第一部分细菌学实验方法 细菌是单细胞原核生物,体积小、半透明,且种类繁多、适应环境能力强、繁殖快、代 谢活泼,易发生变异和产生耐药性。病原性细菌能产生内、外毒素及其他侵袭力物质,引起 人和动物的感染性疾病。针对对细菌生物学特性已经建立了一系列的检测和研究方法,基本 的研究和检测方法包括细菌的染色和形态学观察、人工培养、生化反应、致病物质检测、遗 传变异硏究、动物实验、药物敏感试验、免疫应答等。细菌学检测通常包括査菌和査抗体两 个方面。通过第一部分八组实验方法的训练,学生可基本掌握临床细菌学检查的常用方法 实验一细菌的染色检查法 细菌为无色半透明,未经染色不易观察其形态和结构,需经染色,显微镜放大后才清晰 可见。对细菌进行染色和观察,首先需要将临床标本或待检的细菌培养物制备成涂片,再经 相应的染色法染色后,于光学显微镜下观察。 染色方法有单染和复染两种,前者应用一种染料使细菌着色,用以观察细菌的大小、形 态和排列;后者用2种或2种以上的染料,有助于鉴别细菌,故又称鉴别染色法。常用的单 染法有美蓝和复红染色,复染法有革兰染色法和抗酸染色法。此外,还有对细菌的芽胞、鞭 毛、荚膜、细胞壁等特殊结构的特殊染色法。 细菌涂片的制作 要进行细菌染色,首先需作涂片,细菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三个步骤。 (一)涂片 1.取清洁无油载片一张,在其中央加一滴生理盐水,注意生理盐水越少越好,因为生 理盐水加多了会徒劳的延长图片的烘干时间。 2.将接种环用火焰烧红灭菌,待冷却后自琼脂斜面上取细菌少许,混于盐水滴中,轻 轻涂抹成直径约1cm大小的均匀悬液,然后将接种环烧红灭菌。制作涂片时所取的菌量不宜 过多,以免涂抹不均使细菌聚集成团,影响结果观察。若取液体标本(如肉汤培养物、脓液、 痰液等)作涂片时,可不加生理盐水而直接取标本涂片。 如用一张玻片同时做几种细菌涂片时,可用蜡笔将玻片分为数格,做好标记再进行涂片, 以免混淆。 3.接种环的灭菌和取菌法(图1-1) 灭菌:接种环在取菌前后,其金属丝部分必须用火焰烧红灭菌。方法是右手拿接种环, 将接种环垂直或15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌,待金属丝烧红后,斜执接种环将金 属柄缓慢通过火焰灭菌。切记未经灭菌的接种环不能取菌,取菌后的接种环必须灭菌后才能
1 第一部分 细菌学实验方法 细菌是单细胞原核生物，体积小、半透明，且种类繁多、适应环境能力强、繁殖快、代 谢活泼，易发生变异和产生耐药性。病原性细菌能产生内、外毒素及其他侵袭力物质，引起 人和动物的感染性疾病。针对对细菌生物学特性已经建立了一系列的检测和研究方法，基本 的研究和检测方法包括细菌的染色和形态学观察、人工培养、生化反应、致病物质检测、遗 传变异研究、动物实验、药物敏感试验、免疫应答等。细菌学检测通常包括查菌和查抗体两 个方面。通过第一部分八组实验方法的训练，学生可基本掌握临床细菌学检查的常用方法。 实验一 细菌的染色检查法 细菌为无色半透明，未经染色不易观察其形态和结构，需经染色，显微镜放大后才清晰 可见。 对细菌进行染色和观察,首先需要将临床标本或待检的细菌培养物制备成涂片，再经 相应的染色法染色后，于光学显微镜下观察。 染色方法有单染和复染两种，前者应用一种染料使细菌着色，用以观察细菌的大小、形 态和排列；后者用 2 种或 2 种以上的染料，有助于鉴别细菌，故又称鉴别染色法。常用的单 染法有美蓝和复红染色，复染法有革兰染色法和抗酸染色法。此外，还有对细菌的芽胞、鞭 毛、荚膜、细胞壁等特殊结构的特殊染色法。 一、细菌涂片的制作 要进行细菌染色，首先需作涂片，细菌涂片的制作分涂片、干燥和固定三个步骤。 （一）涂片 1．取清洁无油载片一张，在其中央加一滴生理盐水，注意生理盐水越少越好，因为生 理盐水加多了会徒劳的延长图片的烘干时间。 2．将接种环用火焰烧红灭菌，待冷却后自琼脂斜面上取细菌少许 ，混于盐水滴中，轻 轻涂抹成直径约 1cm 大小的均匀悬液，然后将接种环烧红灭菌。制作涂片时所取的菌量不宜 过多，以免涂抹不均使细菌聚集成团，影响结果观察。若取液体标本（如肉汤培养物、脓液、 痰液等）作涂片时，可不加生理盐水而直接取标本涂片。 如用一张玻片同时做几种细菌涂片时，可用蜡笔将玻片分为数格，做好标记再进行涂片， 以免混淆。 3．接种环的灭菌和取菌法（图 1-1） 灭菌：接种环在取菌前后，其金属丝部分必须用火焰烧红灭菌。方法是右手拿接种环， 将接种环垂直或 15°角放在煤气灯的外焰中烧灼灭菌，待金属丝烧红后，斜执接种环将金 属柄缓慢通过火焰灭菌。切记未经灭菌的接种环不能取菌，取菌后的接种环必须灭菌后才能
