第八章酶的应用 ◆酶的应用是酶工程的主要内容之一。 1、酶在医药方面的应用 酶在医药方面的应用多种多样,可归纳为下列3个方面 (1)用酶进行疾病的诊断 (2)用酶进行疾病的治疗 (3)用酶制造各种药物 1酶在疾病诊断方面的应用 (1)根据体内酶活力的变化诊断疾病 表9-1通过酶活力变化进行疾病诊断 疾病与酶活力变化 胰脏疾病,肾脏疾病时升高;肝病时下降 胆碱酯酶 肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等,活力下降 酸性磷酸酶 前列腺癌、肝炎、红血球病变时,活力升高 碱性磷酸酶 佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时,活力升高;软骨发育不全等,活 力下降 谷丙转氨酶 肝病、心肌梗塞等,活力升高 谷草转氨酶 肝病、心肌梗塞等,活力升高 y谷氨酰转肽酶(y原发性和继发性肝癌,活力增高至200单位以上,阻塞性黄疽、肝硬化、胆道癌 等,血清中酶活力升高 醛縮酶 急性传染性肝炎、心肌梗塞,血清中酶活力显著升高 精氨酰琥珀酸裂解酶|急、慢性肝炎,血清中酶活力增高 胃癌,活力升高;十二指肠溃疡,活力下降 磷酸葡糖变位酶 肝炎、癌症,活力升高 β-葡萄糖醛缩酶 肾癌及膀胱癌,活力升高 碳酸酐酶 坏血病、贫血等,活力升高 乳酸脱氢酶 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞,活力显著升高;肝硬化,活力正常 癌细胞中含有端粒酶,正常体细胞内没有端粒酶活性 山梨醇脱氢酶(SDH)急性肝炎,活力显著提高 -核苷酸酶 阻塞性黄疸、肝癌,活力显著增髙 急性胰腺炎,活力明显增高,胰腺癌、胆管炎患者,活力升高 肌酸磷酸激酶(CK)|心肌梗塞,活力显著升高;肌炎、肌肉创伤,活力升高 a-羟基丁酸脱氢酶心肌梗塞、心肌炎,活力增高 单胺氧化酶(MAO)|肝脏纤维化、糖尿病、甲状腺机能亢进,活力升高
1 第八章 酶的应用 ◆酶的应用是酶工程的主要内容之一。 1、酶在医药方面的应用 酶在医药方面的应用多种多样，可归纳为下列 3 个方面： （1） 用酶进行疾病的诊断 （2） 用酶进行疾病的治疗 （3） 用酶制造各种药物 1.1 酶在疾病诊断方面的应用 (1)根据体内酶活力的变化诊断疾病： 表 9-1 通过酶活力变化进行疾病诊断 酶 疾病与酶活力变化 淀粉酶 胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降 胆碱酯酶 肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降 酸性磷酸酶 前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高 碱性磷酸酶 佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活 力下降 谷丙转氨酶 肝病、心肌梗塞等，活力升高 谷草转氨酶 肝病、心肌梗塞等，活力升高 γ-谷氨酰转肽酶 （γ -GT） 原发性和继发性肝癌，活力增高至 200 单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌 等，血清中酶活力升高 醛縮酶 急性传染性肝炎、心肌梗塞，血清中酶活力显著升高 精氨酰琥珀酸裂解酶 急、慢性肝炎，血清中酶活力增高 胃蛋白酶 胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降 磷酸葡糖变位酶 肝炎、癌症，活力升高 β-葡萄糖醛缩酶 肾癌及膀胱癌，活力升高 碳酸酐酶 