第三章消毒、灭菌与兽医微生物实验室的生物安全消毒灭菌的基本概念微生物的特点，其生命活动极易受外界环境的影响，了解外界环境对微生物的影响，可以控制外界因素，达到充分利用微生物有利的一面，消灭其有害的一面，在理论上和实践上都具有重要意义。消毒（disinfection）杀死物体上的病原微生物，但不一定杀死全部微生物的方法。只要求达到消除传染性的目的。用于消毒的药品称为消毒剂（disinfectant）。一般消毒剂在常用浓度下只对细菌的繁殖体有效，对细菌的芽胞则需要提高消毒剂的浓度和延长消毒时间。灭菌（sterilization）杀死物体上包括细菌在内的所有病原性和非病原性微生物的方法，包括芽胞和霉菌孢子。防腐（antisepsis）阻止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。无菌（asepsis）指不含活的微生物状态，不含活菌的意思。无菌操作防止或杜绝任何微生物进入动物机体或其他物体的方法，称为无菌法，以无菌法进行的操作称为无菌操作。防止细菌进入动物体、人体或其它物品的操作技术称为无菌操作。抑菌（bacteriostasis）抑制体内或体外细菌生长繁殖的方法。第一节物理消毒灭菌法物理因素超声波滤过除菌微波干燥辐射度温对微生物影响较大的物理因素包括：温度、辐射、干燥、声波、微波和滤过等。温度最适温度：有利于微生物的生长发育。病原菌一般为37度（一）低温：多数微生物对低温有抵抗力，代谢活动降低至最低水平，生长繁殖停止，但仍可以长的保持活力，所以常在5-10℃下保存细菌，病毒则温度越低存活时
第三章 消毒、灭菌与兽医微生物实验室的生物安全 消毒灭菌的基本概念 微生物的特点，其生命活动极易受外界环境的影响，了解外界环境对微生物的 影响，可以控制外界因素，达到充分利用微生物有利的一面，消灭其有害的一面， 在理论上和实践上都具有重要意义。 消毒(disinfection) 杀死物体上的病原微生物，但不一定杀死全部微生物的方法。 只要求达到消除传染性的目的。 用于消毒的药品称为消毒剂(disinfectant)。一般 消毒剂在常用浓度下只对细菌的繁殖体有效，对细菌的芽胞则需要提高消毒剂的浓 度和延长消毒时间。 灭菌(sterilization) 杀死物体上包括细菌在内的所有病原性和非病原性微生物的 方法，包括芽胞和霉菌孢子。 防腐(antisepsis) 阻止或抑制细菌生长繁殖的方法，细菌一般不死亡。 无菌(asepsis) 指不含活的微生物状态，不含活菌的意思。 无菌操作 防止或杜绝任何微生物进入动物机体或其他物体的方法，称为无菌法， 以无菌法进行的操作称为无菌操作。防止细菌进入动物体、人体或其它物品的操作 技术称为无菌操作。 抑菌(bacteriostasis) 抑制体内或体外细菌生长繁殖的方法。 第一节 物理消毒灭菌法 对微生物影响较大的物理因素包括：温度、辐射、干燥、声波、微波和滤过等。 一、 温度 最适温度：有利于微生物的生长发育。病原菌一般为 37 度 （一）低温：多数微生物对低温有抵抗力，代谢活动降低至最低水平，生长繁殖停 止，但仍可以长的保持活力，所以常在 5-10℃下保存细菌，病毒则温度越低存活时 物理因素 滤过除菌 微 波 超声波 干 燥 辐射 温 度