放在实验台上。 取菌:用左手拇指与食指中指夹住琼脂斜面试管下端,斜面朝上,试管倾斜,用右手转 动一下管口棉塞或塑料塞,在近火焰处用右手小指与掌面夹住棉塞或塑料塞并拔出,已拔出 的棉塞或塑料塞不可放在实验台上,也不可触及任何物品。试管口用火焰灭菌后,用已灭菌 并冷却的接种环伸入培养管中,自斜面上轻轻刮取细菌,取菌后将试管口再次灭菌,塞好棉 塞或塑料塞放回原处。 (二)干燥 涂片于室温自然干燥,必要时可将标本涂抹面向上,在离火焰半尺高处微微烘干。切忌 高热 (三)固定 常用加热固定法,其目的是杀死细菌,使菌体与玻片粘附牢固,在染色时不致被染液和 水冲掉。手执玻片的一端,标本面朝上,来回通过火焰3次,注意温度不可太高,以玻片反 面触及皮肤,感觉微烫为宜。 图1—1接种环取菌、灭菌法
2 放在实验台上。 取菌：用左手拇指与食指中指夹住琼脂斜面试管下端，斜面朝上，试管倾斜，用右手转 动一下管口棉塞或塑料塞，在近火焰处用右手小指与掌面夹住棉塞或塑料塞并拔出，已拔出 的棉塞或塑料塞不可放在实验台上，也不可触及任何物品。试管口用火焰灭菌后，用已灭菌 并冷却的接种环伸入培养管中，自斜面上轻轻刮取细菌，取菌后将试管口再次灭菌，塞好棉 塞或塑料塞放回原处。 （二）干燥 涂片于室温自然干燥，必要时可将标本涂抹面向上，在离火焰半尺高处微微烘干。切忌 高热。 （三）固定 常用加热固定法，其目的是杀死细菌，使菌体与玻片粘附牢固，在染色时不致被染液和 水冲掉。手执玻片的一端，标本面朝上，来回通过火焰 3 次，注意温度不可太高，以玻片反 面触及皮肤，感觉微烫为宜。 图 1－1 接种环取菌、灭菌法
常用细菌染色法 (一)单染色—美兰染色法 【材料】 菌株:白喉棒状杆菌吕氏血清斜面培养物 试剂:碱性美兰染液、生理盐水。 器材:载玻片、接种环、等 【方法 细菌涂片制作:参照“细菌涂片的制作”。 染色:在细菌涂片上滴加碱性美兰染液1-2滴,染色1-2分钟后细流水冲洗。 吸干:用吸水纸吸干玻片上水分,自然干燥2分钟 镜检:用油镜观察染好的玻片。 【结果】白喉棒状杄菌菌体呈淡蓝色,异染颗粒呈深蓝色。 (二)复染色 1.革兰染色法 【原理】革兰氏染色的原理尚未完全阐明.目前主要有细菌等电点\化学结构及细胞膜通透性 等三种学说:(1)革兰氏阳性菌等电点在PH2^3,比阴性菌(PH4^5)为低.因此阳性菌和碱性染 料的结合力比阴性菌强.(2)革兰氏阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合而 不易脱色.(3)革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜的通透性较低.因此,染料和碘的复合物不易为 乙醇所溶出.所以阳性菌仍保持原来的紫色,而阴性菌染成的紫色可被酒精脱掉后复染成红 【材料】 菌株:葡萄球菌,大肠埃希菌18-24小时普通琼脂斜面培养物。 试剂:快速革兰染色试剂盒(结晶紫染液、碘酒、95%酒精、稀释复红),生理盐 器材:载物玻片,接种环等。 【方法】 初染:涂片上加几滴结晶紫染液,染色10秒,用细流水冲洗剩留染液,甩去片上积水 煤染:加碘液,10秒,用细流水冲洗剩留染液,并甩去片上积水 脱色:加95%酒精,频频摇动玻片数秒,斜执玻片使酒精流去,再加数滴酒精,至流下的 酒精无色为止(10-20秒),细流水冲洗,甩去积水。 复染:加稀释复红10秒,细流水冲洗,甩去积水 吸水纸吸干玻片水分,并自然干燥2分钟 镜检:于光学显微镜下油镜头镜下观察 [结果]葡萄球菌经染色后呈紫色,为革兰氏阳性菌;大肠杆菌染色后呈红色,为革兰氏 阴性菌
3 二、常用细菌染色法 （一）单染色——美兰染色法 【材料】 菌株：白喉棒状杆菌吕氏血清斜面培养物 试剂：碱性美兰染液、生理盐水。 器材：载玻片、接种环、等 【方法】 细菌涂片制作：参照“细菌涂片的制作”。 染色：在细菌涂片上滴加碱性美兰染液 1-2 滴，染色 1-2 分钟后细流水冲洗。 吸干：用吸水纸吸干玻片上水分，自然干燥 2 分钟。 镜检：用油镜观察染好的玻片。 【结果】白喉棒状杆菌菌体呈淡蓝色，异染颗粒呈深蓝色。 （二）复染色 1.革兰染色法 【原理】革兰氏染色的原理尚未完全阐明.目前主要有细菌等电点\化学结构及细胞膜通透性 等三种学说: (1)革兰氏阳性菌等电点在 PH2~3,比阴性菌(PH4~5)为低.因此阳性菌和碱性染 料的结合力比阴性菌强. (2)革兰氏阳性菌含有核糖核酸镁盐,易和结晶紫-碘复合物结合而 不易脱色. (3)革兰氏阳性菌细胞壁及细胞膜的通透性较低.因此,染料和碘的复合物不易为 乙醇所溶出. 