坏血病、贫血等，活力升高 乳酸脱氢酶 肝癌、急性肝炎、心肌梗塞，活力显著升高；肝硬化，活力正常 端粒酶 癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性 山梨醇脱氢酶（SDH） 急性肝炎，活力显著提高 5’-核苷酸酶 阻塞性黄疸、肝癌，活力显著增高 脂肪酶 急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌、胆管炎患者，活力升高 肌酸磷酸激酶（CK） 心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高 α－羟基丁酸脱氢酶 心肌梗塞、心肌炎，活力增高 单胺氧化酶（MAO） 肝脏纤维化、糖尿病、甲状腺机能亢进，活力升高
磷酸己糖异构酶急性肝炎,活力极度升高;心肌梗塞、急性肾炎,脑溢血,活力明显升高 鸟氨酸氨基甲酰转移|急性肝炎,活力急速增高;肝癌,活力明显升高 酶 乳酸脱氢酶同工酶心肌梗塞、恶性贫血,LDH1增高;白血病、肌肉菱缩,LDH增高;白血病、淋巴 肉瘤、肺癌,LDH增高;转移性肝癌、结肠癌,LDH4増髙;肝炎、原发性肝癌、 脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折,LDHs5增高 葡萄糖氧化酶 测定血糖含量,诊断糖尿病 亮氨酸氨肽酶(LAP)肝癌、阴道癌、阻塞性黄疽,活力明显升高 (2)用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病 表9-2用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断 酶 测定的物质 用 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 测定血糖、尿糖,诊断糖尿病 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶丨葡萄糖 测定血糖、尿糖,诊断糖尿病 尿素酶 尿素 测定血液、尿液中尿素的量, 诊断肝脏、肾脏病变 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺 测定脑脊液中谷氨酰胺的量 诊断肝昏迷、肝硬化 胆固醇氧化酶 胆固醇 测定胆固醇含量,诊断高血脂等 DNA聚合酶 通过基因扩增,基因测序, 诊断基因变异、检测癌基因 12酶在疾病治疗方面的应用 表9-3酶在疾病治疗方面的应用 酶 用 微生物治疗消化不良,食欲不振 植物、微生物治疗消化不良,食欲不振,消炎,消肿,除去坏死组织, 促进创伤愈合,降低血压 胰脏、微生物 治疗消化不良,食欲不振 纤维素酶 霉菌 疗消化不良,食欲不振 溶菌酶 蛋清、细菌 疗各种细菌性和病毒性疾病 激酶 治疗心肌梗塞,结膜下出血,黄斑部出血 链球菌 治疗血栓性静脉炎,咳痰,血肿,下出血,骨折,外伤 链球菌 疗炎症,血管栓塞,清洁外伤创面 青霉素酶 蜡状芽孢杆菌 疗青霉素引起的变态反应 L-天冬酰胺酶 大肠杆菌 治疗白血病 超氧化物歧化酶微生物植物动物血液、预防辐射损伤,治疗红斑狼疮,皮肌炎,结肠炎,氧中毒 肝脏等 动物,蛇,细菌,酵母等治疗各种出血病
