实验一小白鼠染色体标本的制备和观察一、实验原理在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养。通过活体注射秋水仙素，可以使部分细胞的分裂停止在中期，再经过低渗、固定就可获得大量的有丝分裂细胞。通过骨髓得到染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在实验条件下，这种染色体是机体内真实情况的反映。直接制片法是直接从骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。所谓空气干燥法实际上是将细胞经过秋水仙素处理——低渗处理——充分的固定——滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载片在室温下自然干燥的方法。二、实验材料、器具和试剂1：实验材料：小白鼠若干只。2.实验器具：冰箱、离心机、恒温水浴锅、显微镜、分析天平、药物天平、试管架、离心管、吸管、烧杯、量筒、注射器(1ml、5ml)、5号针头、载玻片、解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、切片盒、切片架、纱布。3.试剂：秋水仙素、柠檬酸钠、氯化钾、冰醋酸、甲醇、磷酸缓冲液、Giemsa、甘油、硫酸、重铬酸钾。三、实验方法和步骤1.秋水仙素处理取骨髓前3～4小时前给小白鼠经腹腔注入的秋水仙素液，注射剂量为2～4微克/克体重。（根据经验每只性成熟小鼠注射0.04%的秋水仙素0.3～0.4ml为宜）。2.取骨髓经秋水仙素处理的小白鼠，可用损伤脊髓法处死，然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉，取出大腿骨和胫骨，用一小块纱布擦干净附在骨上的肌肉碎渣（也可以用自来水冲洗干净）。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后将股骨剪碎投入小烧杯中，用2毫升2%柠檬酸钠溶液充分冲洗碎骨，使骨髓细胞游离出来。静止片刻，用吸管把悬浮液吸到离心管中，可重复冲洗一次。此时离心管中的细胞悬浮液可达4～5毫升。3.低渗将所获得的细胞悬浮液先进行平衡（注意：每次离心前都要平衡），然后以1000转/分离心8分钟，弃去上清液留沉淀物，向试管加入预热的0.075MKCL溶液至56毫升，将细胞沉淀物吹散打匀，在水浴37℃低渗20一21分钟，低渗结束后，用滴管加入5滴新配的甲醇-冰醋酸固定液，用吸管轻轻吹散均匀，以防细胞结团。4.第一次固定向试管中加入新配的甲醇-冰醋酸固定液5-6毫升，用吸管轻轻吹散沉淀物使其均匀分布在固定液中，室温静置20分钟后，平衡，1000转/分离心8分钟，弃上清留沉淀物。5.第二次固定加入甲醇-冰醋酸固定液5-6毫升，用吸管轻轻吸散均匀，室温静置20
实验一 小白鼠染色体标本的制备和观察 一、实验原理 在骨髓细胞中，有丝分裂的指数是相当高的，因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋 巴细胞那样要经过体外培养。通过活体注射秋水仙素，可以使部分细胞的分裂停止在中期， 再经过低渗、固定就可获得大量的有丝分裂细胞。 通过骨髓得到染色体是比较简便的，一般也无需无菌操作。在实验条件下，这种染色体是机 体内真实情况的反映。 直接制片法是直接从骨髓中取出细胞，经压片法或空气干燥法制片。所谓空气干燥法， 实际上是将细胞经过秋水仙素处理——低渗处理——充分的固定——滴片等步骤之后在载 玻片上得到染色体制片的技术。有时，有人把滴片的步骤叫做染色体分散，也有人把这一步 和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后，不加热或任何处理，使载片在室温 下自然干燥的方法。 二、实验材料、器具和试剂 1．实验材料：小白鼠若干只。 2．