所以阳性菌仍保持原来的紫色,而阴性菌染成的紫色可被酒精脱掉后复染成红 色。 【材料】 菌株：葡萄球菌,大肠埃希菌 18-24 小时普通琼脂斜面培养物。 试剂：快速革兰染色试剂盒（结晶紫染液、碘酒、95%酒精、稀释复红），生理盐水。 器材：载物玻片,接种环等。 【方法】 初染：涂片上加几滴结晶紫染液，染色 10 秒，用细流水冲洗剩留染液，甩去片上积水。 煤染：加碘液，10 秒，用细流水冲洗剩留染液，并甩去片上积水。 脱色：加 95%酒精，频频摇动玻片数秒，斜执玻片使酒精流去，再加数滴酒精，至流下的 酒精无色为止（10-20 秒），细流水冲洗，甩去积水。 复染：加稀释复红 10 秒，细流水冲洗，甩去积水。 吸水纸吸干玻片水分，并自然干燥 2 分钟。 镜检：于光学显微镜下油镜头镜下观察 [结果]葡萄球菌经染色后呈紫色，为革兰氏阳性菌；大肠杆菌染色后呈红色，为革兰氏 阴性菌
【注意事项】 脱色是革兰染色中的关键步骤,脱色过度,可使G+菌被误染为G-菌;脱色不够,则G 菌可被误染为G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关,一般以涂片薄而均匀为好。 细菌的染色反应,还受多种因素如菌龄、染色时间、p等的影响,只有严格正规操作 才能得到正确结果。 【附录】 1,革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 甲液(结晶紫酒精饱和液):取14g结晶紫溶于100m195%的酒精内 乙液(1%草酸铵水溶液):草酸铵0.8g溶于80m蒸馏水中 将已配好的甲液20m1和乙液80m1混合即成结晶紫染液,置瓶中备用. (2)芦戈( Lugol)氏碘液 试剂:碘1g:碘化钾2g;蒸馏水300m 配制方法:先将碘化钾2ε溶于l0om蒸馏水中,再加碘1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏 水至300m1即成。 (3)95%酒精。 (4)石炭酸复红稀释液 碱性复红饱和溶液:碱性复红3.2克溶于95%酒精100m中。 1份碱性复红饱和液加9份5%石炭酸水溶液,先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用)。取 1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。 上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮存于棕色瓶内。 2抗酸染色法 【原理】结核杆菌对苯胺染料不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用3%盐酸酒 精处理也不易脱色,再经美兰复染,结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色,而非抗酸菌和细胞杂 质等呈蓝色。 【材料】 标本:结核病人痰液。 试剂:快速结核分枝杆菌染色试剂盒(石碳酸复红,盐酸酒精,美兰)。 器材:载玻片等。 【方法 涂片制备:取患者清晨咳出痰液,用接种环小心沾取痰液(黄脓痰及可疑部分)少 许作涂片,涂片自然干燥后,通过火焰固定,然后进行染色 染色方法
4 【注意事项】 脱色是革兰染色中的关键步骤，脱色过度,可使 G+菌被误染为 G- 菌；脱色不够，则 G- 菌可被误染为 G+菌。脱色时间的长短还与涂片厚薄有关，一般以涂片薄而均匀为好。 细菌的染色反应，还受多种因素如菌龄、染色时间、pH 等的影响，只有严格正规操作， 才能得到正确结果。 【附录】 1,革兰(Gram)染色液的配制 (1)结晶紫染液 甲液（结晶紫酒精饱和液）：取 14g 结晶紫溶于 100ml 95%的酒精内。 乙液（1%草酸铵水溶液）：草酸铵 0.8g 溶于 80ml 蒸馏水中。 将已配好的甲液 20ml 和乙液 80ml 混合即成结晶紫染液，置瓶中备用. (2)芦戈(Lugol)氏碘液 试剂：碘 1g; 碘化钾 2g; 蒸馏水 300ml。 配制方法：先将碘化钾 2g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加碘 1g,用力摇匀待溶解后加蒸馏 水至 300ml 即成。 (3)95%酒精。 (4)石炭酸复红稀释液 碱性复红饱和溶液：碱性复红 3.2 克溶于 95%酒精 100ml 中。 1 份碱性复红饱和液加 9 份 5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液(抗酸染色用)。 取 1 份石炭酸复红染液加 9 份蒸馏水即为稀释复红染液。 上述各种染液配成后,均需用滤纸过滤后使用,染液应贮存于棕色瓶内。 2.抗酸染色法 【原理】结核杆菌对苯胺染料不易着色,若加温或延长染色时间使其着色后,再用 3%盐酸酒 精处理也不易脱色,再经美兰复染,结核杆菌及其它分枝杆菌仍呈红色,而非抗酸菌和细胞杂 质等呈蓝色。 【材料】 标本：结核病人痰液。 试剂：快速结核分枝杆菌染色试剂盒（石碳酸复红，盐酸酒精，美兰）。 器材：载玻片等。 【方法】 涂片制备：取患者清晨咳出痰液，用接种环小心沾取痰液（黄脓痰及可疑部分）少 许作涂片，涂片自然干燥后，通过火焰固定，然后进行染色。 染色方法：