2 磷酸己糖异构酶 急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞、急性肾炎，脑溢血，活力明显升高 鸟氨酸氨基甲酰转移 酶 急性肝炎，活力急速增高；肝癌，活力明显升高 乳酸脱氢酶同工酶 心肌梗塞、恶性贫血，LDH1 增高；白血病、肌肉萎缩，LDH2 增高；白血病、淋巴 肉瘤、肺癌，LDH3 增高；转移性肝癌、结肠癌，LDH4 增高；肝炎、原发性肝癌、 脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折，LDH5 增高 葡萄糖氧化酶 测定血糖含量，诊断糖尿病 亮氨酸氨肽酶（LAP） 肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高 (2)用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病： 表 9-2 用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断 酶 测定的物质 用 途 葡萄糖氧化酶 葡萄糖 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 葡萄糖氧化酶+过氧化物酶 葡萄糖 测定血糖、尿糖，诊断糖尿病 尿素酶 尿素 测定血液、尿液中尿素的量， 诊断肝脏、肾脏病变 谷氨酰胺酶 谷氨酰胺 测定脑脊液中谷氨酰胺的量， 诊断肝昏迷、肝硬化 胆固醇氧化酶 胆固醇 测定胆固醇含量，诊断高血脂等 DNA 聚合酶 基因 通过基因扩增，基因测序， 诊断基因变异、检测癌基因 1.2 酶在疾病治疗方面的应用 表 9-3 酶在疾病治疗方面的应用 酶 名 来 源 用 途 淀粉酶 胰脏、麦芽、微生物 治疗消化不良，食欲不振 蛋白酶 胰脏、胃、植物、微生物 治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织， 促进创伤愈合，降低血压 脂肪酶 胰脏、微生物 治疗消化不良，食欲不振 纤维素酶 霉菌 治疗消化不良，食欲不振 溶菌酶 蛋清、细菌 治疗各种细菌性和病毒性疾病 尿激酶 人尿 治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血 链激酶 链球菌 治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折，外伤 链道酶 链球菌 治疗炎症，血管栓塞，清洁外伤创面 青霉素酶 蜡状芽孢杆菌 治疗青霉素引起的变态反应 L-天冬酰胺酶 大肠杆菌 治疗白血病 超氧化物歧化酶 微生物，植物，动物血液、 肝脏等 预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎，氧中毒 凝血酶 动物，蛇，细菌，酵母等 治疗各种出血病
分解胶原,消炎,化脓,脱痂,治疗溃疡 右旋糖酐酶 预防龋齿 胆碱酯酶 疗皮肤病,支气管炎,气喘 溶血栓 弹性蛋白酶 胰脏 台疗动脉硬化,降血脂 核糖核酸酶 胰脏 抗感染,祛痰,治肝癌 疗痛风 L精氨酸酶 L-组氨酸酶 微生物 抗癌 L-蛋氨酸酶 微生物 抗癌 谷氨酰胺酶 微生物 抗癌 a-半乳糖苷酶牛肝,人胎盘 治疗遗传缺陷病(弗勃莱症) 核酸类酶 生物,人工改造 基因治疗,治疗病毒性疾病 R冬4 蛇毒 木瓜凝乳蛋白酶番木瓜 疗腰间盘突出,肿瘤辅助治疗 抗体酶 分子修饰,诱导 与特异抗原反应,清除各种致病性抗原 (3)酶在药物制造方面的应用 表9-4酶在药物制造方面的应用 主要来源 用途 青霉素酰化酶 微生物 制造半合成青霉素和头孢菌素 11β-羟化酶 霉菌 制造氢化可的松 L酪氨酸转氨酶 细菌 制造多巴(L二羟苯丙氨酸) β酪氨酸酶 植物 制造多巴 α-甘露糖苷酶 链霉菌 制造高效链霉素 核苷磷酸化酶 生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷(阿糖腺 苷) 酰基氨基酸水解酶 微生物 生产L氨基酸 5′-磷酸二酯酶 桔青霉等微生物 生产各种核苷酸 微生物 生产聚肌胞,聚肌苷酸 无色杆菌蛋白酶 由猪胰岛素(Aa-30)转变为人胰 岛素(Thr-30) 核糖核酸酶 生产核苷酸 蛋白酶 动物、植物、微生物生产L氨基酸 β-葡萄糖苷酶 黑曲霉等微生物 生产人参皂甙Rh
