100个以上的视野。 （５） 活锥虫集结试验（团集反应） 用人工感染小白鼠血中活锥虫血一滴置于载玻片上，再加入一滴被检查的牛清后，如此家 畜患有锥虫病则显微镜下可看到虫体就以后端相靠拢，有鞭毛的一端向外集结菊花瓣状。如被检牛 未受锥虫感染则虫体不集结。 （６）动物接种试验 在上述各种方法尚不能确诊时，可取可疑动物的血液，接种于实验动物（小白鼠0.2~1.0毫 升）的皮下或腹腔内，接种后第三天开始用压滴法检查尾血中是否有锥虫出现，至少要持续检查一 个月。如一个月后未发现虫体，可以不再检查，判为阴性。此法检出率较高。 （７）间接血疑试验 ①致敏血球悬液的制造： Ａ、锥虫抗原的制备：用小白鼠从疫区采回虫种，分别保种于海猪备用，用时再取海猪心 血接种于小白鼠，待见虫后用任两株的混合虫株接种于大白鼠或预先摘除脾脏的犬，经过四、五天 发病后将其放血于抗凝生理盐水之后，并用生理盐水多次离心（3000转/分，20分钟）洗涤将纯白虫 体，然后按虫体压积加pＨ7.2磷酸缓冲盐水（PBS）作10倍稀释。放低温（－25℃左右）保存备用。 当用其致敏血球时，取出在低温条件下反复冻融数次。离心取上清液即为抗原，余下的虫渣可用玛
瑙研钵研磨两小时后再冻融，离心取上清液并入上述抗原中，再按原虫体积计，加入pH7.2PBS中将 其稀释到1/500的浓度，即可用于致敏。 去上清液， 采取 血若干 用5 再用售大反复离心的公按票积翻 ,经常摇动。然后用2000转/分离心10分钟去上清液 (可收回反 得雪特男的聊大务洗态用政液的血绣液宝 ,用 37℃的水浴鞣化30分钟，同法离心去上清再用PBS离心洗三次，再配成5%的血球悬液， 等量加入含2%戊二醛的PBS于上述鞣化过的血球悬液中，摇匀，置室温醛化两小时， 同法离心去上清液 可回收反复用用，方法同内酮醛) 再用PS离心洗 严 新配的1/500抗原液直拉 钟， 即成致敏血球悬液 同时同法， 非致敏血球悬 作时昭压 凝集试验及其结果的判定 用V型或U型微量血凝板， 将被检血清用pH7.2PBS作倍比稀释。每孔0.0250.05毫升，同法做 两排。 一排加致敏血球悬液为测定排，另 排加非致敏血球悬液作对照排。每孔滴一滴（人用4号 针头，约0.007毫升)，同时两排后边再设1`2孔仅加稀释液PBS与血球悬液的空白对照，摇匀放室温 边沿呈光滑圆点状时，即可判定结果，测 一也球花 林凝集成 生双芽巴贝斯虫属于 巴贝斯虫科 Babesiidae 的巴斯属Babesia, (1)牛双芽巴贝斯虫 B.bigemina 宿主及寄生部位：寄生于黄牛、水牛的红细胞内。 形态特征：是一种大型虫体，其长度大于红细胞半径。有环形、椭圆形、梨形（单个或成 还可以见到 叶形的虫体 特征性虫 虫体边缘部。 传语牛色洗 microplus. 宿主及寄生部位：牛的红细胞内，属小型虫体 形特证：形念有环状、雨圆形 个或成双的梨形、边虫形和阿米巴形等，在繁殖过程 中出现三叶形的虫体。 何虫体是以两个 君炎梨体的长度小于红细径，其有 多数 子硬蜱和全沟硬 宿主及寄生部位：宿生在牛的网状内皮细胞和红细胞内 形态特征：形态多样化，环形虫体呈戒指状，最为常见，染色质一团，居虫体一侧边缘 上，姬氏法染色后，原生质呈淡兰色，染色质呈红色。大小为0.81.7微米，椭圆形虫体比环形者略 长略大，其长宽比例为1.5：1，两端钝圆，大小为1.52.1×0.7微米。杆状虫体 而阻， 而细， 大小0 由4 虫体到 个红外内的闪皮系统的虫 体 存在于淋巴细胞的单核细胞 游离于淋巴 姬氏染色后 型的原表包备有1不的位丙光米的， 红色或暗紫色的染色质 榴体为中体 裂殖体阶段，它在形态上有多种类型， 并产生直径为22.5微米的大裂殖子，另一种为小裂殖体，它含有直径为0.30.8微米的染色质颗 粒，并产生直径为0.71.0微米的小裂殖子。 传播者：璃眼牌属的各种螺
