生物工程专业核心课程 基因工程 华东理工大学张惠展
生物工程专业核心课程 基 因 工 程 华东理工大学 张惠展
基因工程 1基因工程的基本概念 2基因工程的基本原理 3基因工程所需的基本条件 4基因工程的操作过程 5目的基因的克隆与基因文库的构建 6大肠杆菌基因工程 7酵母基因工程 8哺乳动物基因工程 9高等植物基因工程
基因工程 5 2 3 4 1 6 7 8 9 基因工程的基本概念 基因工程的基本原理 基因工程所需的基本条件 基因工程的操作过程 目的基因的克隆与基因文库的构建 大肠杆菌基因工程 酵母基因工程 哺乳动物基因工程 高等植物基因工程
3基因工程的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 B用于基因克隆的载体 C用于基因转移的受体菌或细胞
3 基因工程的基本条件 C 用于基因转移的受体菌或细胞 B 用于基因克隆的载体 A 用于核酸操作的工具酶
3基因工程的基本条件 A用于核酸操作的工具酶 狠制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 ●核酸酶 核酸修饰酶
A 用于核酸操作的工具酶 3 基因工程的基本条件 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列,并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中,帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsdR:编码限制性核酸內切酶 hsdM:编码限制性甲基化酶 hsdS:编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年, Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind‖和HindⅢ
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出 Hind II和Hind III
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 1型 Ⅱ塑 Ⅲ型 限制修饰 多功能 单功 双功能 蛋白结构异源三聚体源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2SAM Maz+ ATP Mg2+ SAM 识别序列 TGAN.TGCT旋转对称序列 GAGCC AACNGGTGC CAGCAG 切割位点距识别序列1kb处识别序列内或附近距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的类型 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 多功能 单功能 双功能 蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体 辅助因子 ATP Mg2+ SAM ATP Mg Mg2+ 2+ SAM 识别序列 TGAN8TGCT 旋转对称序列 GAGCC AACN6GTGC CAGCAG 切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游 随机性切割 特异性切割 24-26bp处
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名株名 Haemophilus influenzae d嗜血流感杆菌d株 Hindle hinoⅢ 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 ECOR I的切割位点 EcoR的识别序列 5‘∴ GCTGAATTCGAG C GACTTAAGCTC 5
限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列
EcoR等产生的5‘粘性末 端 5 G-C-T-G-A-A--T-C-G-A-G 3..C-GAC-TTA-A-G-C-T-C 5 EcoR|37℃ 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3….cGAC-T-TA=A=P OH-G-CTC∴.5 退火4-7℃ OH P 5 G-C-TGA-A-T--C-G-A-G 3“∴.cGAC-T- T-A-AG-C-T-C.5 P OH
EcoRI等产生的5‘粘性末 端 5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’ EcoRI 37 ℃ 5‘ … G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ 5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C … 5’ OH P P OH
Pst等产生的3“粘性末端 5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G C-G-A-G-A-C-GHE-C-C-T-C 5 Pst37℃c 5 G-C-T-C--G-C-A-OH P-G-G-A-G 3….cGA-G OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 退火4-7℃ OH P 5∴GcTC-G-C- AG-G-A-G 3.C-GAGA-C-G-T-C-C-T-C 53
PstI等产生的3‘粘性末端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ PstI 37 ℃ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ 退火 4-7 ℃ 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G … 3’ 3‘ … C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ OH P P OH