药用植物、低氧作用对细胞色素P450 的影响 亚鹏
药用植物、低氧作用对细胞色素P450 的影响 高亚鹏
主要内容 一CYP450(P450)简介 二药用植物及低氧条件对cYP450的影响 冷1、甘草、芫花对P450的影响 2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞P450蛋白表达的 影响 令3、慢性间断性低氧对大鼠肝细胞P450的影响
主要内容 ❖ 一 CYP450（P450）简介 ❖ 二 药用植物及低氧条件对CYP450的影响 ❖ 1、甘草、芫花对P450的影响 ❖ 2、银杏叶提取物对大鼠肝细胞P450蛋白表达的 影响 ❖ 3、慢性间断性低氧对大鼠肝细胞P450的影响
cYP450简介 细胞色素P450(cYP450或P450):是广泛存在于生物体内的一类含血红 素和硫羟基的蛋白,由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族 酶系,在450nm处有最大吸收峰,因其还原态与co结合后在450nm 有特异性吸收峰而得名,相对分子质量50kDa。本质为末端氧化酶。 分布及存在状态 原核生物:cYP450游离于胞质中,为一种可溶性蛋白; 真核生物:cYP450作为一种膜结合蛋白,主要分布在内质网和线粒体内 膜上。 生理功能:CYP450主要参与內源性物质(胆酸、维生素D、脂肪酸和激素 等)和外源性物质(药物、毒物、杀虫剂等)的生物转化
一 CYP450简介 细胞色素P450 (CYP450或P450)：是广泛存在于生物体内的一类含血红 素和硫羟基的蛋白，由结构和功能相关的基因超家族编码形成的超家族 酶系，在450 nm处有最大吸收峰，因其还原态与CO结合后在450nm 有特异性吸收峰而得名，相对分子质量 50 kDa。本质为末端氧化酶。 分布及存在状态： 原核生物：CYP450游离于胞质中，为一种可溶性蛋白; 真核生物：CYP450作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网和线粒体内 膜上。 生理功能：CYP450主要参与内源性物质(胆酸、维生素D、脂肪酸和激素 等)和外源性物质(药物、毒物、杀虫剂等)的生物转化
P450活性中心:由含铁血红素和半胱氨酸组成。 Camphor e p450活性中心
P450活性中心：由含铁血红素和半胱氨酸组成。 p450活性中心
P450的命名: 1993年 Nelso等科学家制定了根据氨基酸序列,能反映种族间P450酶 基因超家族内进化关系的统一命名法 凡氨基酸同源性大于40%的视为同一家族( (family),用CYP后标一阿拉 伯数字表示,如cYP2;氨基酸同源性大于55%以上者为同一亚族 ( subfamily),在家族的后面加一个大写字母表示,如CYP2D每一个亚 族中的单个形式的P450酶( (individua),则是在表达式后再加一个阿拉 伯数字,如cYP2D6。目前己知哺乳动物体内有14个CYP家族(包含26 个亚族),涉及体内大多数药物代谢的主要有3个基因家族(CYP1,CYP2 和cYP3) 在哺乳动物肝脏中,参与药物代谢的P450酶系主要是CYP1-CYP3家族 的7种酶,分别为: CYP1A、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和 cYP3A4
P450的命名: 1993年Nelso等科学家制定了根据氨基酸序列，能反映种族间P450酶 基因超家族内进化关系的统一命名法: 凡氨基酸同源性大于40%的视为同一家族(family)，用CYP后标一阿拉 伯数字表示，如CYP2;氨基酸同源性大于55%以上者为同一亚族 (subfamily)，在家族的后面加一个大写字母表示，如CYP2D,每一个亚 族中的单个形式的P450酶(individual)，则是在表达式后再加一个阿拉 伯数字，如CYP2D6。目前己知哺乳动物体内有14个CYP家族(包含26 个亚族)，涉及体内大多数药物代谢的主要有3个基因家族(CYP1, CYP2 和CYP3) ❖ 在哺乳动物肝脏中，参与药物代谢的P450酶系主要是CYP1-CYP3家族 的7种酶，分别为： CYP1A、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和 CYP3A4
P450的催化反应机制: HO CO,(CH,) H=CH CO,(CH,) CH=CH 2e,2H+ rH+o ROH+h,o AlkOH 1驰豫态 P450 AnkH x·ROH AnkH + ArcOaH e HO Cpdb P450 AnkH Fen 2e CpdO Electrode Alkh 0 SIkH Lewis碱 未端加氧功能使其在碳同化、激素合成、 外源物质降解、前致癌物的活化等 方面起着重要作用。 p450催化反应机制