瑙研钵研磨两小时后再冻融，离心取上清液并入上述抗原中，再按原虫体积计，加入pＨ7.2PBS中将 其稀释到１/500的浓度，即可用于致敏。 Ｂ、致敏血球的制备，步骤如下： ａ、采取2~5岁健康公绵羊脱纤血若干，用生理盐水将其稀释20倍，2000转/分离心15分钟 去上清液，再用生理盐水反复离心洗三次，然后按血球压积计，用pH7.2PBS配成5％血球悬液。 ｂ、等量加入含２％丙酮醛的PBS于5％的血球悬液中，摇匀，置室温30分钟后。再置普通 冰箱内醛化固定17小时，经常摇动。然后用2000转/分离心10分钟去上清液（可收回反复再几次，用 时则直接将血球压积稀释成2.5％的悬液即成）用PBS离心洗三次，再用PBS配成５％的血球悬液。 ｃ、等量加入１/２万的鞣酸生理盐水溶液于上述醛化过的５％的血球悬液中，摇匀，置 37℃的水浴鞣化30分钟，同法离心去上清再用PBS离心洗三次，再配成５％的血球悬液。 ｄ、等量加入含２％戊二醛的PBS于上述鞣化过的血球悬液中，摇匀，置室温醛化两小时， 同法离心去上清液（可回收反复用用，方法同丙酮醛），再用PBS离心洗三次。 ｅ、用上述新配的1/500抗原液直接稀释血球压积成50％血球悬液，放37℃水中热致敏40分 钟，或放4℃冷致敏7天，最后离心去上清液和用PBS离心洗三次，再用含0.5~1％健康兔血清PBS配成 ２％的血球悬液，并按0.1％计，加叠氮钠防腐，即成致敏血球悬液。同时同法，做一批不加抗原的 非致敏血球悬液，作对照用。 ②、凝集试验及其结果的判定 用Ｖ型或Ｕ型微量血凝板，将被检血清用pＨ7.2PBS作倍比稀释。每孔0.025~0.05毫升，同法做 两排。一排加致敏血球悬液为测定排，另一排加非致敏血球悬液作对照排。每孔滴一滴（人用４号 针头，约0.007毫升），同时两排后边再设1~2孔仅加稀释液PBS与血球悬液的空白对照，摇匀放室温 （25~30℃）1~2小时。待空白对照孔血球全部淀于孔底，边沿呈光滑圆点状时，即可判定结果，测 定排各孔的血球呈均匀薄层平铺于孔底似毛玻璃状，或其边沿有不规则的皱缩。又或血球凝集成一 小圆圈状，或其边沿有小颗粒血球凝块等。均可判为阳性反应。否则如空白对照孔为阴性反应，对 照排可能也有非特异性凝集， 但其凝集的最高倍数要比测定排低两个滴度以上。 并且测定排凝 集价要在80度以上才能判定被检血清为阳性。 2．牛双芽巴贝斯虫属于孢子虫纲Sporozoa，血孢子虫目Haemosporidia，巴贝斯虫科 Babesiidae 的巴斯属Babesia，牛泰勒虫属于泰勒科Theieeriidae泰勒属Theileria。 （１）牛双芽巴贝斯虫 B.bigemina 宿主及寄生部位：寄生于黄牛、水牛的红细胞内。 形态特征：是一种大型虫体，其长度大于红细胞半径。有环形、椭圆形、梨形（单个或成 对）和变形虫形等不同形状的虫体，在进行出芽生殖过程中，还可以见到三叶形的虫体。特征性虫 体是两个梨籽形虫体以尖端相连构成锐角，其长度大于红细胞半径，绝大多数位于红细胞的中央。 一个红细胞内多为1~2个虫体，姬姆萨染色后，原生质呈淡兰色，边缘较深，中央部分淡染或不着 色，呈空泡状的无色区，染色质多为两团，位于虫体边缘部。环形虫体的直径为1.4~3.2微米，单梨 形虫体长2.8~6微米。 传播者：微小牛蜱B.microplus。 （２）牛巴贝斯虫B.bovis 宿主及寄生部位：牛的红细胞内，属小型虫体。 形态特征：形态有环状、椭圆形、单个或成双的梨形、边虫形和阿米巴形等，在繁殖过程 中出现三叶形的虫体。