3 胶原酶 细菌 分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡 右旋糖酐酶 微生物 预防龋齿 胆碱酯酶 细菌 治疗皮肤病，支气管炎，气喘 溶纤酶 蚯蚓 溶血栓 弹性蛋白酶 胰脏 治疗动脉硬化，降血脂 核糖核酸酶 胰脏 抗感染，祛痰，治肝癌 尿酸酶 牛肾 治疗痛风 L-精氨酸酶 微生物 抗癌 L-组氨酸酶 微生物 抗癌 L-蛋氨酸酶 微生物 抗癌 谷氨酰胺酶 微生物 抗癌 α-半乳糖苷酶 牛肝，人胎盘 治疗遗传缺陷病（弗勃莱症） 核酸类酶 生物，人工改造 基因治疗，治疗病毒性疾病 降纤酶 蛇毒 溶血栓 木瓜凝乳蛋白酶 番木瓜 治疗腰间盘突出，肿瘤辅助治疗 抗体酶 分子修饰，诱导 与特异抗原反应，清除各种致病性抗原 (3)酶在药物制造方面的应用 表 9-4 酶在药物制造方面的应用 酶 主要来源 用途 青霉素酰化酶 微生物 制造半合成青霉素和头孢菌素 11-β-羟化酶 霉菌 制造氢化可的松 L-酪氨酸转氨酶 细菌 制造多巴（L-二羟苯丙氨酸） β-酪氨酸酶 植物 制造多巴 α-甘露糖苷酶 链霉菌 制造高效链霉素 核苷磷酸化酶 微生物 生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺 苷） 酰基氨基酸水解酶 微生物 生产 L-氨基酸 5’-磷酸二酯酶 桔青霉等微生物 生产各种核苷酸 多核苷酸磷酸化酶 微生物 生产聚肌胞，聚肌苷酸 无色杆菌蛋白酶 细菌 由猪胰岛素（Ala-30）转变为人胰 岛素（Thr-30） 核糖核酸酶 微生物 生产核苷酸 蛋白酶 动物、植物、微生物 生产 L-氨基酸 β-葡萄糖苷酶 黑曲霉等微生物 生产人参皂甙-Rh2
2酶在食品方面的应用 表9-1酶在食品工业中的应用 名 来源 主要用途 α-淀粉酶枯草杆菌、米曲霉、黑曲淀粉液化,制造糊精、葡萄糖、饴糖、果葡糖 β-淀粉酶麦芽巨大芽孢杆菌、|制造麦芽,啤酒酸造 多粘芽孢杆菌 糖化酶 根霉、黑曲霉、红曲霉、淀粉糖化,制造葡萄糖、果葡糖 内孢霉 异淀粉酶 气杄菌、假单胞杄菌制造直链淀粉、麦芽糖 蛋白酶 胰脏、木瓜、枯草杆菌、啤酒澄清,水解蛋白、多肽、氨基酸 霉菌 右旋糖酐酶 霉菌 糖果生产 果胶酶 霉菌 果汁、果酒的澄清 葡萄糖异构酶|放线菌、细菌 制造果葡糖、果糖 葡萄糖氧化酽 黑曲霉、青霉 蛋白加工、食品保鲜 柑苷酶 黑曲霉 水果加工,去除桔汁苦味 橙皮苷酶 黑曲霉 防止柑桔罐头及桔汁出现浑浊 氨基酰化酶霉菌、细菌 由DL-氨基酸生产L-氨基酸 天冬氨酸酶大肠杆菌、假单胞杆菌 由反丁烯二酸制造天冬氨酸 磷酸二酯酶 桔青霉、米曲霉 降解RNA生产单核苷酸用作食品增味剂 色氨酸合成酶细菌 生产色氨酸 核苷磷酸化 酵母 生产ATP 纤维素酶 木霉、青霉 生产葡萄糖 溶菌酶 蛋清,微生物 食品杀菌保鲜 3酶在轻工、化工方面的应用 ◆酶在轻工业和化学工业方面有多种用途。概括起来主要有3个方面的用途。(1)用酶进行原 料处理,(2)用酶生产各种轻工、化工产品,(3)用酶增强产品的使用效果。现简单介绍如下 31酶在原料处理方面的应用 许多轻工原料在应用或加工之前都需要经过原料处理。其中有不少原料可以用酶进行处理 以缩短原料处理时间,増强处理效果,提高产品质量,改善劳动条件,减轻劳动强度等, (1)发酵原料的处理 (2纺织原料的处理
