第二部分分子遗传学实验实验一基因组DNA的提取一、实验目的1、掌握动物基因组DNA的基本提取方法。2、比较哺乳动物与鸟类的DNA提取方法的不同。二、实验原理从哺乳动物上皮组织或鸟类外周血液中提取高质量的基因组DNA是进行分子遗传学实验的基础操作。本实验介绍用蛋白酶K和苯酚从哺乳动物上皮组织和鸡血液细胞中分离高质量的DNA的方法。其原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质去除干净：②尽可能保持DNA分子的完整性。在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K为广谱蛋白酶，其主要的特征是能在SDS和EDTA存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS是离子型表面活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜：②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀下来：④抑制DNA酶活性，使DNA分子尽量完整地分离出来。核酸通过苯酚等有机溶剂抽提进行纯化，苯酚溶解小分子蛋白和糖类等有机杂质，形成有机相并与溶解DNA的水相分离。三、实验条件（一）主要设备电子天平、恒温摇床、混合仪、高速离心机、可调式移液器、稳压稳流电泳仪、自动电热压力蒸汽灭菌器（二）主要试剂1.禽血裂解液：120g尿素，10gSDS，100ml/Tris.cl(1M,PH=8.0)，200mlEDTA(0.5M,PH=8.0)蒸馏水定容至1升。1ml血加9ml裂解液。2.Tris-Cl(1M)：121.1gTris碱溶解至800ml蒸馏水中后，加42ml的浓盐酸调其pH值至8.0，加水定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。3.0.5MEDTA（PH8.0）：186.1克乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H2O）溶于800ml双蒸水中，用NaOH调PH值至8.0，定容至1L，高压灭菌。4.蛋白酶K（20mg/ml）：20mg蛋白酶K溶于1ml灭菌双蒸水中，-20℃保存备用。5.Tris-饱和苯酚6.5MNaCl：150ml水中加入58.44gNaCl，加水定容至200ml，高压灭菌。7.TE::1mlmol/LTris-HCI(pH7.4-8.0,25℃),0.2ml0.5mol/LEDTA(pH8.0),98.8ml双蒸水，分装后在15psi（1.05kg/cm2）的高压下蒸汽灭菌20min，在室温保存。8.组织DNA裂解液：分别加1mlTris-CI(1M，PH8.0)、4mlEDTA(0.5M，PH8.0)、400川NaCI（5M)、2mlSDS（10%）于20ml的容量瓶中，最后定容至20ml，则以上四
第二部分 分子遗传学实验 实验一 基因组 DNA 的提取 一、实验目的 1、掌握动物基因组 DNA 的基本提取方法。 2、比较哺乳动物与鸟类的 DNA 提取方法的不同。 二、实验原理 从哺乳动物上皮组织或鸟类外周血液中提取高质量的基因组 DNA 是进行分子遗传学实 验的基础操作。本实验介绍用蛋白酶 K 和苯酚从哺乳动物上皮组织和鸡血液细胞中分离高 质量的 DNA 的方法。其原则是：①将蛋白质、脂类、糖类等物质去除干净；②尽可能保持 DNA 分子的完整性。 在提取DNA的反应体系中，蛋白酶K 为广谱蛋白酶，其主要的特征是能在SDS 和EDTA 存在的情况下保持很高的活性，可将蛋白质降解成小的多肽和氨基酸。SDS 是离子型表面 活性剂，主要作用是：①破坏细胞膜及核膜；②解聚细胞中的核蛋白；③与蛋白质结合，使 蛋白质变性而沉淀下来；④抑制 DNA 酶活性，使 DNA 分子尽量完整地分离出来。