5.亲和纯化 生物亲和作用 亲和色谱 膜亲和过滤法 亲和双水相萃取 冷亲和反胶团萃取 冷亲和沉淀 冷磁性亲和分离
5. 亲和纯化 ❖ 生物亲和作用 ❖ 亲和色谱 ❖ 膜亲和过滤法 ❖ 亲和双水相萃取 ❖ 亲和反胶团萃取 ❖ 亲和沉淀 ❖ 磁性亲和分离
5.1生物亲和作用 生物亲和作用的本质 冷影响亲和作用的因素 冷亲和作用体系
5.1 生物亲和作用 ❖ 生物亲和作用的本质 ❖ 影响亲和作用的因素 ❖ 亲和作用体系
5.1.1生物亲和作用的本质 ☆生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲 和作用( bioaffinity)或简称亲和作用 (affinity) 々利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化 (affinity purification) 冷亲和作用的分子(物质)对可以是:大分子 小分子,大分子-大分子,大分子-细胞,细胞 细胞
5.1.1 生物亲和作用的本质 ❖ 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲 和 作 用 （ bioaffinity ） 或 简 称 亲 和 作 用 （affinity）。 ❖ 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化 （affinity purification）。 ❖ 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子- 小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞- 细胞
☆具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和 “锁孔”的空间结构关系。 冷亲和结合作用,至少存在3个对应官能团相结合 静电作用 ys, Arg, His Gh 冷氢键 er Thr, Gin, Agn eu. Ile 疏水相互作用 Met pro Phe, Tyr, Trp 配位键 冷弱共价键 Me 图5-1蛋白质的结合部位及各种结合作用力
❖ 具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和 “锁孔” 的空间结构关系。 ❖ 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： ❖ 静电作用 ❖ 氢键 ❖ 疏水相互作用 ❖ 配位键 ❖ 弱共价键 图5-1 蛋白质的结合部位及各种结合作用力
5.1.2影响亲和作用的因素 1.离子强度 φ离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互 作用等。 2. pH 冷-羧基的pK=34~38 冷β羧基的pK2=39~40 冷-氨基的pK=74~7.5 冷E氦基的pK=100~10.4
5.1.2 影响亲和作用的因素 1. 离子强度 ❖ 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互 作用等。 2. pH ❖ -羧基的pKa ＝3.4～3.8 ❖ -羧基的pKa ＝3.9～4.0 ❖ -氨基的pKb ＝7.4～7.5 ❖ -氨基的pKb ＝10.0～10.4
3.抑制氢键形成的物质 冷脲和盐酸胍( guanidinohydrochloric acid) 的存在可抑制氢键的形成。 4.温度 ☆温度升高,静电作用、氢键及金属配位键减 弱;疏水性相互作用增强 5.离液离子 冷在SCN,|和CO4-等离液阴离子存在下, 疏水相互作用降低。 6.螯合剂
3. 抑制氢键形成的物质 ❖ 脲和盐酸胍（guanidinohydrochloric acid） 的存在可抑制氢键的形成。 4. 温度 ❖ 温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减 弱；疏水性相互作用增强 。 5. 离液离子 ❖ 在SCN－，I－和ClO4 －等离液阴离子存在下， 疏水相互作用降低。 6. 螯合剂
51.3亲和作用体系 冷将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联, 可特异性结合另一种分子(目标产物),使其 从混合物中高选择性地分离纯化。 冷一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基( ligand),用L表示。 E+LE·I Ka=ELL K=E E][L] 冷K越大,亲和结合作用越强。K。一般为104 103L/mo,最高可达到1015Lmol
5.1.3 亲和作用体系 ❖ 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其 从混合物中高选择性地分离纯化。 ❖ 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基（ligand），用L表示。 ❖ Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～ 108 L/mol，最高可达到1015 L/mol
表5-1常用的亲和作用体系 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原--单克隆抗体 荷尔蒙--受体蛋白 核酸-互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶-底物、产物、抑制剂 群特异性免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白 酶-:辅酶 凝集素--糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质--肝素 酶、蛋白质-活性色素(染料) 酶、蛋白质-过度金属离子 酶、蛋白质-氨基酸(组氨酸等)
表5-1 常用的亲和作用体系 特异性 亲和作用体系 高特异性 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 群特异性 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）
52亲和色谱 亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高
5.2 亲和色谱 ❖ 亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 ❖ 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高
52.1亲和色谱填料 ☆亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的, 需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子,制备所需的亲和吸附介质。 冷少数特殊情况如 Sephadex凝胶可亲和吸附伴 刀豆球蛋白A(一种植物凝集素) 冷在利用亲和色谱技术纯化目标产物时,商品化 的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的 需要,有必要自制亲和吸附介质
5.2.1 亲和色谱填料 ❖ 亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的， 需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 ❖ 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴 刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。 ❖ 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化 的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的 需要，有必要自制亲和吸附介质
