第二章实验室设计及仪器设备 教学目标： 1.掌握组织培养实验室的设计和组成及各组成部分的作用 2.掌握组织培养常用的实验仪器和设备及其使用方法 3.掌握植物组织培养过程中的所需环境条件及调控方法 引言：植物组织培养是在无菌条件下进行离体植物材料培养的技术.要达到无菌操作和无菌培养， 必须有最基本的实验设备条件，并熟练掌握一些与无菌操作有关的操作技术.组织培养工作之前，首 先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新 建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太 小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养工艺流程来设计，这样可 做到工作方便，减少污染，节省能源，使用安全，避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格的无菌条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要 人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 教学内容 第一节实验室设计和设备 一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、化学实验室、无菌室、培养室、消毒室、观察 室、贮存室等。在实际生产中可结合实际条件，合并一部分。 一、洗涤室 洗涤室完成玻璃器皿和其它仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，用于培养器皿的 洗涤，最好是内衬白瓷砖的水泥槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺橡胶板，上下水道要畅通。备有大 型塑料筐，用于放置培养器皿。可直接置于搁架上，以节约空间和便于运输工作。备有空干架，以 空干涮净的培养器皿。 二、化学实验室 要求：明亮、通风。墙壁地面要耐湿，室内应备有各种毛刷，配备大型水槽，有冷热水源和上 下水，面积应在30m以上。 用途：在化学实验室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多， 可将化学实验室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作： 配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 为完成培养基的制备工作，化学实验室还应配备以下仪器设备： 1.大型工作台其高度应方便配制工作。 2.药品柜用以放置常用药品。 3.普通冰箱或冰柜主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。 4.电子天平和托盘天平电子分析天平精确度为0.0001g,用于称取大量元素、微量元素、维生 素、激素等微量药品：托盘天平精确度为0.1g,用于称取用量较大的糖和琼脂等。天平应放置在干 燥、不受振动的固定操作台上。 5.电蒸馏水器采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配培养基可用自来 水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。 6.磁力搅拌器磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌 器还可加热，使之更利于溶解。 7.恒温水浴锅水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。若没有水浴锅，也可用1500或 2000W电炉或电饭锅代替。电炉应配有不锈钢锅。 8.酸度计组织培养中培养基H值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计，若无酸度计，也 可使用精密pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量H时，待 测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整p计上的温度扭使之和培养基温度相 当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。 9.培养基分装设备小型组织培养实验室可采用烧杯、漏斗等作为分装培养基的工具。也可采 用医用”下口杯"作为分装工具，在”下口杯"的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非 常合用。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。 10.高压灭菌锅用以进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌 锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。 11.烘箱用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80~ 100℃；进行干热灭菌需保持150℃，达1-3h;若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干
第二章 实验室设计及仪器设备 教学目标： 1．掌握组织培养实验室的设计和组成及各组成部分的作用 2．掌握组织培养常用的实验仪器和设备及其使用方法 3．掌握植物组织培养过程中的所需环境条件及调控方法 引言:植物组织培养是在无菌条件下进行离体植物材料培养的技术.要达到无菌操作和无菌培养, 必须有最基本的实验设备条件,并熟练掌握一些与无菌操作有关的操作技术.组织培养工作之前，首 先应对工作中需要哪些最基本的设备条件有个全面的了解，以便因地制宜地利用现有房屋，或新 建、改建实验室。实验室的大小取决于工作的目的和规模。以工厂化生产为目的，实验室规模太 小，则会限制生产，影响效率。在设计组织培养实验室时，应按组织培养工艺流程来设计，这样可 做到工作方便,减少污染,节省能源,使用安全,避免某些环节倒排，引起日后工作混乱。植物组织培 养是在严格的无菌条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要 人工控制温度、光照、湿度等培养条件。 教学内容 第一节 实验室设计和设备 一个标准的组织培养实验室应当包括洗涤室、化学实验室、无菌室、培养室、消毒室、观察 室、贮存室等。在实际生产中可结合实际条件，合并一部分。 一、洗涤室 洗涤室完成玻璃器皿和其它仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽，用于培养器皿的 洗涤，最好是内衬白瓷砖的水泥槽。