间越长。但有些细菌对低温敏感，在冰箱保存比在室温保存死亡更快。意义：保存菌种、毒种、疫苗等冷冻法保存细菌注意事项：①迅速冷冻，迅速融化，水分呈玻璃样状态而不是冰晶状态。②加保护剂：10%的甘油、蔗糖、脱脂乳，或5%的二甲基亚（DMSO）③避免反复冷冻与融化，生物活性逐渐丧失。冷冻真空干燥法（冻干法）：是保存菌种、毒种、疫苗、补体、血清等的良好办法，可达到长期保存的目的。原理是迅速冷冻，抽真空除水。保存物加保护剂放置在玻璃容器内，迅速冷冻使溶液中和菌体内的水分不会形成冰晶，然后抽去容器内的空气，水分在真空下因升华而逐渐干燥。最后在真空状态下对玻璃容器严密封口。（二）高温：对微生物有明显的致死作用。常用于消毒和灭菌。热力灭菌法：分湿热灭菌和干热灭菌。同一温度下前者效力比后者大，原因：（1）蛋白质含水量越高，凝固所需要的时间越短。湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；(2）湿热的穿透力比干热大；(3）湿热的蒸汽有潜热存在。l.干热灭菌法（Dryheatsterilization）一般细菌繁殖体在干燥状态80一100℃经1小时可被杀死；芽胞需160℃经2小时才能杀灭。包括火焰和热空气灭菌两种。（1）火焰灭菌：用火焰直接杀死物体中全部微生物的方法。分灼烧和焚烧，灼烧：主要用于耐烧物品，直接在火焰上烧灼，如接种环（针）、试管口、金属器具。焚烧主要用于烧毁物品，直接点燃或在焚烧炉烧病畜禽的垫料，污染的废弃物和传染病的畜禽和实验感染的动物户体。（2）热空气（于烤）利用干热灭菌器，由于热空气的穿透力差，一般加热至160-170℃经2小时。主要用于高温下不损坏、不变质的物品。如玻璃、瓷器、金属器械等。2.湿热灭菌法（moistheatsterilization）（l）巴氏消毒法（pasteurization）用一定的温度杀灭液态食品中的病原菌或特定的微生物，而仍保持营养成分和风味的消毒方法。主要用于葡萄酒、啤酒、果酒及牛乳等食品的消毒。具体分三类：低温维持巴氏消毒法（lowtemperatureholding
间越长。但有些细菌对低温敏感，在冰箱保存比在室温保存死亡更快。 意义：保存菌种、毒种、疫苗等 冷冻法保存细菌注意事项：①迅速冷冻，迅速融化，水分呈玻璃样状态而不是 冰晶状态。②加保护剂：10%的甘油、蔗糖、脱脂乳，或 5%的二甲基亚砜（DMSO） ③避免反复冷冻与融化，生物活性逐渐丧失。 冷冻真空干燥法（冻干法）：是保存菌种、毒种、疫苗、补体、血清等的良好 办法，可达到长期保存的目的。 原理是迅速冷冻，抽真空除水。保存物加保护剂放置在玻璃容器内，迅速冷冻 使溶液中和菌体内的水分不会形成冰晶，然后抽去容器内的空气，水分在真空下因 升华而逐渐干燥。最后在真空状态下对玻璃容器严密封口。 （二）高温：对微生物有明显的致死作用。常用于消毒和灭菌。 热力灭菌法：分湿热灭菌和干热灭菌。 同一温度下前者效力比后者大，原因： ⑴ 蛋白质含水量越高，凝固所需要的时间越短。湿热中细菌菌体吸收水分，蛋 白质较易凝固； ⑵ 湿热的穿透力比干热大； ⑶ 湿热的蒸汽有潜热存在。 1．干热灭菌法（Dry heat sterilization ） 一般细菌繁殖体在干燥状态 80—100℃经 1 小时可被杀死；芽胞需 160℃经 2 小时才能杀灭。包括火焰和热空气灭菌两种。 （1） 火焰灭菌：用火焰直接杀死物体中全部微生物的方法。分灼烧和焚烧，灼 烧：主要用于耐烧物品，直接在火焰上烧灼，如接种环（针）、试管口、金属器 具。焚烧主要用于烧毁物品，直接点燃或在焚烧炉烧病畜禽的垫料，污染的废弃 物和传染病的畜禽和实验感染的动物尸体。 （2）热空气（干烤）利用干热灭菌器，由于热空气的穿透力差， 一般加热至 160-170℃经 2 小时 。主要用于高温下不损坏、不变质的物品。如玻璃、瓷器、 金属器械等。 2．湿热灭菌法(moist heat sterilization) （1）巴氏消毒法(pasteurization) 用一定的温度杀灭液态食品中的病原菌或 特定的微生物，而仍保持营养成分和风味的消毒方法。主要用于葡萄酒、啤酒、 果酒及牛乳等食品的消毒。 具 体 分 三 类 ： 低 温 维 持 巴 氏 消 毒 法 （ low temperature holding