1)将涂片平放染色架上(或电热板上),滴加石炭酸复红液(盖满涂片处,染液量宜多) 静置5分钟,冷却后用细流水冲洗,甩去剩余水分 3)以3%盐酸酒精脱色,直至涂片几乎没有红色洗脱出为止,随即用细流水冲洗。 4)再用美蓝液复染lmin,用细流水冲洗,待自然干燥,用油镜检査。 【结果】抗酸菌染成红色,非抗酸菌染成蓝色。 (三)特殊染色法 1.细菌的荚膜染色 【原理】由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体 和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈.由于荚膜的含水量在90%以 上,故染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形. 【材料】 菌株:肺炎球菌 染色液和试剂:结晶紫、20%CuS04水溶液等 器材:载玻片、玻片搁架、擦镜纸、显微镜等 【方法】 (1)制片:提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌0.2ml,小鼠死亡后解剖,取腹腔液印片. 印片自然干燥,无需加热固定 (2)染色:滴加结晶紫染液,于火焰上加温染色,使冒蒸气,勿水洗.以20%CuS04溶液冲洗染液, 勿水洗,干后镜检 【结果】菌体呈现紫色,荚膜呈淡紫色。 2细菌的鞭毛染色 【目的】 【实验原理】细菌的鞭毛极细,直径一般为10—20m,只有用电子显微镜才能观察到.但是, 如采用特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到鞭毛染色方法很多,但其基本原理相 同,即在染色前先用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 【材料】 菌株:铜绿假单细胞菌半固体培养物 试剂: Leifson染色液,生理盐水等。 器材:载玻片接种环,显微镜等。 【方法 菌液的制备及涂片:将0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中。待凝固后在平板 中央点接活化了3-4代的细菌,恒温培养12-16h后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 改良的 Leifson染色法:加染色液使染料覆盖涂片。在染色过程中注意观察,当整个玻片都
5 1）将涂片平放染色架上（或电热板上），滴加石炭酸复红液（盖满涂片处，染液量宜多）， 静置 5 分钟，冷却后用细流水冲洗，甩去剩余水分。 3）以 3%盐酸酒精脱色，直至涂片几乎没有红色洗脱出为止，随即用细流水冲洗。 4）再用美蓝液复染 1min，用细流水冲洗，待自然干燥，用油镜检查。 【结果】抗酸菌染成红色，非抗酸菌染成蓝色。 （三）特殊染色法 1. 细菌的荚膜染色 【原理】由于荚膜与染料间的亲和力弱,不易着色,通常采用负染色法染荚膜,即设法使菌体 和背景着色而荚膜不着色,从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈.由于荚膜的含水量在 90%以 上,故染色时一般不加热固定,以免荚膜皱缩变形. 【材料】 菌株：肺炎球菌 染色液和试剂:结晶紫、20% CuSO4水溶液等。 器材: 载玻片、玻片搁架、擦镜纸、显微镜等。 【方法】 （1）制片:提前数日于小白鼠腹腔注射肺炎链球菌 0.2ml,小鼠死亡后解剖,取腹腔液印片. 印片自然干燥,无需加热固定。 (2)染色:滴加结晶紫染液,于火焰上加温染色,使冒蒸气,勿水洗.以 20%CuSO4溶液冲洗染液, 勿水洗,干后镜检。 【结果】菌体呈现紫色,荚膜呈淡紫色。 2.细菌的鞭毛染色 【目的】 【实验原理】细菌的鞭毛极细,直径一般为 10—20nm,只有用电子显微镜才能观察到.但是, 如采用特殊的染色法,则在普通光学显微镜下也能看到.鞭毛染色方法很多,但其基本原理相 同,即在染色前先用媒染剂处理,让它沉积在鞭毛上,使鞭毛直径加粗,然后再进行染色.常用 的媒染剂由丹宁酸和氯化高铁或钾明矾等配制而成。 【材料】 菌株：铜绿假单细胞菌半固体培养物 试剂：Leifson 染色液，生理盐水等。 器材：载玻片接种环,显微镜等。 【方法】 菌液的制备及涂片:将 0.3-0.4%的琼脂肉膏培养基熔化后倒入无菌平皿中。待凝固后在平板 中央点接活化了 3-4 代的细菌,恒温培养 12-16h 后,取扩散菌落的边缘制作涂片。 改良的 Leifson 染色法：加染色液使染料覆盖涂片。在染色过程中注意观察，当整个玻片都