为防止碰坏玻璃器皿，可铺橡胶板，上下水道要畅通。备有大 型塑料筐，用于放置培养器皿。可直接置于搁架上，以节约空间和便于运输工作。备有空干架，以 空干涮净的培养器皿。 二、化学实验室 要求:明亮、通风。墙壁地面要耐湿,室内应备有各种毛刷, 配备大型水槽，有冷热水源和上 下水,面积应在30㎡以上。 用途:在化学实验室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清洗与整理工作。如果房间较多， 可将化学实验室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室专门负责试管苗出瓶与培养器皿的清洗工作； 配置室则负责培养基的配制、分装、包扎和高压灭菌等工作。 为完成培养基的制备工作，化学实验室还应配备以下仪器设备： 1．大型工作台 其高度应方便配制工作。 2．药品柜 用以放置常用药品。 3．普通冰箱或冰柜 主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料等。 4．电子天平和托盘天平 电子分析天平精确度为0.0001g，用于称取大量元素、微量元素、维生 素、激素等微量药品；托盘天平精确度为0.1g，用于称取用量较大的糖和琼脂等。天平应放置在干 燥、不受振动的固定操作台上。 5．电蒸馏水器 采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或培养基，配培养基可用自来 水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。 6．磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉等。磁力搅拌 器还可加热，使之更利于溶解。 7．恒温水浴锅 水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。若没有水浴锅，也可用1500或 2000W电炉或电饭锅代替。电炉应配有不锈钢锅。 8．酸度计 组织培养中培养基pH值的准确度是十分重要的， 应当使用酸度计，若无酸度计，也 可使用精密pH试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量pH时，待 测液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整pH计上的温度扭使之和培养基温度相 当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖上电极帽。 9．培养基分装设备 小型组织培养实验室可采用烧杯、漏斗等作为分装培养基的工具。也可采 用医用"下口杯"作为分装工具，在"下口杯"的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止水夹，使用时非 常合用。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量灌注设备。 10．高压灭菌锅 用以进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型手提式高压灭菌 锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压灭菌锅。通常以电作能源。 11．烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干燥需保持80～ 100℃；进行干热灭菌需保持150℃，达1-3h；若测定干物重，则温度应控制在80℃烘干
12.恒温培养箱内有温度调节器，生化培养箱还配有光源，用于植物材料的培养。 三、无菌室（缓冲间和接种室） 无菌室是进行植物材料的消毒、切取、接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好 坏对组织培养成功与否起重要作用。 在工作方便的前提下，无菌操作室宜小不宜大，一般7~8m;要求地面、天花板及四壁尽可能密 闭光洁，平坦无缝，易于清洁和消毒。无菌操作室应配置拉动门，以减少开关门时的空气流动。 无菌操作室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装1~2盏紫外线灭菌灯，用以经常地照射 灭菌。最好能安置一小型空调，使室温可控，这样可让门窗紧闭，减少与外界空气对流。 无菌操作室应设有缓冲间，面积2m为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入 杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外灭菌灯，用以照射灭菌。 无菌操作室的主要设备及用具有： 1.接种箱在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫 外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。接种箱可自行仿 制。现在也有许多厂家能够提供很漂亮的有机玻璃做的接种箱。 2.超净工作台超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10 分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时， 超净台是很理想的设备。超净台功率在145~260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过 滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大 于0.32m的尘埃、细菌和真菌孢子等。超净空气的流速为24~30m/min,这己足够防止附近空气袭扰 而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操 作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 3.解剖镜解剖镜种类较多，用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。双筒解剖镜在分离 茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术 和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上要求带有照相装置，根据需要随时对所需材 料进行摄影记录。 4.