核酸通 过苯酚等有机溶剂抽提进行纯化，苯酚溶解小分子蛋白和糖类等有机杂质，形成有机相并与 溶解 DNA 的水相分离。 三、实验条件 （一）主要设备 电子天平、恒温摇床、混合仪、高速离心机、可调式移液器、稳压稳流电泳仪、 自动电热压力蒸汽灭菌器 （二）主要试剂 ⒈ 禽血裂解液：120g尿素，10gSDS，100mlTris.cl(1M,PH=8.0)，200mlEDTA(0.5M,PH=8.0), 蒸馏水定容至 1 升。1ml 血加 9ml 裂解液。 ⒉ Tris-Cl (1M)：121.1gTris 碱溶解至 800ml 蒸馏水中后，加 42ml 的浓盐酸调其 pH 值 至 8.0，加水定容至 1L。分装后高压蒸汽灭菌。 ⒊ 0.5M EDTA（PH 8.0）：186.1 克乙二胺四乙酸二钠（Na2 EDTA·2H2O）溶于 800ml 双 蒸水中，用 NaOH 调 PH 值至 8.0，定容至 1L，高压灭菌。 ⒋ 蛋白酶 K（20mg/ml）：20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 灭菌双蒸水中，-20℃保存备用。 ⒌ Tris-饱和苯酚 ⒍ 5M NaCl：150ml 水中加入 58.44gNaCl，加水定容至 200ml，高压灭菌。 ⒎ TE:：1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25℃），0.2 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），98.8ml 双蒸水，分装后在 15psi (1.05kg/cm2 )的高压下蒸汽灭菌 20min，在室温保存。 ⒏ 组织 DNA 裂解液：分别加 1ml Tris-Cl (1M，PH 8.0)、4ml EDTA (0.5M，PH 8.0)、 400µl NaCl (5M)、2ml SDS (10%)于 20ml 的容量瓶中，最后定容至 20ml，则以上四
种物质的终浓度分别为：Tris-CI50mM，EDTA100mM，NaCI100mM，SDS1%。9.PBS缓冲液（7.4）：用800ml蒸馏水溶解8gNaCI,0.2gKC，1.44gNa2HPO4和0.24gK2HPO4.用浓盐酸调节溶液的pH值到7.4，加水至1L，分装高压灭菌，室温保存。10.10%SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。11.氯仿12.70%乙醇：70ml无水乙醇溶于30ml去离子水中。13.冰乙醇：无水乙醇4℃保存备用。四、实验方法和步骤（一）鸡血液DNA提取1.收集1ml新鲜血液（若为冻存血样，室温水浴中解冻血样)于含有9ml裂解液的管中。2.各取200川裂解血液到1.5ml离心管中（标明样品号），加入500ul裂解缓冲液。3.加入蛋白酶K（20mg/ml）7μ1，至终浓度200μg/ml，50-55℃消化过夜。4.将溶液冷却至室温，加入700ulTris一CI饱和苯酚（pH8.0),颠倒混匀10min。5.室温下10000rpm离心10~15min以分离两相。6.用宽口移液枪（剪去一部分枪头)将粘滞的水相转移到另一离心管（约取500一600ul）。7.重复步骤4-5-6，获得上清液400一500ul，用400一500ul（等体积）氯仿抽提一次，步骤同4-5-6，获得上清液300一400ul。8.加入600ul（2倍体积）冰乙醇（4℃放置），旋转离心管，DNA即形成沉淀，挑出沉淀到新的离心管中或室温下10000rpm离心5min，收集沉淀。9.用70%乙醇洗涤DNA沉淀两次，按步骤10收集沉淀。10.吸去痕量乙醇，室温下直到乙醇挥发殆尽。11.加入50～100ulTE或超纯水充分溶解DNA。（二）哺乳动物组织DNA提取1.