实验一醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸 一.目的 学习核糖核酸碱水解的原理和方法，掌握核糖核苷酸的醋酸纤维薄膜电泳的原理和方 法。 二原理 RNA在稀碱条件下水解，先形成中间物2'，3-环状核苷酸，进一步水解得到2'和3 ·核苷酸的混合物。 在PH3.5时，各核苷酸的第一磷酸基(PK0.7一1.0)完全解离，第二磷酸基(PK6.0) 和稀醇基(PK9.5以上)不解离，而含氨环的解离程度差别很大。（见附表）因此在PH3.5 条件下进行电泳可将这四种核苷酸分开 四种核苷酸在PHB.5时的离子化程 核苷酸 含氮环的PK值 离子化程度 净负电荷 AMP 3.70 0.54 0.46 GMP 230 005 095 CMP 4.24 0.84 0.16 UMP 1.00 本实验先用稀氢氧化钾溶液将RNA水解，再加高氯酸将水解液调至PHB.5,同时生成 高氯酸钾沉淀以除去K,然后用电泳法分离水解液中各核苷酸，并在紫外分析灯下确定RNA 碱水解液的电泳图谱。 三仪器、试剂、材料 1仪器 电热恒温水浴锅：紫外分析灯（波长为254m)点样器：离心机：电泳仪和电泳槽 2.试剂 100ml0.3molL氢氧化钾溶液：40ml200gL高氯酸溶液：4g核糖核酸（粉末）：1000m 0.02 mol/L.PH3.5柠檬酸缓冲液： 3.材料 醋酸纤维薄膜(2×8cm) 四操作方法 .RNA的碱水解 称取0.2gRNA,溶于5ml0.3molL氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20 30mgml。在37度下保温18小时（或沸水浴30分钟）。然后将水解液转移到锥形瓶内， 在水浴中用高氯酸溶液滴定到水解液的PH为3.5.2000转/分离心10分钟，除去沉淀 上清液即为样品液。 点样 将醋酸纤维薄膜在PH3.50.02molL柠檬酸缓冲液中浸湿后，用滤纸吸去多余的缓冲 液。然后将膜条无光泽面向上平铺在玻璃板上，用电样器在距膜条一端2一3cm处点样。 3.电泳 珍好样的满限小心益放入电法结内.注意点样的一应客近负极。调节电 度为 0.4 mA/cm,.电泳25分钟
实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离核苷酸 一.目的 学习核糖核酸碱水解的原理和方法，掌握核糖核苷酸的醋酸纤维薄膜电泳的原理和方 法。 二.原理 RNA 在稀碱条件下水解，先形成中间物 2＇，3＇-环状核苷酸，进一步水解得到 2＇和 3＇ -核苷酸的混合物。 在 PH3.5 时，各核苷酸的第一磷酸基（PK0.7－1.0）完全解离，第二磷酸基（PK6.0） 和稀醇基（PK9.5 以上）不解离，而含氮环的解离程度差别很大。（见附表）因此在 PH3.5 条件下进行电泳可将这四种核苷酸分开。 四种核苷酸在 PH3.5 时的离子化程度： 核苷酸 含氮环的 PK 值 离子化程度 净负电荷 AMP 3.70 0.54 0.46 GMP 2.30 0.05 0.95 CMP 4.24 0.84 0.16 UMP － 1.00 本实验先用稀氢氧化钾溶液将 RNA 水解，再加高氯酸将水解液调至 PH3.5，同时生成 高氯酸钾沉淀以除去 K+ ,然后用电泳法分离水解液中各核苷酸，并在紫外分析灯下确定 RNA 碱水解液的电泳图谱。 三.仪器、试剂、材料 1. 仪器 电热恒温水浴锅；紫外分析灯（波长为 254nm）点样器；离心机；电泳仪和电泳槽 2. 试剂 100ml 0.3mol/L 氢氧化钾溶液；40ml 200g/L 高氯酸溶液；4g 核糖核酸（粉末）；1000ml 0.02mol/L PH3.5 柠檬酸缓冲液； 3. 材料 醋酸纤维薄膜（2×8cm） 四.操作方法 1. RNA 的碱水解： 称取 0.2g RNA，溶于 5ml 0.3mol/L 氢氧化钾溶液中，使 RNA 的浓度达到 20－ 30mg/ml。在 37 度下保温 18 小时（或沸水浴 30 分钟）。然后将水解液转移到锥形瓶内， 在水浴中用高氯酸溶液滴定到水解液的 PH 为 3.5。2000 转/分离心 10 分钟，除去沉淀， 上清液即为样品液。 2. 点样 将醋酸纤维薄膜在 PH3.5 0.02mol/L 柠檬酸缓冲液中浸湿后，用滤纸吸去多余的缓冲 液。然后将膜条无光泽面向上平铺在玻璃板上，用电样器在距膜条一端 2－3cm 处点样。 3. 电泳 将点好样的薄膜小心地放入电泳槽内，注意点样的一端应靠近负极。调节电压至 160V，电流强度为 0.4mA/cm,电泳 25 分钟
五结果处理 电泳后，将膜条放在滤纸上，紫外分析灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出 在记录本上绘出RNA水解液的醋酸纤维薄膜电泳图谱，并根据附表中的数据分析确定 各斑点代表哪种核苷酸。 六.注意事项 1.点样时，在膜条无光泽面点样，且点样量要适中。 2.电泳时，膜条的点样端要靠近负极。 七思考题 1.为什么点样要点在膜条无光泽的 为什么在PH3.5时进行电泳分离核苷酸的效果最好？醋酸纤维薄膜电泳分离核苦酸 参考文献 刘卫群，陈建新，吴鸣建主编.基础生物化学，北京：气象出版社，2000
五.结果处理 电泳后，将膜条放在滤纸上，紫外分析灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。 在记录本上绘出 RNA 水解液的醋酸纤维薄膜电泳图谱，并根据附表中的数据分析确定 各斑点代表哪种核苷酸。 六.注意事项 1. 点样时，在膜条无光泽面点样，且点样量要适中。 2. 电泳时，膜条的点样端要靠近负极。 七.思考题 1. 为什么点样要点在膜条无光泽的一端？ 2. 为什么在PH3.5时进行电泳分离核苷酸的效果最好？醋酸纤维薄膜电泳分离核苦酸 参考文献 刘卫群，陈建新，吴鸣建主编．基础生物化学．北京：气象出版社，2000