出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时,直接用水轻轻冲洗(不要先倾去染料再清洗,否 则背景不清),染色时间大约10min ④镜检。自然干燥后,油镜检査。 【结果】菌体和鞭毛均染成红色 【注意事项】 (1)良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件,不宣用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料 因为老龄细菌鞭毛容易脱落 (2)染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件.不洁净的载玻片可经含适量洗衣 粉的水中煮沸约20min,取出后用清水充分洗净,沥干水后置95%酒精中处理,用时取出在 火焰上烧去酒精及可能残留的油迹 (3)细菌鞭毛极细,很易脱落,在整个操作过程中,必须仔细小心,以防鞭毛脱落.挑取菌时 尽可能不带培养基。 (4)配制合格的染色剂(尤其是B液)、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间 均是鞭毛染色成败的关键。 Leifson染色法易受菌种,菌龄和室温等因素的影响,且染色液须 经15-20次过滤,要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 3.芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体 着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状).芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色 后又难以脱色这一特点而设计的.所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的 染料外,还需要加热,以促进芽胞着色.当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗,芽胞染上的颜 色难以渗出,而菌体会脱色.然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的 颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察 【材料】 菌株:培养的枯草杆菌 试剂:5%孔雀绿水溶液,0.5%蕃红水溶液,生理盐水等。 器材:小试管,接种环,玻片等 【方法 涂片:按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 染色:加5%孔雀绿水溶液于涂片处(染料以铺满涂片为度),然后用酒精灯火焰加热玻片至染 液冒蒸汽时开始计算时间,约维持5min.加热过程中要随时添加染色液,切勿让标本干 涸.(加热时温度不能太高)。 水洗:待玻片冷却后,用水轻轻地冲洗,直至流出的水中无染色液为止 复染:用蕃红液染色5min;水洗,晾干或吸干。 镜检:先低倍,再高倍,最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态。 6
