第十四章吸光光度法 一、 光的本质与颜色 二、 吸收光谱曲线 ·三、光的吸收定律 ·四、工作曲线 ·五、光度分析计算示例 台职院生化系 奚立民副教授 国意目录 逝图看项
第十四章 吸光光度法 • 一、光的本质与颜色 • 二、吸收光谱曲线 • 三、光的吸收定律 • 四、工作曲线 • 五、光度分析计算示例 台职院生化系 奚立民副教授
第七章吸光光度法 根据物质对一定波长光线的吸收程度以确定物质含量的分析方法 一、 光的本质与颜色 1. 光的本质 E=hehC 光具有波粒二象性，越大，E越低。 即长波能量大，短波能量小。 粒子性 波动性 ()可见光的颜色与波长 光色 波长(nm) 紫 400≈450 X 射 兰 450~480 射线 外线 近紫外线 近红外线 红外线 微 紫 红 波 无线电波 绿兰 480490 线 兰绿 490≈500 绿 500~580 400 750 入/nm 黄 580600 橙 600≈650 可见光（范围无严格界限） 红 650≈750 电磁波谱图 国特身束逅周音负
第七章 吸光光度法 根据物质对一定波长光线的吸收程度以确定物质含量的分析方法 一、光的本质与颜色 1. 光的本质 E=hν= 光具有波粒二象性，λ越大，E越低。 即长波能量大，短波能量小。 粒子性 波动性 (1)可见光的颜色与波长 400 750 λ/nm 可见光（范围无严格界限） 电磁波谱图 C h γ 射 线 X 射 线 ┄ 紫 外 线 近 紫 外 线 紫 ┄ 红 红 外 线 微 波 ┄ 无 线 电 波 近 红 外 线 光色 波长（nm） 紫 400～450 兰 450～480 绿兰 480～490 兰绿 490～500 绿 500～580 黄 580～600 橙 600～650 红 650～750
(2)互补色光 将两种适当的色光按一 例如：昌色宋阻炎 定强度比例混合后，也可以 成为白光。这两种色光称为 是由各种色光按一定比例 互补色光。 混合而成的混合光。 互补色光图 红 白光 紫 橙 若将互补色光图中对角线 黄 上的两种色光按一定比例混合， 也可以形成白光。如红与青、 黄与兰、绿与紫等。不在对角 青当 绿 线上的两种色光，无论按任何 比例混合都不可能形成白光。 回芯目录 返国香预
（2）互补色光 将两种适当的色光按一 定强度比例混合后，也可以 成为白光。这两种色光称为 互补色光。 互补色光图 红 紫 橙 兰 黄 青兰 绿 青 例如： 是由各种色光按一定比例 混合而成的混合光。 若将互补色光图中对角线 上的两种色光按一定比例混合， 也可以形成白光。如红与青、 黄与兰、绿与紫等。不在对角 线上的两种色光，无论按任何 比例混合都不可能形成白光。 白光
2.物质颜色 由透过光颜色（即吸收光的互补色）决定。 例如疏酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈 兰色。 例如高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而 呈紫色。 有时晚霞天空呈 红色是因为大气层 吸收了白色阳光中 的青光，而进入我 们眼睛的透过光所 以呈红色。 黑色、白色、灰色是对白光中的各种色光进行 全吸收、全不吸收和均匀吸收的结果。可归属 于三种极端颜色。 国总自录要
2. 由透过光颜色（即吸收光的互补色）决定。 • 例如硫酸铜溶液因吸收了白光中的黄色光而呈 兰色。 • 例如高锰酸钾溶液因吸收了白光中的绿色光而 呈紫色。 • 有时晚霞天空呈 红色是因为大气层 吸收了白色阳光中 的青光，而进入我 们眼睛的透过光所 以呈红色。 • 黑色、白色、灰色是对白光中的各种色光进行 全吸收、全不吸收和均匀吸收的结果。可归属 于三种极端颜色