pasteurization，LTH)：63一65℃30分钟，第二类：高温瞬时巴氏消毒法（hightemperature short time pasteurization,HTST)71-72℃15秒，第三类：超高温巴氏消毒法（ultrahightemperaturepasteurization，UHT）132℃1-2s，加热消毒后，迅速冷却10℃以下，称为冷击法，这样可进一步促使细菌死亡，也有利于鲜乳等食品马上转入冷藏保存。这种消毒方法的鲜乳在常温下，保存期可长达半年。（2）煮沸法1个大气压下，100℃，10-20min杀灭细菌繁殖体，1-2小时杀死细菌芽胞。若加入1%碳酸钠或2-5%的石炭酸，可提高沸点。加强杀菌力，加速芽胞死亡，灭菌效果更好。外科手术器械，注射器、针头以及食具等。（3）流通蒸汽灭菌法是一种常压蒸汽消毒法，细菌繁殖体15-30分钟可杀灭，但芽胞不全部被杀灭。在Arnold流动蒸汽灭菌器或蒸笼里。（4）间歇灭菌法（反复多次流通蒸汽）100℃维持30min温箱过夜100℃维持30min温箱过夜—100℃维持30min温箱过夜100℃维持30min。此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基的灭菌。（5）高压蒸汽灭菌（autoclaving）利用高压蒸汽灭菌器进行的灭菌，应用最广泛、最有效的方法在1.02kg/cm2（约0.107Mpa，旧称每平方英寸15磅）蒸汽压下，温度达121.3℃，维持15-30分钟。凡耐高温、不怕潮湿的物品。普通增养基、生理盐水、耐热药品、手术敷料等。注意：充分排除灭菌器内原有的冷空气，灭菌物品不要互相挤压过紧，确保蒸汽流畅，物品温度均匀上升。缓慢放气。辐射二、能量通过空间传递的一种物理现象。按辐射对微生物的灭活作用分：1.非电离辐射：可见光、日光、紫外线2.电离辐射：α、β、、x射线以及高能质子、中子等(一)非电离辐射1.可见光：指在红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，其波长400～800nm。可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁殖，故培养细菌和保存菌种，均应置于阴暗之处
pasteurization,LTH）：63—65℃ 30 分钟,第二类：高温瞬时巴氏消毒法（high temperature short time pasteurization,HTST） 71-72℃ 15 秒，第三 类：超高温巴氏消毒法（ultra high temperature pasteurization,UHT）132℃ 1-2s，加热消毒后，迅速冷却 10℃以下，称为冷击法，这样可进一步促使细菌 死亡，也有利于鲜乳等食品马上转入冷藏保存。这种消毒方法的鲜乳在常温下， 保存期可长达半年。 （2）煮沸法 1 个大气压下，100℃，10-20min 杀灭细菌繁殖体，1-2 小时杀死 细菌芽胞。若加入 1%碳酸钠或 2-5%的石炭酸，可提高沸点。加强杀菌力，加速 芽胞死亡，灭菌效果更好。外科手术器械，注射器、针头以及食具等。 （3）流通蒸汽灭菌法 是一种常压蒸汽消毒法，细菌繁殖体 15-30 分钟可杀灭， 但芽胞不全部被杀灭。在 Arnold 流动蒸汽灭菌器或蒸笼里。 （4）间歇灭菌法 （反复多次流通蒸汽） 100℃维持 30min 温箱过夜 100℃维持 30min 温箱过夜 100℃维持 30min 温箱过夜 100℃维持 30min。 此法常用于一些不耐高温的培养基，如鸡蛋培养基、血清培养基、糖培养基 的灭菌 。 （5）高压蒸汽灭菌(autoclaving) 利用高压蒸汽灭菌器进行的灭菌，应用最广 泛、最有效的方法在 1.02kg/cm2 （约 0.107Mpa，旧称每平方英寸 15 磅）蒸汽 压下，温度达 121.3℃，维持 15-30 分钟。凡耐高温、不怕潮湿的物品。普通培 养基、生理盐水、耐热药品、手术敷料等。 注意：充分排除灭菌器内原有的冷空气，灭菌物品不要互相挤压过紧，确保 蒸汽流畅，物品温度均匀上升。缓慢放气。 二、 辐射 能量通过空间传递的一种物理现象。 按辐射对微生物的灭活作用分：1.非电离辐射:可见光、日光、紫外线 2.电离辐射 : α、β、γ、χ射线以及高能质子、中子等 (一)非电离辐射 1.可见光:指在红外线和紫外线之间的肉眼可见的光线，其波长 400～800nm。 可见光线对微生物一般无多大影响，但长时间作用也能妨碍微生物的新陈代谢与繁 殖，故培养细菌和保存菌种，均应置于阴暗之处
光感作用：指可见光具有微弱的杀菌作用，着将某些染料如结晶紫、美蓝、永漠红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用。2.阳光：直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多，往往需经20h才死亡。日光的杀菌效力因地、因时及微生物所处环境不同而异。3.紫外线：波长200-300nm部分有杀菌作用。实验室常使用的紫外线杀菌灯紫外线波长为253.7nm。常用于微生物实验室、无菌室、手术室等的空气消毒，或用于不能用高温或化学药品消毒的物品的表面消毒。还可用于诱变育种。杀菌机理：（1）损害DNA构型，影响DNA复制和转录(2)（02030杀菌(二)电离辐射（1）α射线：电离辐射强，穿透力差（缺乏穿透力，不实用）（2）β射线：电离辐射强，穿透力强（3）射线：电离辐射弱，穿透力强（4）×射线：杀菌力不如紫外线，穿透力强用途：总热物品的灭菌消毒、食品保藏和育种等方面杀菌机制：射线使水电离为H十和OH一，这些游离基是强烈的还原剂和氧化剂，可直接作用于细菌本身。三、干燥微生物在干燥的环境中失去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体蛋白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。不同种类的微生物对干燥的抵抗力差异很大。主要用于菌种和食品的保藏。四、超声波频率在20000～200000Hz的声波称为超声波。主要用于裂解细胞，提取细胞组分。通过瞬时发生的空腔化作用，在液体中造成压力改变，应力薄弱区形成许多小空腔，逐渐增大，最后崩破。崩破时的压力达1000个大气压微波从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。所需时间短、加热均匀。主要用于陶瓷、耐热玻璃容器和塑料器血，金属器血总用。六、滤过滤过除菌法：用机械阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，达到无菌的目的。但滤过除菌常不能除去病毒、霉形体以及细菌L型等小颗粒。主要用于不耐高温的
光感作用：指可见光具有微弱的杀菌作用，若将某些染料如结晶紫、美蓝、汞溴 红、伊红、沙黄等加到培养基或涂在外伤表面，能增强可见光的杀菌作用。 2.阳光：直射日光有强烈的杀菌作用，是天然的杀菌因素。许多微生物在直射日 光的照射下，半小时到数小时即可死亡。芽胞对日光照射的抵抗力比繁殖体大得多， 往往需经 20h 才死亡。日光的杀菌效力因地、因时及微生物所处环境不同而异 。 3.紫外线：波长 200-300nm 部分有杀菌作用。实验室常使用的紫外线杀菌灯紫外 线波长为 253.7nm。常用于微生物实验室、无菌室、手术室等的空气消毒，或用于 不能用高温或化学药品消毒的物品的表面消毒。