无菌操作用的器具按单人超净台上的用量计：酒精灯1个：20~25cm长的医用镊子1把：4 号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；500ml广口瓶1只，内放70%酒精，用于浸泡镊子、 刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架，可自制。 5.搁架贮 放高压灭菌后等待接种的培养基。 四、培养室 是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要的培养架的大小、数目、及其 它附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要 求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。培养架大多由金属制成，一般设5层，最低一层离地高约10cm, 其它每层间隔30cm左右，培养架即高1.7m左右。培养架长度，因一般在每层上端装置日光灯，以供 照明，所以都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m,30W的长1m即可。宽度 一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度，一般保持在20~27℃左右，可安装窗式或立式空调机。要求温度 因热带植物和寒带植物等的种类不同而异，最好不同种类有不同的培养室。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70~80%为好，可安装加湿器。 培养架上装置日光灯时，可安装定时开关钟控制照明时间，植物组织培养的光照强度一般在 1000~4000勒克斯(1x),每天照明10~16h,也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件， 长日照植物需要长日照条件。 现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为能源，这样不但可以节省能源，而且组培苗 接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天用灯光作补充。 第二节设备和器材 一、 玻璃器皿 在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制 成，以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培 养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿.其中以试 管、三角瓶、培养皿等使用较多
12．恒温培养箱 内有温度调节器，生化培养箱还配有光源，用于植物材料的培养。 三、无菌室(缓冲间和接种室) 无菌室是进行植物材料的消毒、切取、接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌条件的好 坏对组织培养成功与否起重要作用。 在工作方便的前提下，无菌操作室宜小不宜大，一般7～8m2；要求地面、天花板及四壁尽可能密 闭光洁，平坦无缝,易于清洁和消毒。无菌操作室应配置拉动门，以减少开关门时的空气流动。 无菌操作室要求干爽安静，清洁明亮，在适当位置吊装1～2盏紫外线灭菌灯，用以经常地照射 灭菌。最好能安置一小型空调，使室温可控，这样可让门窗紧闭，减少与外界空气对流。 无菌操作室应设有缓冲间，面积2㎡为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以减少进出时带入 杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外灭菌灯，用以照射灭菌。 无菌操作室的主要设备及用具有： 1.接种箱 在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密闭、药剂熏蒸和紫 外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间长，工作效率低。接种箱可自行仿 制。现在也有许多厂家能够提供很漂亮的有机玻璃做的接种箱。 2.超净工作台 超净台的优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开机10 分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大，需要经常长久地工作时， 超净台是很理想的设备。超净台功率在145～260W左右，它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过 滤器，在这里把大部分空气尘埃先过滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大 于0.32m3的尘埃、细菌和真菌孢子等。超净空气的流速为24～30m/min，这已足够防止附近空气袭扰 而引起的污染，这样的流速也不会妨碍采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操 作，就可以保证无菌材料在转移接种过程中不受污染。 3．解剖镜 解剖镜种类较多， 用于分离微茎尖可采用双筒实体解剖镜。 双筒解剖镜在分离 茎尖等较小组织时，便于观察、操作，通常放大5-80倍。 放大40倍以上操作需要有相当熟练的技术 和较好的工具。为进行操作，要有照明装置。解剖镜上要求带有照相装置，根据需要随时对所需材 料进行摄影记录。 4.无菌操作用的器具 按单人超净台上的用量计：酒精灯1个；20～25cm长的医用镊子1把；4 号解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm医用剪1把；500ml广口瓶1只，内放70%酒精，用于浸泡镊子、 刀、剪等；用于架放灼烧过的刀、镊子的小架,可自制。 5.搁架贮 放高压灭菌后等待接种的培养基。 四、培养室 是将接种的材料进行培养生长的场所。培养室的大小可根据需要的培养架的大小、数目、及其 它附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。高度比培养架略高为宜，周围墙壁要 求有绝热防火的性能。 培养材料放在培养架上培养。 培养架大多由金属制成，一般设5层， 最低一层离地高约10㎝， 其它每层间隔30㎝左右，培养架即高1.7m左右。 培养架长度，因一般在每层上端装置日光灯,以供 照明，所以都是根据日光灯的长度而设计，如采用40W日光灯，则长1.3m，30 W的长１m即可。宽度 一般为60cm。 培养室最重要的因子是温度， 一般保持在20～27℃左右，可安装窗式或立式空调机。要求温度 因热带植物和寒带植物等的种类不同而异，最好不同种类有不同的培养室。 室内湿度也要求恒定，相对湿度以保持在70～80%为好,可安装加湿器。 培养架上装置日光灯时，可安装定时开关钟控制照明时间，植物组织培养的光照强度一般在 1000～4000勒克斯（lx），每天照明10～16h，也有的需要连续照明。短日照植物需要短日照条件， 长日照植物需要长日照条件。 现代组培实验室大多设计为采用天然太阳光照作为能源， 这样不但可以节省能源,而且组培苗 接受太阳光生长良好，驯化易成活。在阴雨天用灯光作补充。 第二节 设备和器材 一、玻璃器皿 在组织培养中配制培养基和进行培养需大量的玻璃器皿。 要求由碱性溶解度小的硬质玻璃制 成， 以保证长期贮存药品及培养的效果；培养用的还要求透光度好，能耐高压高温，能方便放入培 养基和培养材料的器皿，根据培养的目的和要求，可以采用不同种类、规格的玻璃器皿.其中以试 管、三角瓶、培养皿等使用较多