实验器具：冰箱、离心机、恒温水浴锅、显微镜、分析天平、药物天平、试管架、 离心管、吸管、烧杯、量筒、注射器(1ml、5ml)、5 号针头、载玻片、解剖盘、解剖刀、剪 刀、镊子、酒精灯、切片盒、切片架、纱布。 3．试剂：秋水仙素、柠檬酸钠、氯化钾、冰醋酸、甲醇、磷酸缓冲液、Giemsa、甘油、 硫酸、重铬酸钾。 三、实验方法和步骤 1．秋水仙素处理 取骨髓前 3～4 小时前给小白鼠经腹腔注入的秋水仙素液，注射剂量 为 2～4 微克／克体重。（根据经验每只性成熟小鼠注射 0.04%的秋水仙素 0.3～0.4ml 为宜）。 2．取骨髓 经秋水仙素处理的小白鼠，可用损伤脊髓法处死，然后用剪刀剪开大腿上的 皮肤和肌肉，取出大腿骨和胫骨，用一小块纱布擦干净附在骨上的肌肉碎渣（也可以用自来 水冲洗干净）。剪掉股骨两端膨大的关节头，然后将股骨剪碎投入小烧杯中，用 2 毫升 2％ 柠檬酸钠溶液充分冲洗碎骨，使骨髓细胞游离出来。静止片刻，用吸管把悬浮液吸到离心管 中，可重复冲洗一次。此时离心管中的细胞悬浮液可达 4～5 毫升。 3．低渗 将所获得的细胞悬浮液先进行平衡(注意：每次离心前都要平衡)，然后以 1000 转/分离心 8 分钟，弃去上清液留沉淀物，向试管加入预热的 0.075MKCL 溶液至 5～6 毫升， 将细胞沉淀物吹散打匀，在水浴 37℃低渗 20－21 分钟，低渗结束后，用滴管加入 5 滴新配 的甲醇-冰醋酸固定液，用吸管轻轻吹散均匀，以防细胞结团。 4．第一次固定 向试管中加入新配的甲醇-冰醋酸固定液 5-6 毫升，用吸管轻轻吹散沉 淀物使其均匀分布在固定液中，室温静置 20 分钟后，平衡，1000 转/分离心 8 分钟，弃上清， 留沉淀物。 5．第二次固定 加入甲醇-冰醋酸固定液 5-6 毫升，用吸管轻轻吸散均匀，室温静置 20
分钟。1000转/分离心8分钟，弃上清留沉淀物。6.滴片加入适量（4一6滴）固定液，轻轻吸散均匀制成细胞悬液，滴2一3滴于冰冻的载玻片上（载玻片须经硫酸洗液浸泡10天以上，经清水冲洗，用蒸馏水浸泡），空气干燥。7.将染色体制片反扣于染色板上，用1：9Giemsa稀释液染色30分钟，自来水冲洗，千后8.观察用低倍镜选择分散适度，不重叠的染色体分裂相，转高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特征，并计算2n的染色体数目。五、回答以下问题：1.为什么要用小鼠的骨髓细胞制备染色体标本？2．低渗的目的是什么？3.绘出你看到的小鼠染色体分裂相。如果你的实验不成功，借用同学的结果完成这个作业。4，写出下列生物的染色体对数，果蝇、鸡、奶牛、小鼠猪/。5．这次实验你最大的实验收获是什么？如果让你重新做一遍，你会怎么样？6.请对本次实验提出改进意见？附：Gimsa原液的配制先将吉姆萨充分研细，取粉末1克溶于66毫升纯甘油内，置于60℃温箱2h，再加甲醇66毫升混合即可。配制的染液为浓染液
分钟。1000 转/分离心 8 分钟，弃上清留沉淀物。 6．滴片 加入适量（4－6 滴）固定液，轻轻吸散均匀制成细胞悬液，滴 2－3 滴于冰冻 的载玻片上(载玻片须经硫酸洗液浸泡 10 天以上，经清水冲洗，用蒸馏水浸泡)，空气干燥。 7．将染色体制片反扣于染色板上，用 1：9Giemsa 稀释液染色 30 分钟，自来水冲洗， 干后 8．观察 用低倍镜选择分散适度，不重叠的染色体分裂相，转高倍镜详细观察小白鼠染 色体的形态特征，并计算 2n 的染色体数目。 五、回答以下问题： 1．为什么要用小鼠的骨髓细胞制备染色体标本？ 2．低渗的目的是什么？ 3．绘出你看到的小鼠染色体分裂相。如果你的实验不成功，借用同学的结果完成这个作业。 4．写出下列生物的染色体对数，果蝇_、鸡_、奶牛_、小鼠_、 猪_。 5．这次实验你最大的实验收获是什么？如果让你重新做一遍，你会怎么样？ 6．请对本次实验提出改进意见？ 附：Gimsa 原液的配制 先将吉姆萨充分研细，取粉末 1 克溶于 66 毫升纯甘油内，置于 60℃温箱 2h，再加甲醇 66 毫升混合即可。配制的染液为浓染液