二、 吸收光谱曲线 2.0 吸收光谱曲线的主要特点 (1)max与浓度C无关。曲 线形状随吸光物质的分子 结构不同而不同，利用这 一特点可用来进行定性分 析。 (2)A与C有关。其中A为吸 400480560 640 720 光度，随浓度C增大而增大， A/nm 利用这一特点可用来进行 不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线 定量分析。 Amax=525nm 吸光光度法主要用于定量分 析，哪么如何根据 与C的关系 最大吸收波长 来进行定量分析
二、吸收光谱曲线 不同浓度KMnO4溶液的吸收曲线 λmax=525nm 最大吸收波长 • 吸收光谱曲线的主要特点 （1）λmax与浓度C无关。曲 线形状随吸光物质的分子 结构不同而不同，利用这 一特点可用来进行定性分 析。 （2）A与C有关。其中A为吸 光度，随浓度C增大而增大， 利用这一特点可用来进行 定量分析。 吸光光度法主要用于定量分 析，哪么如何根据A与C的关系 来进行定量分析呢
三、光的吸收定律 1.公式推导（碰撞理论） -dINI 表示光强减弱物质分子数 若溶液浓度为C(mol/L), 则N=C×6.02×1023.xy.db.103 入射光1o-- 故-d=k'N=k'.6.02×1020.xy.C.db.I 透过光It d db为无限的薄层 比例常数 -b (cm) 为在db中吸收光 如果特制x,y为统一规格，则k'.6.02×1020.xy=k（常数) 的强度 ∴.-d/=kCdb (吸光系数a=k/2.303) dI为在db中吸收 c业=kcd-h么=khc或-lg 、 t bc三abc光强度的变化 02.303 令亚=T(透光度)， 则有g 。=-g么-gT=4(吸光度) 1o It 即A=-lgT=abc 国卷目录 西言项
三、光的吸收定律 1. 公式推导（碰撞理论） -dI∝NI 表示光强减弱 物质分子数 若溶液浓度为C（mol/L）, y 则N=C×6.02×1023 • x •y • db •10-3 入射光Io 故 -dI=k’NI=k’• 6.02×1020 • x •y • C • db • I x 透过光It db db为无限的薄层 比例常数 b (cm) I为在db中吸收光 如果特制x，y为统一规格，则k’•6.02×1020 • x •y =k（常数） 的强度 ∴ -dI/I=kCdb (吸光系数a=k/2.303) dI为在db中吸收 ， 光强度的变化 − = It Io b k c db I dI 0 kbc Io It − ln = bc abc k Io It − = = 2.303 或 lg T Io It 令 = T A Io It It Io 则有lg = −lg = −lg = 即A = −lgT = abc （透光度）， （吸光度）
2.吸收定律意义 当一束单色光平行照射并通过均匀的、非散射的吸 光物质的溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度C和液层厚 度b的乘积成正比。这一关系称为朗伯-比尔定律。 当c不变，而b改变时：A=acb=kb(郎伯定律) 当b不变，而c改变时：A=acb=k2c（比尔定律) ·朗伯-比尔定律使用条件： (1)入射光为单色光 (2)一般为低浓度溶液 (3)入射光强度1o不变 (4)吸光物质不变 当b单位用cm,c单位用gL时，a单位为Lgl.cml 吸光系数a 当b单位用cm,c单位用mol/L时，a单位为Lmol-1.cm-l 此时特称为摩尔吸光系数，用表示。 国总目绿 港面香预
2. 吸收定律意义 当一束单色光平行照射并通过均匀的、非散射的吸 光物质的溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度C和液层厚 度b的乘积成正比。这一关系称为朗伯-比尔定律。 当c不变，而b改变时：A=acb=k1b（郎伯定律） 当b不变，而c改变时：A=acb=k2c（比尔定律） • 朗伯-比尔定律使用条件： （1）入射光为单色光 （2）一般为低浓度溶液 （3）入射光强度Io不变 （4）吸光物质不变 当b单位用cm，c单位用g/L时，a单位为L•g -1 •cm-1 吸光系数a 当b单位用cm，c单位用mol/L时，a单位为L•mol-1 •cm-1 此时特称为摩尔吸光系数，用κ表示