最常使用的是三角瓶，规格有100、250、500毫升等，一般使用100毫升三角瓶，无论静止或振 荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。 培养皿常用9、12厘米直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、花粉等 的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。 试管常用口径18×180mm或20×200mm规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。 培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200m1罐头瓶，加盖半透明 的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺 点是易引起污染。 目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透 明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可增加培养的植株数，并能一层层地 叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。 有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带 螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时是非常方便的。 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前 封口常用棉塞。不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。现在多采用聚丙烯塑料 膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样 经济方便，且通气好。也可采用专用的封口材料如封口膜。 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括 100、250、1000毫升烧杯：100、1000毫升量筒：100、1000毫升试剂瓶（棕色）等等。 二、器械用具 1.镊子类 主要采用枪式镊子。根据操作的需要有各种规格，若用100毫升的三角瓶作为培养瓶，可用20厘 米长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。某些微小部分 的精细操作则用钟表镊子，如在分离茎尖幼叶时，由于其尖端锋利，所以几乎可代替剪刀使用。 2.剪刀类 可采用弯头剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪 切。 3.解剖刀 切割较小材料时可用解剖刀。分离茎尖分生组织，有时也用解剖刀。常用的解剖刀刀片可以 经常调换，刀口要保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养 效果。 4.解剖针 解剖针用于深入到培养瓶中，转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶。 第三节培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学 环境条件都会影响组培苗的生长和发育。 一、温度 培养物生长的最适温度大致上与该植物在原产地生长的最适温度相同。一般植物在最适温度下 生长分化表现良好，大多数植物培养都是在23~27℃之间进行，很多研究者采用了25±2℃的恒温 条件。低于15℃时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。但是，不同植物培养的适 温不同。百合的最适温度是20℃、月季是25~27℃、番茄是28℃。温度不仅影响组培苗的生长速 度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好，在12℃以下， 33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都 比在25℃下的高。桃胚在2~5℃条件进行一定时间的低温处理，有利于提高胚培养成活率。用 35℃处理草莓的茎尖分生组织3~5天，可得到无病毒苗。所以，适宜的温度不是固定和恒定的温 度。 二、光照 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1.光照强度光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，尤其对外植体细胞的最 初分裂有明显的影响。对大多数植物来说，1000-50001x的光强即能满足一般组织培养的需要。一般
最常使用的是三角瓶，规格有100、250、500毫升等， 一般使用100毫升三角瓶，无论静止或振 荡培养皆适用。其培养面积大，利于组织生长，受光也比试管好。由于瓶口较小，亦不易污染。 培养皿常用9、12厘米直径等规格，要求上、下能密切吻合。这在游离细胞、原生质体、花粉等 的静置培养、看护培养、无菌种子的发芽、植物材料的分离等都需采用。 试管常用口径18×180 mm或20×200mm规格。可用于培养较高的试管苗，另外也不易污染。 培养器皿还可就地取材，采用一些代用品。工厂化生产可采用广口的200ml罐头瓶，加盖半透明 的塑料盖，由于瓶口大，所以大量繁殖时操作方便、工作效率高，也减少了培养材料的损伤。但缺 点是易引起污染。 目前，培养容器和制备培养基所需的玻璃器皿渐被塑料器皿所代替。塑料容器具有质轻、透 明、不易破碎、成本低等优点，如培养容器多为平底方盒形，可增加培养的植株数，并能一层层地 叠摞起来，从而节约空间。这类塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高温，可进行高压灭菌。 有些产品为一次性消耗品，不但可节省洗涤人工，还可节省时间，提高效率。