6 出现铁锈色沉淀、染料表面出现金色膜时，直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再清洗，否 则背景不清 ），染色时间大约 10min。 ④镜检。自然干燥后，油镜检查。 【结果】菌体和鞭毛均染成红色。 【注意事项】 （1）良好的培养物是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用陈旧培养物作鞭毛染色的菌种材料， 因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 （2）染色用玻片干净无油污是鞭毛染色成功的先决条件. 不洁净的载玻片可经含适量洗衣 粉的水中煮沸约 20min，取出后用清水充分洗净，沥干水后置 95%酒精中处理，用时取出在 火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 （3）细菌鞭毛极细,很易脱落,在整个操作过程中,必须仔细小心,以防鞭毛脱落. 挑取菌时， 尽可能不带培养基。 （4）配制合格的染色剂（尤其是 B 液 ）、充分洗去 A 液再加 B 液、掌握好 B 液的染色时间 均是鞭毛染色成败的关键。Leifson 染色法易受菌种,菌龄和室温等因素的影响,且染色液须 经 15-20 次过滤,要掌握好染色条件必须经过一些摸索。 3. 芽胞染色法 【实验原理】细菌的芽胞具有厚而致密的壁,透性低,不易着色,若用一般染色法只能使菌体 着色而芽胞不着色(芽胞呈无色透明状).芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色 后又难以脱色这一特点而设计的.所有的芽胞染色法都基于同一个原则:除了用着色力强的 染料外,还需要加热,以促进芽胞着色.当染芽胞时,菌体也会着色,然后水洗,芽胞染上的颜 色难以渗出,而菌体会脱色.然后用对比度强的染料对菌体复染,使菌体和芽胞呈现出不同的 颜色,因而能更明显地衬托出芽胞,便于观察。 【材料】 菌株：培养的枯草杆菌 试剂：5%孔雀绿水溶液,0.5%蕃红水溶液，生理盐水等。 器材：小试管,接种环,玻片等。 【方法】 涂片:按常规方法将待检细菌制成一薄的涂片。 染色:加 5%孔雀绿水溶液于涂片处(染料以铺满涂片为度),然后用酒精灯火焰加热玻片至染 液冒蒸汽时开始计算时间,约维持 5min.加热过程中要随时添加染色液,切勿让标本干 涸.(加热时温度不能太高)。 水洗:待玻片冷却后 ,用水轻轻地冲洗,直至流出的水中无染色液为止。 复染:用蕃红液染色 5min；水洗,晾干或吸干。 镜检:先低倍,再高倍,最后在油镜下观察芽胞和菌体的形态
【结果】芽胞呈绿色,菌体为红色。 4.镀银染色 【材料】 菌株:钩端螺旋体培养物 试剂 (1)固定液:冰醋酸1m1,甲醛2ml,蒸馏水100m1 (②)媒染液:鞣酸5g,石炭酸lg,蒸馏水10σm。硝酸银溶液:硝酸银5g,蒸馏水100ml (3)用前取银溶液20m1,逐滴加入100g/L氢氧化铵,至产生棕色沉淀,轻摇后溶解,微 呈乳白色 器材:玻片、接种环等 【方法】 涂片:取玻片一张,放盐水2-3环,取钩端螺旋体一环,混匀作成涂片,于空气中待自然干燥 (不可用火固定); 染色:滴加固定液于已干燥标本上经1-2分钟固定,用水冲洗:加媒染剂,加温至有蒸汽出 现,作用0.5min,水洗;加硝酸银染液微加温,染色0.5min,水洗待干,镜检。 【结果】螺旋体染成棕褐色/黑褐色 四、显微镜的使用和原理 光学显微镜的物镜有低倍、高倍和油镜3种。微生物学实验室经常使用油镜,因此油镜 的使用必须熟练掌握 (一)油镜头的识别:油镜头上一般刻有90x、100×、0il或在镜头的下缘划有一黑圈 (二)油镜使用法 1.对光:用低倍镜对光,检查染色标本时光线宜强,要抬高集光器,放大光圈。 2.观察标本 (1)滴加香柏油一小滴于染色标本片上,将标本置载物台上,移置待检部分于接物镜下 (②)将油镜头移至中央对准标本,观察者的头偏向镜筒左侧,眼睛从旁观察,并缓慢向 下转动粗调节器,使镜筒下降,直至镜头浸于镜油中,但不要碰到玻璃片。然后将眼睛移至 目镜,一面观察,一面向上徐徐转动粗调节器,至视野中看到模糊物像,再换用细调节器调 到物像清晰为止。 (3)观察标本时应两眼同时张开,左眼观察,右眼用于绘图并记录结果
7 【结果】芽胞呈绿色,菌体为红色。 4.镀银染色 【材料】 菌株：钩端螺旋体培养物 试剂： （1）固定液：冰醋酸 1ml，甲醛 2ml，蒸馏水 100ml。 （2）媒染液：鞣酸 5g，石炭酸 1g，蒸馏水 100ml。硝酸银溶液：硝酸银 5g，蒸馏水 100ml。 （3）用前取银溶液 20ml，逐滴加入 100g/L 氢氧化铵，至产生棕色沉淀，轻摇后溶解，微 呈乳白色。 器材：玻片、接种环等 【方法】 涂片：取玻片一张,放盐水 2-3 环,取钩端螺旋体一环,混匀作成涂片,于空气中待自然干燥 (不可用火固定)； 染色：滴加固定液于已干燥标本上经 1-2 分钟固定，用水冲洗；加媒染剂，加温至有蒸汽出 现，作用 0.5min ，水洗；加硝酸银染液微加温，染色 0.5min，水洗待干，镜检。 【结果】螺旋体染成棕褐色/黑褐色 四、显微镜的使用和原理 光学显微镜的物镜有低倍、高倍和油镜 3 种。