特征性虫体是以两个梨形虫体以尖端相连构成钝角，多位于红细胞的边缘， 少数位于中央。梨形虫体的长度小于红细胞半径。具有一团染色质。病的初期以环形和边虫形为 多，以后出现梨形虫体。 传播者：蓖子硬蜱和全沟硬蜱 I.persulcatus。 （３）牛泰勒虫 多数指的是环形泰勒虫T.annulata 宿主及寄生部位：宿生在牛的网状内皮细胞和红细胞内。 形态特征：形态多样化，环形虫体呈戒指状，最为常见，染色质一团，居虫体一侧边缘 上，姬氏法染色后，原生质呈淡兰色，染色质呈红色。大小为0.8~1.7微米，椭圆形虫体比环形者略 长略大，其长宽比例为1.5:1，两端钝圆，大小为1.5~2.1×0.7微米。杆状虫体一端较粗，一端细， 弯曲或不弯曲，染色质团在粗端，形似钉子或大头针，长约1.0~2.0微米。圆点状或边虫状虫体没有 明显的原生质，由染色质组成，大小为0.7~0.8微米，十字形虫体不常见，由４个圆点状虫体组成， 原生质不明显，大小为1.6微米，一个红细胞内的虫体数可以有1~12个不等，常见的1~3个，各种形 态的虫体可同时出现于一个红细胞内。另外寄生在网状内皮系统的虫体称石榴体（或称柯赫氏兰 体），存在于淋巴细胞的单核细胞内，也可游离于淋巴液中，偶见于血浆中，大小为2.2~27.5微 米，姬氏染色后，在浅兰色的原浆里包含有数目不等的微红色或暗紫色的染色质，石榴体为虫体的 裂殖体阶段，它在形态上有多种类型，一种为大裂殖体，体内含有直径0.4~1.9微米的染色质颗粒， 并产生直径为2~2.5微米的大裂殖子，另一种为小裂殖体，它含有直径为0.3~0.8微米的染色质颗 粒，并产生直径为0.7~1.0微米的小裂殖子。 传播者：璃眼蜱属的各种蜱
3.刚第弓形体Toxoplasma gondii又称刚第弓浆虫，目前认为弓形体只有这一种。 宿主与寄生部位：弓形体的宿主范围很广，包括人、狒狒、黑猩猩、箭猪、小白鼠、骆 驼、兔、松鼠、地鼠、野兔、狸、犬、猫、狐狸、水貂、羊、猪、牛、鸽、鸡、青雷鸟等几十种之 多，为细胞内寄生。 形态特征：根据其发育阶段不同分为五型，即滋养体、包囊出现在中间宿主一一猪等体 内。卵囊、裂殖体、配子体出现在终末宿主一一猫体内。 滋养体呈新月形、香焦形或弓形，大小为47×24微米，一端稍尖，一端钝圆。姬氏 染色后，胞浆呈浅兰色，有颗粒，核呈深兰紫色，偏于钝圆一端。 包囊 呈圆形或椭圆形，有较厚的囊膜，囊中的滋养体可多达50个左右，包囊的直径可 达5060微米。 4.家畜球虫病原体是孢子虫纲球虫目虫艾美耳科的原虫，均系细胞内寄生。各种家畜都有 其专性寄生的球虫，而不互相感染。在兽医上重要的有两个属，即艾美耳属和等孢属。 艾美耳属Eimeria:特点是卵囊内的胚孢子形成四个孢子囊，每个孢囊内含两个子孢子。广 泛寄生于各种家畜。 等孢属Isospora:特点是卵囊内胚孢子形成四个孢子囊，每个孢子囊内含四个子孢子。通 常寄生于人、犬及其它肉食动物。 寄生于鸡、兔体内的球虫属于艾美尔属。 卵囊：在椭圆形、圆形、卵圆形等不同形状。囊壁有二层，外层为保护性膜，结实，有较 大的弹性，内层为小颗粒层，卵囊内原生质呈颗粒状。有些种类的卵囊有明显的卵膜孔，有些卵囊 内膜突出于卵膜孔外形成极帽。 5.住肉孢子虫：属于孢子虫纲，住肉孢子虫属Sarcocystis,为多种家畜的寄生虫，偶 尔也寄生于人。常见的有： 羊住肉孢子虫S.tenella 为较大的一种，呈卵圆形或椭圆形，长1厘米。主要寄生于绵 羊、山羊和猪的食道、膈肌和心肌。 牛住肉孢子虫S.fusiformis 长1厘米或更大些，主要寄生在牛的横纹肌、心肌和食 道。 马住肉孢子虫S.bertrami 呈乳白色线状，长0.61厘米。