将1g左右的组织样品在液氮中速冻，然后放入液氮预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨。2.液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10ml(m/V裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，而后振荡烧杯使粉末浸没。3.将悬液转移至50ml离心管，并于37℃温浴1h。4.将裂解液转移到20个1.5ml的离心管中。5.加入蛋白酶K3ul至终浓度100g/ml。6.将细胞裂解液置于50℃水浴中3h，不时旋转粘滞的溶液。7.将溶液冷却至室温，加入的0.5ml0.1MTris-CI(pH8.0)平衡过的苯酚，颠倒混匀10min。此时还不能形成乳浊液。8.重复“（一）鸡血液DNA提取”中的步骤5-6-7-8-9-10-11。五、实验注意事项
种物质的终浓度分别为：Tris-Cl 50mM，EDTA 100 mM，NaCl 100 mM，SDS 1%。 ⒐ PBS 缓冲液（7.4）：用 800ml 蒸馏水溶解 8g NaCl ,0.2gKCl，1.44gNa2HPO4 和 0.24g K2HPO4。用浓盐酸调节溶液的 pH 值到 7.4，加水至 1L，分装高压灭菌，室温保存。 ⒑ 10％SDS（十二烷基硫酸钠）：称取 100gSDS 慢慢转移到约含 0.9L 的水的烧杯中，用 磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至 1L。 ⒒ 氯仿 ⒓ 70%乙醇：70ml 无水乙醇溶于 30ml 去离子水中。 ⒔ 冰乙醇：无水乙醇 4℃保存备用。 四、实验方法和步骤 （一）鸡血液 DNA 提取 ⒈ 收集 1ml 新鲜血液(若为冻存血样，室温水浴中解冻血样)于含有 9ml 裂解液的管中。 ⒉ 各取 200 µl 裂解血液到 1.5ml 离心管中（标明样品号），加入 500ul 裂解缓冲液。 ⒊ 加入蛋白酶 K（20mg/ml）7μl，至终浓度 200μg/ml，50-55℃消化过夜。 ⒋ 将溶液冷却至室温，加入 700 ul Tris－Cl 饱和苯酚(pH8.0),颠倒混匀 10 min。 ⒌ 室温下 10000rpm 离心 10~15min 以分离两相。 ⒍ 用宽口移液枪(剪去一部分枪头)将粘滞的水相转移到另一离心管（约取 500－600 ul）。 ⒎ 重复步骤 4-5-6，获得上清液 400－500ul，用 400－500ul（等体积）氯仿抽提一次， 步骤同 4-5-6，获得上清液 300－400ul。 ⒏ 加入 600ul（2 倍体积）冰乙醇（4℃放置），旋转离心管，DNA 即形成沉淀，挑出沉 淀到新的离心管中或室温下 10000rpm 离心 5min，收集沉淀。 ⒐ 用 70％乙醇洗涤 DNA 沉淀两次，按步骤 10 收集沉淀。 ⒑ 吸去痕量乙醇，室温下直到乙醇挥发殆尽。 ⒒ 加入 50～100ul TE 或超纯水充分溶解 DNA。 （二）哺乳动物组织 DNA 提取 ⒈ 将 1g 左右的组织样品在液氮中速冻，然后放入液氮预冷的研钵中，倒入液氮，迅速 研磨。 ⒉ 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有 10ml(m/V)裂解液的烧杯中，使其分 散于裂解液表面，而后振荡烧杯使粉末浸没。 ⒊ 将悬液转移至 50ml 离心管，并于 37℃温浴 1h。 ⒋ 将裂解液转移到 20 个 1.5ml 的离心管中。 ⒌ 加入蛋白酶 K3µl 至终浓度 100g/ml。 ⒍ 将细胞裂解液置于 50℃水浴中 3h，不时旋转粘滞的溶液。 ⒎ 将溶液冷却至室温，加入的 0.5ml 0.1M Tris-Cl(pH8.0)平衡过的苯酚，颠倒混匀 10 min。此时还不能形成乳浊液。 ⒏ 重复“（一）鸡血液 DNA 提取”中的步骤 5-6-7-8-9-10-11。 五、实验注意事项