P450的催化反应机制： p450催化反应机制 Lewis碱 末端加氧功能使其在碳同化、激素合成、 外源物质降解、前致癌物的活化等 方面起着重要作用。 1 驰豫态 CpdI CpdO
P450是自然界中最具催" (m) Dohydrogonebion 化作用多样性的生物催 (b)Alkene epoxidation / Alkyne oxygenation 化剂。它有很广的底物 (c) Arene epoxidation, aromatic hydroxylation, NIH shift 谱,包括外源物如药物, R-c=N·HO (d)N-Doalkylation 工业化合物、抗体等;二 N-CH2OH R-NH2+ HCHO (o Reductive dehalogenation RsM一Rs-cH2→RBH+HCH 醇、荷尔蒙以及其他生“>m (p) N-Oxido roduction go#20(+2. (h)N-Oxidation 理过程产生的脂类等。→y P450参与的反应可以归 R-S-Me X-C-OOH *2 0)OxidatIve deamination (O)NO roduction 纳为包括羟基化,环氧 M+220+0 化,脱烷基化等在内的 Prost end Ha (PGH2) Thromboxane A (xA2) HX (u)Oxidative C-C bond cleavage 数十种类型 ( Alcohol and ±+2H p450催化的各种类型的化学反应
❖ P450是自然界中最具催 化作用多样性的生物催 化剂。它有很广的底物 谱，包括外源物如药物、 工业化合物、抗体等； 也包括多种内源物如甾 醇、荷尔蒙以及其他生 理过程产生的脂类等。 ❖ P450参与的反应可以归 纳为包括羟基化，环氧 化，脱烷基化等在内的 数十种类型. p450催化的各种类型的化学反应
二药用植物及低氧条件对cYP450的影响 1、甘草、芫花提取液对P450的影响 令目的:研究甘草、芫花对主要药物代谢酶cYP1A2、 cYP2EL、CYP3A1/2酶活性的影响,为阐明基于药物代谢 酶的中药相反作用的机制提供参考 方法:制取甘草、芫花提取液;将大鼠随机分为空白组、甘 草组(0.75g/kg/d)、芜花组(0.25g/kg/d)、甘草芫花合 用组(1.00g/kg/d),每组6只。空白组给予生理盐水各药 物组连续灌胃给药7d后处死动物 取肝脏采用超速离心法制备微粒体高效液相色谱法测定微粒 体中CYP1A2、CYP2E1活性采用紫外可见分光光度法测定 cYP3A1/2活性
二 药用植物及低氧条件对CYP450的影响 1、甘草、芫花提取液对P450的影响 ❖ 目的：研究甘草、芫花对主要药物代谢酶CYP1A2、 CYP2E1、CYP3A1/2 酶活性的影响，为阐明基于药物代谢 酶的中药相反作用的机制提供参考。 ❖ 方法：制取甘草、芫花提取液；将大鼠随机分为空白组、甘 草组(0.75g/kg/d) 、芫花组(0.25 g/kg/d ) 、甘草芫花合 用组(1.00g/kg/d ) ,每组6 只。空白组给予生理盐水,各药 物组连续灌胃给药7 d 后处死动物. 取肝脏,采用超速离心法制备微粒体,高效液相色谱法测定微粒 体中CYP1A2、CYP2E1 活性;采用紫外可见分光光度法测定 CYP3A1/2 活性
植物提取液制备 甘草提取液制备流程: 甘草(称重) 加去离子水—浸泡60min 浓缩为0069/m/旋转蒸发 过滤 加热回流3次 芫花提取液制备同上最终药液浓度定为0.02g/mL 合用组提取液按中国药典I部规定的临床剂量比例 称重,制备同上,最终药液浓度定为0.08g/mL
植物提取液制备: ❖ 甘草提取液制备流程： 芫花提取液制备同上,最终药液浓度定为0.02g/mL； 合用组提取液按中国药典Ⅰ部规定的临床剂量比例 称重，制备同上，最终药液浓度定为0.08 g/mL。 浓缩为0.06g/ml 甘草（称重） 加热回流3次 加去离子水 浸泡60 min 过滤 旋转蒸发
超速离心法制备肝微粒体流程 称重,剪碎加匀浆介质, Potter匀浆器 肝脏 肝匀浆 离心,10000g20min 上清液 沉淀 离心,10500g1h 沉淀(微粒体) 上清液弃去 储存于液氮中
超速离心法制备肝微粒体流程 肝匀浆 上清液 沉淀 （微粒体） 上清液弃去 沉淀 离心，10500g 1h 离心，10000g 20 min 肝脏 称重，剪碎加匀浆介质，Potter匀浆器 储存于液氮中