微生物学实验室经常使用油镜，因此油镜 的使用必须熟练掌握。 （一）油镜头的识别：油镜头上一般刻有 90×、100×、0il 或在镜头的下缘划有一黑圈。 （二）油镜使用法 1．对光：用低倍镜对光，检查染色标本时光线宜强，要抬高集光器，放大光圈。 2．观察标本 (1) 滴加香柏油一小滴于染色标本片上，将标本置载物台上，移置待检部分于接物镜下。 (2) 将油镜头移至中央对准标本，观察者的头偏向镜筒左侧，眼睛从旁观察，并缓慢向 下转动粗调节器，使镜筒下降，直至镜头浸于镜油中，但不要碰到玻璃片。然后将眼睛移至 目镜，一面观察，一面向上徐徐转动粗调节器，至视野中看到模糊物像，再换用细调节器调 到物像清晰为止。 (3) 观察标本时应两眼同时张开，左眼观察，右眼用于绘图并记录结果
B’/A 玻璃//// 图1-2油镜的原理示意图 (4)标本观察完毕,向上转动粗调节器将镜筒提起,取下标本,用擦镜纸将镜头上的油 擦净。若油已干,可用擦镜纸沾少许二甲苯擦去油迹,随即用擦镜纸擦去二甲苯。然后将接 物镜转成“八”字形,以免损坏油镜。因二甲苯能溶解粘固透镜的胶质,如其未被擦去,日 久镜片将移位或脱落。 (三)显微镜油镜的原理(图1-2,图1-3) 自标本玻璃透过的光线,因介质密度不同,部分光线折射而不能进入物镜,使射入物镜 的光线减少。当使用高倍或低倍物镜时,透镜的孔径比较大,影响不显著,但油镜透镜孔径 很小,射入物镜内的光线很少,视野不明亮,物像模糊不清。若在油镜与载物玻片之间加 滴与玻璃折光率(n=1.52)相近的香柏油(n=1.55),使通过的光线不产生或少产生折射 增加进入透镜的光线,使视亮度增加,所以能清楚地看见物像 (2) 图1-3油镜加油前后光线折射比较 五、细菌形态、结构的观察 (一)细菌的基本形态 1.球菌:葡萄球菌(呈葡萄状排列)、链球菌(呈长链状排列)、脑膜炎双球菌(呈成双排 2.杆菌:大肠杆菌(呈分散状排列)、枯草杆菌(呈长链状排列)
8 D’ C’ B’ A’ 油 空 气 玻璃 A B C D 图 1-2 油镜的原理示意图 (4) 标本观察完毕，向上转动粗调节器将镜筒提起，取下标本，用擦镜纸将镜头上的油 擦净。若油已干，可用擦镜纸沾少许二甲苯擦去油迹，随即用擦镜纸擦去二甲苯。然后将接 物镜转成“八”字形，以免损坏油镜。因二甲苯能溶解粘固透镜的胶质，如其未被擦去，日 久镜片将移位或脱落。 （三）显微镜油镜的原理(图 1-2，图 1-3) 自标本玻璃透过的光线，因介质密度不同，部分光线折射而不能进入物镜，使射入物镜 的光线减少。当使用高倍或低倍物镜时，透镜的孔径比较大，影响不显著，但油镜透镜孔径 很小，射入物镜内的光线很少，视野不明亮，物像模糊不清。若在油镜与载物玻片之间加一 滴与玻璃折光率（n=1.52）相近的香柏油（n=1.55），使通过的光线不产生或少产生折射， 增加进入透镜的光线，使视亮度增加，所以能清楚地看见物像。 图 1-3 油镜加油前后光线折射比较 五、细菌形态、结构的观察 (一) 细菌的基本形态： 1．球菌：葡萄球菌(呈葡萄状排列)、链球菌(呈长链状排列)、脑膜炎双球菌(呈成双排 列)。 2．杆菌：大肠杆菌（呈分散状排列）、枯草杆菌（呈长链状排列）
3.弧菌:霍乱弧菌(呈分散状排列) (二)细菌的特殊结构: 1.芽胞:观察破伤风杆菌芽胞的形态 破伤风杆菌具有芽胞,用革兰染色法染色,可见破伤风杆菌为革兰氏阳性杆菌,菌体末 端有一个圆形未着色的芽胞,使整个细菌呈鼓槌状 2.荚膜:观察肺炎双球菌荚膜的形态(墨汁推片) 具有荚膜的肺炎双球菌用墨汁美蓝染色法染色后,可见菌体呈蓝色,荚膜则由墨汁黑色 背景衬托呈不着色之透明区 3.鞭毛:观察变形杆菌之鞭毛 经特殊染色法染色后,可见变形杆菌菌体周围有纤细的鞭毛。 思考题 1.观察细菌形态学的细菌涂片,为何必须制作得簿而均匀? 2.应为革兰阳性的细菌,若染成了阴性,可有哪些原因? 3.凡在显微镜下观察,发现涂片中得细菌呈红色,能否说“该细菌是革兰阴性细菌”? 为什么? (改编:王玉燕)
9 3．弧菌：霍乱弧菌（呈分散状排列）。 (二) 细菌的特殊结构： 1．芽胞：观察破伤风杆菌芽胞的形态 破伤风杆菌具有芽胞，用革兰染色法染色，可见破伤风杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体末 端有一个圆形未着色的芽胞，使整个细菌呈鼓槌状。 2．荚膜：观察肺炎双球菌荚膜的形态(墨汁推片) 具有荚膜的肺炎双球菌用墨汁美蓝染色法染色后，可见菌体呈蓝色，荚膜则由墨汁黑色 背景衬托呈不着色之透明区。 3.鞭毛：观察变形杆菌之鞭毛 经特殊染色法染色后，可见变形杆菌菌体周围有纤细的鞭毛。 思考题 1．观察细菌形态学的细菌涂片，为何必须制作得簿而均匀？ 2．应为革兰阳性的细菌，若染成了阴性，可有哪些原因？ 3．凡在显微镜下观察，发现涂片中得细菌呈红色，能否说“该细菌是革兰阴性细菌”？ 为什么？ （改编：王玉燕）