四、工作曲线 配一系列标准溶液c1、c2、C3、c4,在.max下测得 A1A2、A3、A4,以A为纵坐标，C为横坐标作图。 (Omax根据吸收光谱曲线测得，且Io,b和吸光物质均一定) C 只要在相同条件下，测得试样溶液的吸光度Ax,从吸 收光谱曲线上可以查出对应的Cx,最后算出被测物含量。 港西言项
四、工作曲线 配一系列标准溶液c1、c2、c3、c4……，在λmax下测得 A1、A2、A3、A4……，以A为纵坐标，C为横坐标作图。 (λmax 根据吸收光谱曲线测得，且Io，b和吸光物质均一定) A Ax c1 c2 c3 cx c4 C 只要在相同条件下，测得试样溶液的吸光度Ax，从吸 收光谱曲线上可以查出对应的Cx，最后算出被测物含量
五、光度分析计算示例 例7-1用磺基水杨酸比色法测定铁的 A 含量加入标准铁溶液及有关试剂后，在 0.60 50mL容量瓶中稀释至刻度，测得下列数据： 标准铁溶液浓度(g·mL-1) 0.40 2.04.06.08.010.0 12.0 A0.0970.2000.3040.4080.5100.613 0.20 在相同条件下测得试样溶液的吸光度 为0.413，求试样溶液中铁的含量（以mg: L表示)。 02.04.06.08.010.012.0 解：以吸光度A为纵坐标，标准铁溶 液浓度为横坐标作图（见右图)。 PFe/μgmLl 从曲线上可查得吸光度为0.413时的浓 磺基水杨酸铁工作曲线 度为8.2μg·mL1,即8.2mgmL1
五、光度分析计算示例 例7-1 用磺基水杨酸比色法测定铁的 含量加入标准铁溶液及有关试剂后，在 50mL容量瓶中稀释至刻度，测得下列数据： 在相同条件下测得试样溶液的吸光度 为0.413，求试样溶液中铁的含量（以mg • L-1表示）。 解：以吸光度A为纵坐标，标准铁溶 液浓度为横坐标作图（见右图）。 从曲线上可查得吸光度为0.413 时的浓 度为8.2 μg • mL-1，即8.2 mg•mL-1 A 0.60 0.40 0.20 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 ρ Fe / μg • mL-1 磺基水杨酸铁工作曲线 标准铁溶液浓度（ μg • mL-1 ） 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 A 0.097 0.200 0.304 0.408 0.510 0.613
例7-2用磺基水杨酸法测定某矿样中铁含量，工作曲线 数据同例7-1，称取矿样0.3866g,分解后移入100mL容量瓶， 吸取5.0mL试液置于50mL容量瓶中，在与工作曲线相同条件 下显色，测得溶液的吸光度A=0.250,求矿样中铁的质量分数。 解：由工作曲线查得吸光度为0.250 时含铁量为5.0g.mLl,由于试样是在与 工作曲线相同条件下显色测定，即5.0L 试样中含铁5.0g，则0.3866g矿样中铁 的质量分数为： 100mL 5.0g× 5.0mL ×1068·g OFe= ×100% 0.3866g =0.026% 返图首项
例7-2 用磺基水杨酸法测定某矿样中铁含量，工作曲线 数据同例7-1，称取矿样0.3866g，分解后移入100mL容量瓶， 吸取5.0mL试液置于50mL容量瓶中，在与工作曲线相同条件 下显色，测得溶液的吸光度A=0.250，求矿样中铁的质量分数。 解：由工作曲线查得吸光度为0.250 时含铁量为5.0 μg • mL-1 ,由于试样是在与 工作曲线相同条件下显色测定，即5.0mL 试样中含铁5.0 μg ，则0.3866g矿样中铁 的质量分数为： =0.026% 100% 0.3866 10 5.0 100 5.0 1 6 = − − g g mL mL g g F e