实验五利用间接免疫荧光观察 水稻小孢子母细胞微管 目的 1. 掌握间接荧光免疫的制片技术， 2.掌握PEG制片技术. 3.了解激光共聚焦扫描显微术
实验五 利用间接免疫荧光观察 水稻小孢子母细胞微管 一．目的 1. 掌握间接荧光免疫的制片技术. 2. 掌握PEG制片技术. 3. 了解激光共聚焦扫描显微术
二.材料和仪器设备 1.材料：水稻减数分裂时期的花药 2.主要仪器设备：激光共聚焦扫描显微 镜，石蜡切片机和恒温箱等
二．材料和仪器设备 1. 材料 ：水稻减数分裂时期的花药 2. 主要仪器设备：激光共聚焦扫描显微 镜，石蜡切片机和恒温箱等
三.实验步骤 1.材料固定 取减数分裂前期的花药，投入含有4%的聚 甲醛（含10%DMS0,1%MSB,1%Triton X- 100,PEMS缓冲液配置)固定剂固定1-2h, PEMS冲洗液(PEMS+10%DMSO+1% Ttriton X-100)洗三次，每次5-10分钟。PEM 洗三次，每次5-10分钟。蒸馏水洗3次
三．实验步骤 1. 材料固定 取减数分裂前期的花药，投入含有4%的聚 甲醛（含10%DMSO,1%MSB,1%Triton X- 100, PEMS缓冲液配置）固定剂固定1-2h， PEMS 冲洗液 ( PEMS +10% DMSO+1% Ttriton X-100)洗三次，每次5-10分钟。PEM 洗三次，每次5-10分钟。蒸馏水洗3次
三.实验步骤 2.脱水 乙醇系列脱水，乙醇梯度分别为10%， 20%,30%,40%,50%,60%,70%, 80%,90%:100%,每次30分钟。无水乙 醇换三次。第二次无水乙醇连同材料一起放入 55度恒温箱，15分钟后用预先加热到55度无水 乙醇替换，继续保温(55度)15分钟
三．实验步骤 2.脱水 乙醇系列脱水，乙醇梯度分别为10%， 20%，30%，40%，50%，60%，70%， 80%，90%，100%，每次30分钟。无水乙 醇换三次。第二次无水乙醇连同材料一起放入 55度恒温箱，15分钟后用预先加热到55度无水 乙醇替换，继续保温（55度）15分钟
三.实验步骤 3.渗透 转入渗透剂I,保温30分钟 转入渗透剂II,保温40分钟 转入渗透剂III,保温40分钟 转入纯PEG混合液，保温1h 换一次纯PEG混合液，保温1h
三．实验步骤 3. 渗透 转入渗透剂 I，保温30分钟 转入渗透剂 II，保温40分钟 转入渗透剂 III，保温40分钟 转入纯PEG混合液，保温1h 换一次纯PEG混合液，保温1h
三.实验步骤 4.包埋切片 先将纯PEG混合液加入包埋管中，加入包埋材料， 静置1h后。在室温下聚合。聚合后，取出包埋头用石 蜡切片机切30-50微米厚片，收集切片
三．实验步骤 4. 包埋切片 先将纯PEG混合液加入包埋管中，加入包埋材料， 静置1h后。在室温下聚合。聚合后，取出包埋头用石 蜡切片机切30-50微米厚片，收集切片
三.实验步骤 5.标记预处理 用蒸馏水小心洗3-5次，PBS洗三次 (可暂时保存于4度冰箱中)，0.1mol/儿 NH4CI处理3分钟，PBS洗三次，每次5分 钟，0.1%Tween20处理20分钟， 1%BSA(现配现用)处理10分钟
三．实验步骤 5. 标记预处理 用蒸馏水小心洗3-5次，PBS洗三次 （可暂时保存于4度冰箱中），0.1mol/L NH4Cl处理3分钟，PBS洗三次，每次5分 钟，0.1%Tween 20处理20分钟， 1%BSA（现配现用）处理10分钟
三.实验步骤 6.抗体标记 加入微管抗体1(T-9026,anti-a- tubulin,sigma,PBS稀释100倍)，37度温育 1h,PBS冲洗三次，每次5-10分钟
三．实验步骤 6. 抗体标记 加入微管抗体1（T-9026,anti-α- tubulin,sigma,PBS稀释100倍）， 37度温育 1h，PBS冲洗三次，每次5-10分钟
三.实验步骤 加入抗体2(F-0257,anti-mouse IgG FITC conjugated,signa,PBS稀释200倍) 37度温育1h,PBS冲洗三次，每次5-10分 钟
三．实验步骤 加入抗体2（F-0257, anti-mouse IgG FITC conjugated,signa,PBS稀释200倍） 37度温育1h,PBS冲洗三次，每次5-10分 钟
三.实验步骤 7.复染 PI(Propidium Iodide)染色l分钟，PBS 冲洗三次
三．实验步骤 7. 复染 PI(Propidium Iodide)染色1分钟，PBS 冲洗三次