第四章分子生物学常用技术
第四章 分子生物学常用技术
I.核畯分子杂交(DNA/ dnA or dna/RNA)技术 核酸分子杂交技术。是在1968年由华盛顿卡内基 学院( Cavnegie Institute of Washington)的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是,带有互补 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA.当它们混合在 起时,其相应的同源区段将会退火形成双筵的结构
Ⅰ.核酸分子杂交（DNA/DNA or DNA/RNA）技术 核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基 学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。所依据的原理是，带有互补 的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一 起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构
萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理,使在电泳凝胶中分离的DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过同标记的单链DNA 或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段。这种实验 方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E. Southern于1975年 首先设计出来的,故又叫 Southern dna印迹转移技术
1、萨瑟恩DNA印迹杂交 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA 片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA 或 RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验 方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年 首先设计出来的，故又叫Southern DNA 印迹转移技术
(a) DNA限制片段 含有EBr染料 的琼脂糖凝胶 Southern凝(b 基因组DNA 标准分子量DNA 胶转移条交 重物 技术 玻璃板 吸引滤组 凝胶 一高盐缓冲液 (d)硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的 基因DNA片段 (e) X光底片
（a） （b） （c） （d） （e） 基因组DNA DNA限制片段 硝酸纤维素滤膜 同探针同源杂交的 基因DNA片段 X光底片 Southern 凝 胶转移杂交 技术
A B( D E F GH-I JK I 5.0 = Southern dna印迹杂交之X光显像图片 水稻( Oryza sativa l)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶Bg(A C)、BamI(D-F)、 ECoR I(G-I)、和HindⅢ(J-L)消化,加样在 含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离,然后同32P标记的玉 米psbA探针作 Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带,表明含有水 稻的psbA基因序列
Southern DNA 印迹杂交之X光显像图片 水稻（Oryza sativa L.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(AC)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在 含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉 米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水 稻的psbA基因序列
2、诺赛恩RNA印迹技术( Northern blotting) 1979年,J.C. Alwine等人发展而来,是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜威其他化斝修伽的活性滤纸上。进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术( Northern blotting) 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上,然后 同放射性同位素125标记的特定蛋白质之抗体进行反应,这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术( Western blotting)
2、诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting） 1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝 胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交 技术十分类似，所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。 而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后 同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技 术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）
3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交( dot blotting)和狭线印迹杂交 ( slot blotting)是在 Southern印迹条交的基础上 发展的量种类式的快速检测特定核酸(DNA和RNA)分 子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了 特殊设计的加样装置,使众多待测样品能够一次同步 转移到杂交滤膜上,并有规律地排列成点阵或线阵。 这两项技术更适疝与核酸样品的定量检测
3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交 （slot blotting ）是在Southern印迹杂交的基础上 发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分 子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了 特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步 转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。 这两项技术更适应与核酸样品的定量检测
4、菌落杂交 保留 盘 生长着转化菌落的平板 硝酸纤维素滤膜 平板 (b) 合 溶菌碱变性酸中和洗去细胞碎片 置于溶菌液中的滤膜 桃取阳性菌落 (d) 放射自显影 显示阳性菌落斑点的X光底片 具DNA印迹的滤膜 检测重组体克隆的菌落杂交技术
检测重组体克隆的菌落杂交技术 4、菌落杂交
核酸杂交常用几种膜的 性能比较 类型 优点 缺点 硝酸纤维素滤膜 结合 SsDNA、RNA和蛋白质的能力为 易碎、易皱缩;不能同DNA共价结合, 80~100g/cm2;价廉;可用于微量制备 因此再使用能力有限;在10×SSC缓冲液中 结合能力下降;要用特殊的程序才能结合 RNA或小片段DNA DBM/DPT滤纸 结合 ssDNA、RNA和蛋白质的能力为 杂交作用没有硝酸纤维素滤膜有效;需 20~40g/cm2;能同核酸及蛋白质分子共价要化学激活;时间、温度和pH值等因素不 稳定地结合;可以用不同的探针进行成功的稳定性价格昂贵 检验 DEAE滤纸 结合dDNA、RNA的能力为15g/结合 DNA, RNA的能力有限;易碎 cm2;可定量地回收DNA Nylon(尼龙)滤膜 结合DNA,RNA和蛋白质;检测敏感 有些类型会出现较高的本底 性高;柔性好;抗热抗溶解作用;不需要预浸
核酸杂交常用几种膜的 性能比较
Ⅱ.蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术
Ⅱ. 蛋白质/DNA、蛋白质/RNA杂交技术