重组DNA技术 Recombinant DNA Technology 刘新文 rih kroll 北京大学医学部生物化学与分子生物学系
重组DNA技术 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系
刘新文,重组DNA技术 第一节概述 DNA克隆 (DNA cloning):应用酶学的方法,在 体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子一复制子,继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞, 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。 DNA克隆又称基因克隆( gene cloning) ■基因工程( genetic engineering):实现基因克 隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技 A (recombinant DNa technology)
刘新文，重组DNA技术 第一节 概述 DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在 体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复 制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转 染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞， 再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。 DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）。 基因工程（genetic engineering）：实现基因克 隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技 术（recombinant DNA technology）
刘新文,重组DNA技术 、克隆体系:目的基因、载体DNA、工具酶、宿 主细胞等 1、目的基因( target gene):cDNA或基因组DNA >CDNA( complementary DNA):指体外经反转录 合成的,与RNA(常指mRNA)互补的单链DNA, 单链cDNA进而合成双链cDNA。 >基因组DNA( genomic DNA):代表一个细胞或生 物体整套遗传信息的所有DNA序列,称为基因组 DNA。 2、载体( (vector):质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、 病毒和人工染色体等2
刘新文，重组DNA技术 一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿 主细胞等 1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA 2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、 病毒和人工染色体等 ØcDNA （complementary DNA）：指体外经反转录 合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA, 单链cDNA进而合成双链cDNA。 Ø基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生 物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组 DNA
刘新文,重组DNA技术 >质粒( plasmid):存在于细菌染色体外的小型环 状双链DNA分子,在细胞中可以独立进行复制并在 细胞分裂时恒定地传给子代细胞 3、工具酶:限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚 合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA 酶、DNA酶,等 3限制性核酸内切酶 restriction endonuclease:在 于细菌体内,能够识别和切割双链DNA内部特定核 苷酸序列的一类核酸酶。2 常用的是I类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶ⅠI的识别序列属于回文结构
刘新文，重组DNA技术 Ø质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环 状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在 细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在 于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核 苷酸序列的一类核酸酶。 3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚 合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA 酶、DNA酶，等 Ø常用的是II类限制性内切酶 Ø许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构
刘新文,重组DNA技术 >配伍末端( compatible end):不同限制性内切酶产 生的相同粘性末端 32DNA聚合酶:大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶) Know片段( Klenow酶)、T4DNA聚合酶以及Taq酶等 33DNA连接酶 >T4连接酶:可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞:大肠杆菌、酵母、动物细胞
刘新文，重组DNA技术 Ø配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产 生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、 Klenow片段 (Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等 3.3 DNA连接酶 ØT4 连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞
刘新文,重组DNA技术 第二节DNA克隆的基本过程 ■分、切、接、转、筛、表达 、“分”:目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法:化学合成、PCR、基因组文库、 cDNA文库 >聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR): 在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特 异引物及耐热的DNA聚合酶(常用Iaq酶),经多次 变性、退火、延伸循环反应,使目的DNA呈指数合 成的过程
刘新文，重组DNA技术 第二节 DNA克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达 一、 “分” ：目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、 cDNA文库 Ø聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）： 在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特 异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次 变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合 成的过程
刘新文,重组DNA技术 >cDNA文库( CDNA library):以mRNA为模板,利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA,再复制成双链 CDNA片段,与适当载体连接后转入受体菌,这些受 体菌包含了所有cDNA信息,总称cDNA文库。常用 于筛选编码蛋白质的结构基因。 >基因组DNA文库( genomic dna library):利用限制 性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后,与 适当载体连接后转入受体菌,这些受体菌包含了所 有基因组DNA信息,总称基因组DNA文库
刘新文，重组DNA技术 ØcDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用 反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链 cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受 体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用 于筛选编码蛋白质的结构基因。 Ø基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制 性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与 适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所 有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库
刘新文,重组DNA技术 2、常用载体:质粒、噬菌体、病毒DNA >克隆载体( loning vector):用于目的基因的克隆、 扩增、序列分析和体外定点突变等 >表达载体( Expression vector):用于在宿主细胞中表达 外源目的基因,获得大量表达产物 、“切”:限制性內切酶切割目的基因和载体 ￥A“接”:重组体的构建 四、“转”:重组DNA分子导入受体细胞 、转化( transformation):将质粒或其它外源 DNA导入宿主细胞常用大肠杆菌),并使其获得新的 表型的过程
刘新文，重组DNA技术 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA Ø克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、 扩增、序列分析和体外定点突变等 Ø表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达 外源目的基因，获得大量表达产物 二、 “切” ：限制性内切酶切割目的基因和载体 D三N、A“接” ：重组体的构建 四、 “转” ：重组DNA分子导入受体细胞 1、转化（transformation）：将质粒或其它外源 DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的 表型的过程
刘新文,重组DNA技术 2、转染( transfection):将外源DNA导入真核细胞 的过程 3、感染( transfection):以λ噬菌体、柯斯质粒和 病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具 有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的 细胞,并在细胞内扩增。也称为转导( transduction) 五、“筛”:筛选出含重组DNA的受体细胞γ 1、直接选择法:遗传标记【抗药性标志选择、营 养缺陷型的互补筛选法及分子标记(PCR、分子杂 交)】 2、非直接选择法:免疫化学法、酶联免疫检测法
刘新文，重组DNA技术 2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞 的过程 3、感染（transfection）：以l噬菌体、柯斯质粒和 病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具 有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的 细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction） 五、 “筛” ：筛选出含重组DNA的受体细胞 1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营 养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂 交）】 2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法
刘新文,重组DNA技术 、“表达”:使克隆基因在宿主细胞中复制、表 连、外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶 性的包涵体 2、真核表达体系:酵母、昆虫及哺乳动物细胞等
刘新文，重组DNA技术 六、 “表达” ：使克隆基因在宿主细胞中复制、表 达1、外源基因在原核细胞的表达 Ø大肠杆菌是最常用的原核表达体系 Ø真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶 性的包涵体 2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等