还可用于诱变育种。 杀菌机理：（1）损害 DNA 构型，影响 DNA 复制和转录 （2） O2 O3 O 杀菌 (二)电离辐射 （1）α 射线:电离辐射强 ， 穿透力差（ 缺乏穿透力，不实用） （2）β 射线:电离辐射强 ， 穿透力强 （3）γ射线:电离辐射弱， 穿透力强 （4）χ射线：杀菌力不如紫外线，穿透力强 用途：忌热物品的灭菌消毒、食品保藏和育种等方面 杀菌机制：射线使水电离为 H＋和 OH－，这些游离基是强烈的还原剂和氧 化剂，可直接作用于细菌本身 。 三、 干燥 微生物在干燥的环境中失去大量水分，新陈代谢便会发生障碍，甚至引起菌体 蛋白质变性和由于盐类浓度的增高而逐渐导致死亡。不同种类的微生物对干燥的抵 抗力差异很大。主要用于菌种和食品的保藏。 四、 超声波 频率在 20 000～200 000 Hz 的声波称为超声波 。主要用于裂解细胞，提取细胞 组分。通过瞬时发生的空腔化作用，在液体中造成压力改变，应力薄弱区形成许多 小空腔，逐渐增大，最后崩破。崩破时的压力达 1000 个大气压微波 从几百兆赫至几十万兆赫频率的无线电波称为微波。所需时间短、加热均匀。主 要用于陶瓷、耐热玻璃容器和塑料器皿，金属器皿忌用。 六、 滤过 滤过除菌法：用机械阻留的方法将液体或空气中的细菌除去，达到无菌的目的。 但滤过除菌常不能除去病毒、霉形体以及细菌 L 型等小颗粒。主要用于不耐高温的
营养液、血清、抗菌素、空气等除菌。滤器（filter）：滤膜、素陶瓷、石棉（蔡氏）、烧结玻璃。GMP车间：优良药品的制作，生产质量管理规范。洁净厂房空气洁净度：尘粒数和微生物数要符合规定。分为4个等级。第二节化学因素对微生物的影响1.消毒剂：用于杀灭病原微生物的化学药物。2.防腐剂：用于抑制微生物生长繁殖的化学药物。消毒剂在低浓度时只能抑菌，而防腐剂在高浓度时也能杀菌，统称为防腐消毒剂，如酚类、重金属盐类、氧化剂等。3.化学治疗剂：用于消除宿主体内病原微生物或其它寄生虫的化学药物，如磺胺类药物。第三节生物因素对微生物的影响一.抗生素、植物杀菌素和细菌素（一）抗生素：某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物的物质。作用原理：（1）干扰细菌细胞壁的合成，如青霉素：（2）损伤胞浆膜而影响其通透性，如多粘菌素；（3）影响菌体蛋白质的合成，如红霉素等；（4）影响核酸的合成，如新生霉素。（二）植物杀菌素：某些植物中存在的杀菌物质。如黄连、大蒜、板蓝根等。（三）细菌素：某种细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于与它同种不同菌株的细菌以及与它亲缘关系相近的细菌，如大肠菌素。二噬菌体（一）概念：寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等体美部内的一类病毒。（二）特点尾龄、1.个体微小尾领尾鞘2.无细胞结构3.专性细胞内寄生物4.分布广尾刺5.严格的宿主特异性蝌蚪形噬菌体的结构（三）形态和结构尼板（四）抵抗力
营养液、血清、抗菌素、空气等除菌。 滤器(filter)：滤膜、素陶瓷、石棉（蔡氏）、烧结玻璃。 GMP 车间：优良药品的制作，生产质量管理规范。 洁净厂房空气洁净度：尘粒数和微生物数要符合规定。分为 4 个等级。 第二节 化学因素对微生物的影响 1.消毒剂 :用于杀灭病原微生物的化学药物。 2.防腐剂 :用于抑制微生物生长繁殖的化学药物。 消毒剂在低浓度时只能抑菌,而防腐剂在高浓度时也能 杀菌，统称为防 腐消毒剂，如酚类、重金属盐类、氧化剂等。 3.化学治疗剂 :用于消除宿主体内病原微生物或其它寄生虫的化学药物，如磺 胺类药物。 第三节 生物因素对微生物的影响 一.