寄生于马、驴、骡的心肌和横 纹肌。 各种住肉孢子虫在形态构造上均大致相同，通常见到的虫体是寄生在肌肉组织间的，与肌 纤维平行的包囊状物（孢子囊），多呈纺锤形、卵圆形或圆柱形等形状，色灰白至乳白，小的肉眼 难以看到，大的可以长达1厘米至数厘米。 孢子囊又“米休尔氏囊”。长0.5`4厘米，宽可达3毫米。囊壁由两层组成，内壁向囊内延 伸，构成很多中隔，将囊腔分成若干小室。发育成熟的孢子囊，小室中包藏有许多肾形、镰刀形或 香蕉形的滋养体（又称南雷小体Raineys corpuscle),长约1012微米，宽49微米，一端稍尖， 一端钝圆，核偏于钝圆一端，胞浆中有许多异染颗粒。 四.作业： 1.绘伊氏锥虫形态图，并标明其结构特征。 2.绘双芽巴贝斯虫及巴贝斯虫寄生形态图，并简要说出其鉴别特征。 3.绘出艾美尔属球虫卵囊的模式图
3．刚第弓形体Toxoplasma gondii 又称刚第弓浆虫，目前认为弓形体只有这一种。 宿主与寄生部位：弓形体的宿主范围很广，包括人、狒狒、黑猩猩、箭猪、小白鼠、骆 驼、兔、松鼠、地鼠、野兔、狸、犬、猫、狐狸、水貂、羊、猪、牛、鸽、鸡、青雷鸟等几十种之 多，为细胞内寄生。 形态特征：根据其发育阶段不同分为五型，即滋养体、包囊出现在中间宿主——猪等体 内。卵囊、裂殖体、配子体出现在终末宿主——猫体内。 滋养体 呈新月形、香焦形或弓形，大小为4~7×2~4微米，一端稍尖，一端钝圆。姬氏 染色后，胞浆呈浅兰色，有颗粒，核呈深兰紫色，偏于钝圆一端。 包囊 呈圆形或椭圆形，有较厚的囊膜，囊中的滋养体可多达50个左右，包囊的直径可 达50~60微米。 4．家畜球虫病原体是孢子虫纲球虫目虫艾美耳科的原虫，均系细胞内寄生。各种家畜都有 其专性寄生的球虫，而不互相感染。在兽医上重要的有两个属，即艾美耳属和等孢属。 艾美耳属Eimeria：特点是卵囊内的胚孢子形成四个孢子囊，每个孢囊内含两个子孢子。广 泛寄生于各种家畜。 等孢属Isospora：特点是卵囊内胚孢子形成四个孢子囊，每个孢子囊内含四个子孢子。通 常寄生于人、犬及其它肉食动物。 寄生于鸡、兔体内的球虫属于艾美尔属。 卵囊：在椭圆形、圆形、卵圆形等不同形状。囊壁有二层，外层为保护性膜，结实，有较 大的弹性，内层为小颗粒层，卵囊内原生质呈颗粒状。有些种类的卵囊有明显的卵膜孔，有些卵囊 内膜突出于卵膜孔外形成极帽。 5．住肉孢子虫：属于孢子虫纲，住肉孢子虫属Sarcocystis，为多种家畜的寄生虫，偶 尔也寄生于人。常见的有： 羊住肉孢子虫S.tenella 为较大的一种，呈卵圆形或椭圆形，长１厘米。主要寄生于绵 羊、山羊和猪的食道、膈肌和心肌。 牛住肉孢子虫S.fusiformis 长１厘米或更大些，主要寄生在牛的横纹肌、心肌和食 道。 马住肉孢子虫S.bertrami 呈乳白色线状，长0.6~1厘米。寄生于马、驴、骡的心肌和横 纹肌。 各种住肉孢子虫在形态构造上均大致相同，通常见到的虫体是寄生在肌肉组织间的，与肌 纤维平行的包囊状物（孢子囊），多呈纺锤形、卵圆形或圆柱形等形状，色灰白至乳白，小的肉眼 难以看到，大的可以长达１厘米至数厘米。 孢子囊又“米休尔氏囊”。长0.5~4厘米，宽可达3毫米。囊壁由两层组成，内壁向囊内延 伸，构成很多中隔，将囊腔分成若干小室。发育成熟的孢子囊，小室中包藏有许多肾形、镰刀形或 香蕉形的滋养体（又称南雷小体 Raineys corpuscle），长约10~12微米，宽4~9微米，一端稍尖， 一端钝圆，核偏于钝圆一端，胞浆中有许多异染颗粒。 四．作业： 1．绘伊氏锥虫形态图，并标明其结构特征。 2．绘双芽巴贝斯虫及巴贝斯虫寄生形态图，并简要说出其鉴别特征。 3．绘出艾美尔属球虫卵囊的模式图