实验二细菌的人工培养 细菌的培养检査法是很重要的微生物学实验基本技术。显微镜检査有一定的局限性,如 标本内致病微生物含量少,或杂菌数量多,就需用人工培养法加以分离、增殖,然后根据其 特性加以鉴别并进行诊断。进行药物的无菌检查、菌苗的制备或基因工程中目的基因的扩增 及基因产物一目的蛋白的表达,也需进行细菌的人工培养。 培养基的配制 培养基是培养细菌的营养物制品,一般基础培养基应含有使细菌生长和繁殖的各种营养 物,包括蛋白胨、肉浸液、氯化钠、水分等,有时加琼脂以成固态。培养基按其物理性状分 固体、半固体和液体培养基。按其用途,可分基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别 培养基及厌氧培养基等。培养基制成后除含一定的营养外,还必须有一定的酸碱度(pH 7.2-7.6),本身必须澄清及保证无菌方可使用 培养基的主要用途有:(1)繁殖及分离细菌;(2)保存菌种;(3)鉴别细菌:(4)研究 细菌生理;(5)制备菌苗、抗生素或基因工程实验的细菌培养等 (一)肉汤培养基:肉汤培养基常用瘦牛肉制成,如无牛肉可用牛肉膏代替。 【成分】 新鲜绞碎瘦牛肉500g 氯化钠5g 蛋白胨 蒸馏水1000m1 【制法】 1.称取去筋膜无油脂的瘦牛肉500g,用绞肉机绞碎加水1000m1,搅匀浸于搪瓷锅内 置冰箱过夜,除去液面上的浮油。过夜的目的是使牛肉的水溶性养料充分的渗透出来。 2.次日取出,煮沸0.5h(若不经冰箱过夜,可直接煮沸1h)。用绒布过滤,肉汤中的 液体尽量挤净。 3.用1000ml肉汁中加蛋白胨10g,氯化钠5g,搅拌加热使完全溶解,并滤出肉汁,用 蒸馏水补足至原量 4.冷至40~50℃时,用氢氧化钠校正p至7.8,煮沸10min(因肉浸液中部份碳水化 合物经加热破坏,分解产酸而影响pH,加热可使其稳定),然后补充失去水分,用脱脂棉过 滤,滤液须澄清。 5.分装于试管或三角烧瓶,塞好棉塞或塑料塞,高压蒸气66.75N(15磅121℃)20mi 灭菌。 注:如有牛肉膏制肉汤培养基,配方如下: 牛肉膏 氯化钠 蛋白胨 蒸馏水 100ml
10 实验二 细菌的人工培养 细菌的培养检查法是很重要的微生物学实验基本技术。显微镜检查有一定的局限性，如 标本内致病微生物含量少，或杂菌数量多，就需用人工培养法加以分离、增殖，然后根据其 特性加以鉴别并进行诊断。进行药物的无菌检查、菌苗的制备或基因工程中目的基因的扩增 及基因产物－目的蛋白的表达，也需进行细菌的人工培养。 一、培养基的配制 培养基是培养细菌的营养物制品，一般基础培养基应含有使细菌生长和繁殖的各种营养 物，包括蛋白胨、肉浸液、氯化钠、水分等，有时加琼脂以成固态。培养基按其物理性状分 固体、半固体和液体培养基。按其用途，可分基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别 培养基及厌氧培养基等。培养基制成后除含一定的营养外，还必须有一定的酸碱度(pH 7.2-7.6)，本身必须澄清及保证无菌方可使用。 培养基的主要用途有：(1) 繁殖及分离细菌；(2) 保存菌种；(3) 鉴别细菌；(4) 研究 细菌生理；(5) 制备菌苗、抗生素或基因工程实验的细菌培养等。 （一）肉汤培养基：肉汤培养基常用瘦牛肉制成，如无牛肉可用牛肉膏代替。 【成分】 新鲜绞碎瘦牛肉 500g 氯化钠 5g 蛋白胨 10g 蒸馏水 1000ml 【制法】 1．称取去筋膜无油脂的瘦牛肉 500g，用绞肉机绞碎加水 1000ml，搅匀浸于搪瓷锅内， 置冰箱过夜，除去液面上的浮油。过夜的目的是使牛肉的水溶性养料充分的渗透出来。 2．次日取出，煮沸 0.5h (若不经冰箱过夜，可直接煮沸 1h)。用绒布过滤，肉汤中的 液体尽量挤净。 3．用 1000ml 肉汁中加蛋白胨 10g，氯化钠 5g，搅拌加热使完全溶解，并滤出肉汁，用 蒸馏水补足至原量。 4．冷至 40~50℃时，用氢氧化钠校正 pH 至 7.8，煮沸 10min (因肉浸液中部份碳水化 合物经加热破坏，分解产酸而影响 pH，加热可使其稳定)，然后补充失去水分，用脱脂棉过 滤，滤液须澄清。 5．分装于试管或三角烧瓶，塞好棉塞或塑料塞，高压蒸气 66.75N (15 磅 121℃)20min 灭菌。 注:如有牛肉膏制肉汤培养基，配方如下： 牛肉膏 0.5g 氯化钠 0.5g 蛋白胨 1g 蒸馏水 100ml