一次性塑料容器或带 螺丝帽的玻璃瓶，无须另外配盖，使用时是非常方便的。 瓶口封塞可用多种方法，要具有一定的通气性和密闭性，以防止培养基干燥和杂菌污染。以前 封口常用棉塞。不过这种封口办法夏季极易污染，且不易保持培养基湿度。现在多采用聚丙烯塑料 膜作为封口，以线绳结扎或橡皮圈箍扎。为了增加通气性，可在里面衬一层硫酸纸或牛皮纸。这样 经济方便，且通气好。也可采用专用的封口材料如封口膜。 在组织培养中配制培养基，贮藏母液，材料的消毒等需要各种化学实验用的玻璃器皿，包括 100、250、1000毫升烧杯；100、1000毫升量筒； 100、1000毫升试剂瓶（棕色）等等。 二、器械用具 １．镊子类 主要采用枪式镊子。根据操作的需要有各种规格，若用100毫升的三角瓶作为培养瓶，可用20厘 米长的镊子。镊子过短.容易使手接触瓶口，造成污染。镊子太长，使用起来不灵活。某些微小部分 的精细操作则用钟表镊子， 如在分离茎尖幼叶时，由于其尖端锋利，所以几乎可代替剪刀使用。 ２．剪刀类 可采用弯头剪刀。主要用于切断茎段、叶片等。 由于其头部弯曲，可以深入到瓶口中进行剪 切。 3．解剖刀 切割较小材料时可用解剖刀。 分离茎尖分生组织，有时也用解剖刀。 常用的解剖刀刀片可以 经常调换，刀口要保持锋利状态，否则切割时会造成挤压，引起周围细胞组织大量死亡，影响培养 效果。 ４．解剖针 解剖针用于深入到培养瓶中， 转移细胞或愈伤组织。也可用于分离微茎尖的幼叶。 第三节 培养条件 在植物组织培养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、PH值、渗透压等各种化学 环境条件都会影响组培苗的生长和发育。 一、温度 培养物生长的最适温度大致上与该植物在原产地生长的最适温度相同。一般植物在最适温度下 生长分化表现良好， 大多数植物培养都是在23～27℃之间进行，很多研究者采用了25±2℃的恒温 条件。低于15℃时培养，组织会表现生长停止，高于35℃时对生长不利。但是，不同植物培养的适 温不同。百合的最适温度是20℃、月季是25～27℃、番茄是28℃。 温度不仅影响组培苗的生长速 度，也影响其分化增殖以及器官建成等发育进程。如烟草芽的形成以28℃为最好， 在12℃以下， 33℃以上形成率皆最低。 不同培养目标采用的培养温度也不同，百合鳞片在30℃下再生的小鳞茎的发叶速度和百分率都 比在25℃下的高。 桃胚在2～5℃条件进行一定时间的低温处理， 有利于提高胚培养成活率。用 35℃处理草莓的茎尖分生组织3～5天，可得到无病毒苗。所以，适宜的温度不是固定和恒定的温 度。 二、光照 组织培养中光照也是重要的条件之一， 主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 1．光照强度 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，尤其对外植体细胞的最 初分裂有明显的影响。对大多数植物来说，1000-5000lx的光强即能满足一般组织培养的需要。一般
来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2.光质 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。如百合珠芽在红光下 培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天 后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3.光照时间（光周期） 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行培养，最常用的周期是16小时的光照，8小时的 黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组 织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌柏树的愈伤组 织。 三、湿度 湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影 响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于 外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高 的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。通常培养容器的湿度可达100%。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70%~80%的相对湿度，常用加湿器或 经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变 和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行；过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 三、渗透压 培养基中添加的盐类、蔗糖、甘露醇及聚乙二醇类高分子化合物，影响到渗透压的变化。1~2 个大气压对生长有促进作用，2个大气压以上就对生长有阻碍作用，5~6个大气压生长就完全停止， 6个大气压细胞就不能生存。 四、PH值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（表2-1），大多在5.0~6.5左右，一般培养基 皆掌握在5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。 表2-1不同植物的最适PH值 种 类 最适PH值 种 类 最适PH值 杜鹃 4.0 月季 5.8 柑橘 4.5 胡萝卜 6.0 枣树 5.5 桃 7.0 葡萄 5.7 大岩桐 5.6 PH值适宜度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一 样，后者较高一些。一般来说当PH高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因 为高温灭菌会降低PH值（约0.2~0.3）因此在配制时常提高PH值0.2~0.3单位。PH值大小调整可 用0.1M的NaOH和1M的HCL来调整。1ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，1ml的HCL可使值降低0.2单 位。调节时一定要充分搅拌均匀。 五、气体 培养容器中的气体成分会影响到培养物的生长和分化。氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封 闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养 基干燥，夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度，以利于发根。培养室要经常换 气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类 型、培养基等。 本章小结 1.植物组织培养实验室一般由洗涤室、化学实验室、无菌室和培养室构成。其中，无菌室是一 个最为重要的操作室。 2.植物组织培养常用的设备和器材有：玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿等：器械用具，如 镊子、剪刀、解剖刀、解剖针等：仪器设备，如超净工作台、冰箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、烘 箱等。 3.温度、光照、氧气、PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根 据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。 复习思考题
来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 2．光质 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下 培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下，几周后才出现愈伤组织，而唐菖蒲子球块接种15天 后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3．光照时间（光周期） 试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行培养， 最常用的周期是16小时的光照， 8小时的 黑暗，研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织， 在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组 织，有时需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌桕树的愈伤组 织。 三、湿度 湿度的影响包括培养容器和环境的湿度条件， 容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影 响。 前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于 外植体接触或插进培养基， 导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭度较高 的封口材料易引起通透性受阻，也导致生长发育受影响。通常培养容器的湿度可达100%。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发， 一般要求70%～80%的相对湿度， 常用加湿器或 经常洒水的方法来调节湿度。湿度过低会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变 和渗透压的升高,进而影响组织培养的正常进行；过高时，易引起棉塞长霉，造成污染。 三、渗透压 培养基中添加的盐类、蔗糖、甘露醇及聚乙二醇类高分子化合物，影响到渗透压的变化。1～2 个大气压对生长有促进作用，2个大气压以上就对生长有阻碍作用，5～6个大气压生长就完全停止， 6个大气压细胞就不能生存。 四、PH值 不同的植物对培养基最适PH值的要求也是不同的（表2-1），大多在5.0～6.5左右，一般培养基 皆掌握在5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。 表2-１ 不同植物的最适PH值 种 类 最适PH值 种 类 最适PH值 杜鹃 4.0 月季 5.8 柑橘 4.5 胡萝卜 6.0 枣树 5.5 桃 7.0 葡萄 5.7 大岩桐 5.6 PH值适宜度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一 样，后者较高一些。一般来说当PH高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。因 为高温灭菌会降低PH值（约0.2～0.3 ） 因此在配制时常提高PH值0.2～0.3单位。PH值大小调整可 用0.1M的NaOH和1M的HCL来调整。１ml的NaOH可使PH值升高0.2单位，１ml的HCL可使值降低0.2单 位。调节时一定要充分搅拌均匀。 五、气体 培养容器中的气体成分会影响到培养物的生长和分化。氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封 闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。通气最好的是棉塞封闭瓶口，但棉塞易使培养 基干燥， 夏季易引起污染。固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。培养室要经常换 气，改善室内的通气状况。液体振荡培养时，要考虑振荡的次数、振幅等，同时要考虑容器的类 型、培养基等。 本章小结 1．植物组织培养实验室一般由洗涤室、化学实验室、无菌室和培养室构成。其中，无菌室是一 个最为重要的操作室。 2．植物组织培养常用的设备和器材有：玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿等；器械用具，如 镊子、剪刀、解剖刀、解剖针等；仪器设备，如超净工作台、冰箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、烘 箱等。 3．温度、光照、氧气、PH、湿度都会影响到组织培养成功率，因此，实际培养外植体时，要根 据不同的植物材料，将上述因素调整到适宜的范围。 复习思考题
1.因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些组成部分？各部分的作用是什么？ 2.常规组织培养时，需要什么设备和器械？各设备如何使用？ 3.组织培养中，PH有什么作用？如果PH过高或过低会有什么后果？ 4.谈谈组织培养中如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度？
1．因地制宜建一个组织培养实验室，需要哪些组成部分？各部分的作用是什么？ 2．常规组织培养时，需要什么设备和器械？各设备如何使用？ 3．组织培养中，PH有什么作用？如果PH过高或过低会有什么后果？ 4．谈谈组织培养中如何根据外植体的不同调整适宜的培养温度？