抗生素、植物杀菌素和细菌素 （一）抗生素：某些微生物在代谢过程中产生的一类能抑制或杀死另一些微生物 的物质 。 作用原理 ：（1）干扰细菌细胞壁的合成，如青霉素； （2）损伤胞浆膜而影响其通透性，如多粘菌素； （3）影响菌体蛋白质的合成，如红霉素等； （4）影响核酸的合成，如新生霉素 。 （二）植物杀菌素 ：某些植物中存在的杀菌物质。如黄连、大蒜、板蓝根等。 （三）细菌素 ：某种细菌产生的一种具有杀菌作用的蛋白质，只能作用于与它 同种不同菌株的细菌以及与它亲缘关系相近的细菌，如大肠菌素 。 二.噬菌体（一）概念：寄生于细菌、霉形体、螺旋体、放线菌以及蓝细菌等体 内的一类病毒 。（二）特点 1.个体微小 2.无细胞结构 3.专性细胞内寄生物 4.分布广 5.严格的宿主特异性 （三）形态和结构 蝌蚪形噬菌体的结构 （四）抵抗力
噬菌体对理化因素的抵抗力较强，一般经70℃30min仍不失活，利用56℃～60℃加热30min的方法，可从含菌材料中分离噬菌体。噬菌体能耐受低温和冰冻，但对紫外线和×射线敏感，一般经紫外线照射10～15min即失活。（五）与寄主细菌的关系溶菌反应和溶原化两种类型1，毒性赚菌体：能使寄主细胞迅速裂解引起溶菌反应的菌体。2.温和噬菌体：有些噬菌体侵入寄主细胞后，将其基因整合于细菌的基因组中，与细菌DNA一道复制，并随细菌的分裂而传给后代，不形成病毒粒子，不裂解细菌。带有温和性噬菌体基因组的细菌即溶源性细菌。（六）检查方法利用溶菌现象（只能在敏感宿主菌体增殖）空斑形成单位（plaqueformingunits，PFU）数：将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬菌斑计数，可测得每毫升容积内的空斑形成单位数。ePHAGEDILUTIONSERIESBACTERIALLAWNPT.AOIIFPHAGEFHAGEPHAOCEPALOOET0.1MILOFXDILITIONSPREADONPLATE（七）应用1.细菌的鉴定与分型2.检测标本中未知细菌3.分子生物学研究的工具（1）结构简单，易操作作为研究病毒增殖的模式：(2)基因数较少，研究核酸复制、转录、重组以及基因表达的调节、控制；(3)基因的载体，应用于遗传工程。第四节兽医微生物实验室的生物安全重点是实验室生物安全的概念、分级标准、病原分类即可。了解为主。幻灯为主
噬菌体对理化因素的抵抗力较强，一般经 70℃ 30min 仍不失活，利用 56℃～60℃加热 30min 的方法，可从含菌材料中分离噬菌体。噬菌体能耐受低 温和冰冻，但对紫外线和 X 射线敏感，一般经紫外线照射 10～15 min 即失活。 （五）与寄主细菌的关系 溶菌反应和溶原化两种类型 1.毒性噬菌体 :能使寄主细胞迅速裂解引起溶菌反应的噬菌体。 2.温和噬菌体 :有些噬菌体侵入寄主细胞后，将其基因整合于细菌的基因组 中，与细菌 DNA 一道复制，并随细菌的分裂而传给后代，不形成病毒粒子，不 裂解细菌。带有温和性噬菌体基因组的细菌即溶源性细菌。 （六）检查方法利用溶菌现象（只能在敏感宿主菌体增殖）空斑形成单位（plaque forming units，PFU）数： 将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬菌斑计数，可测 得每毫升容积内的空斑形成单位数。 （七）应用 1.细菌的鉴定与分型 2.检测标本中未知细菌 3.分子生物学研究的工具 (1)结构简单，易操作作为研究病毒增殖的模式； (2)基因数较少，研究核酸复制、转录、重组以及基因表达的调节、控制； (3)基因的载体，应用于遗传工程。 第四节 兽医微生物实验室的生物安全 重点是实验室生物安全的概念、分级标准、病原分类即可。了解为主。 幻灯为主