1.苯酚和氯仿都具有较强得腐蚀性，实验操作要规范，防止意外发生。2.禁止身体接触液氮或用金属物接触液氮，防止人身伤害。3．倒入液氮后，操作要迅速，因为液氮蒸发地很快。4.蛋白酶K作为一种酶制剂，易失活，所以随用随拿，放在冰盒中。5.温浴温度应控制在45～55℃范围内进行，避免核酸酶对DNA的降解。6.抽提DNA时动作不要过猛，以防止机械震动将DNA分子打得太碎。7.室温下乙醇挥发后，防止DNA过于干燥，否则DNA不易溶于TE溶液。8.DNA溶于TE溶液时可先浓一些，发现太浓时再加些TE溶液，这样能保证DNA样品不至于太稀而无法使用，一般来说，DNA浓度为：0.4~0.6mg/ml最为理想。9.溶于TE溶液得DNA样品比较稳定，可在4℃冰箱中存放1年而不会降解。12345678910112000bp1000bp750bp500bp200bp100bp图1.鸡全血基因组DNA泳道1为DL2000分子量标记，2-11为基因组DNA六、思考题1、利用哺乳动物或鸡的血液提取DNA方法和结果是否相同，为什么？2、DNA提取过程中冰乙醇和70%乙醇的作用分别是什么？3、试回答实验过程中“蛋白酶K、饱和酚、氯仿”的作用。4、思考在整个基因组提取过程中，为什么要缓慢操作？这与DNA本身的性质有什么联系？七、实验报告根据自己所在小组的实验操作，做一份实验报告，要求写明实验目的，实验步骤，实验结果（依据胶图分析说明样品带分子量大小，所提取DNA的浓度、总量，DNA质量等情况）注意标明自己样品的标号，并根据思考题分析实验的注意事项。参考文献或书目：主修海，刘雯，张咸宁，主振华，《医学遗传学实验指导》（第一版），2001，科学出版社J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》（第三版），2002，科学出版社
1．苯酚和氯仿都具有较强得腐蚀性，实验操作要规范，防止意外发生。 2．禁止身体接触液氮或用金属物接触液氮，防止人身伤害。 3．倒入液氮后，操作要迅速，因为液氮蒸发地很快。 4．蛋白酶 K 作为一种酶制剂，易失活，所以随用随拿，放在冰盒中。 5．温浴温度应控制在 45～55℃范围内进行，避免核酸酶对 DNA 的降解。 6．抽提 DNA 时动作不要过猛，以防止机械震动将 DNA 分子打得太碎。 7．室温下乙醇挥发后，防止 DNA 过于干燥，否则 DNA 不易溶于 TE 溶液。 8．DNA 溶于 TE 溶液时可先浓一些，发现太浓时再加些 TE 溶液，这样能保证 DNA 样 品不至于太稀而无法使用，一般来说，DNA 浓度为：0.4~0.6mg/ml 最为理想。 9．溶于 TE 溶液得 DNA 样品比较稳定，可在 4℃冰箱中存放 1 年而不会降解。 六、思考题 1、利用哺乳动物或鸡的血液提取 DNA 方法和结果是否相同，为什么？ 2、DNA 提取过程中冰乙醇和 70％乙醇的作用分别是什么？ 3、试回答实验过程中“蛋白酶 K、饱和酚、氯仿”的作用。 4、思考在整个基因组提取过程中，为什么要缓慢操作？这与 DNA 本身的性质有什么联系？ 七、实验报告 根据自己所在小组的实验操作，做一份实验报告，要求写明实验目的，实验步骤，实验结 果（依据胶图分析说明样品带分子量大小，所提取 DNA 的浓度、总量，DNA 质量等情况）， 注意标明自己样品的标号，并根据思考题分析实验的注意事项。 参考文献或书目： 王修海，刘雯，张咸宁，王振华，《医学遗传学实验指导》（第一版），2001，科学出版社 J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔 著，黄培堂等 译，《分子克隆实验指南》（第三版），2002，科 学出版社 图 1. 鸡全血基因组 DNA 泳道 1 为 DL2000 分子量标记，2-11 为基因组 DNA 2000bp 1000bp 750bp 500bp 200bp 100bp