4 2.酶在食品方面的应用 表 9－1 酶在食品工业中的应用 酶 名 来 源 主 要 用 途 α–淀粉酶 枯草杆菌、米曲霉、黑曲 霉 淀粉液化，制造糊精、葡萄糖、饴糖、果葡糖 浆， β–淀粉酶 麦芽、巨大芽孢杆菌、 多粘芽孢杆菌 制造麦芽，啤酒酿造 糖化酶 根霉、黑曲霉、红曲霉、 内孢霉 淀粉糖化，制造葡萄糖、果葡糖 异淀粉酶 气杆菌、假单胞杆菌 制造直链淀粉、麦芽糖 蛋白酶 胰脏、木瓜、枯草杆菌、 霉菌 啤酒澄清，水解蛋白、多肽、氨基酸 右旋糖酐酶 霉菌 糖果生产 果胶酶 霉菌 果汁、果酒的澄清 葡萄糖异构酶 放线菌、细菌 制造果葡糖、果糖 葡萄糖氧化酶 黑曲霉、青霉 蛋白加工、食品保鲜 柑苷酶 黑曲霉 水果加工，去除桔汁苦味 橙皮苷酶 黑曲霉 防止柑桔罐头及桔汁出现浑浊 氨基酰化酶 霉菌、细菌 由 DL–氨基酸生产 L–氨基酸 天冬氨酸酶 大肠杆菌、假单胞杆菌 由反丁烯二酸制造天冬氨酸 磷酸二酯酶 桔青霉、米曲霉 降解 RNA，生产单核苷酸用作食品增味剂 色氨酸合成酶 细菌 生产色氨酸 核苷磷酸化酶 酵母 生产 ATP 纤维素酶 木霉、青霉 生产葡萄糖 溶菌酶 蛋清，微生物 食品杀菌保鲜 3.酶在轻工、化工方面的应用 ◆酶在轻工业和化学工业方面有多种用途。概括起来主要有 3 个方面的用途。（1）用酶进行原 料处理，（2）用酶生产各种轻工、化工产品，（3）用酶增强产品的使用效果。现简单介绍如下： 3.1 酶在原料处理方面的应用 许多轻工原料在应用或加工之前都需要经过原料处理。其中有不少原料可以用酶进行处理， 以缩短原料处理时间，增强处理效果，提高产品质量，改善劳动条件，减轻劳动强度等， (1)发酵原料的处理： (2)纺织原料的处理：
(3)制浆、造纸原料的处理: (4)生丝的脱胶处理 5)羊毛的除垢处理 (6)皮革的脱毛处理 (刁)烟草原料的处理 (8)甜菜糖蜜的处理 32酶在轻工、化工产品制造方面的应用 利用酶的催化作用可将原料转变为所需的轻工、化工产品,也可利用酶的催化作用除去某 些不需要的物质而得到所需的产品。 (1)酶法生产L-氨基酸 利用酶或固定化酶的催化作用,可以将各种底物转化为L-氨基酸,或将DL氨基酸拆分 而生产L-氨基酸。 (2)酶法生产有机酸 各种有机酸是一类有重要应用价值的轻工、化工产品。通过酶的催化作用可以生产各种有 机酸 (3)酶法制造化工原料: 化工原料的生产通常采用化学合成法,需要在高温高压的条件下进行反应。对设备的要求 高,投资大,甚至造成环境污染。如果采用酶催化,则由于酶具有作用条件温和等显著特点, 所以可以在常温常压的条件下生产许多化工原料,从而减少设备投资,降低生产成本。例如, 腈水合酶可以催化腈类化合物加水,合成丙烯酰胺,烟酰胺,5-腈基苯戊胺等重要的化工原料 33加酶增强产品的使用效果 在某些轻工产品中添加一定量的酶,可以显著地增强产品的使用效果。现举例如下 1)加酶洗涤剂 (2加酶牙膏、牙粉和漱口水: (3)加酶饲料 (4)加酶护肤用品 4.酶在环境保护方面的应用 41酶在环境监测方面的应用 (1)利用胆碱酯酶检测有机磷农药污染 (2)利用乳酸脱氢酶的同工酶监测重金属污染: (3)通过β-葡聚糖苷酸酶监测大肠杆菌污染 (4利用亚硝酸还原酶检测水中亚硝酸盐浓度 42酶在废水处理方面的应用 ◆不同的废水,含有各种不同的物质,要根据所含物质的不同,采用不同的酶进行处理 ◆有的废水中含有淀粉、蛋白质、脂肪等各种有机物质,可以在有氧和无氧的条件下用微生物处
5 (3)制浆、造纸原料的处理： (4)生丝的脱胶处理： (5)羊毛的除垢处理： (6)皮革的脱毛处理： (7)烟草原料的处理： (8)甜菜糖蜜的处理： 3.2 酶在轻工、化工产品制造方面的应用 利用酶的催化作用可将原料转变为所需的轻工、化工产品，也可利用酶的催化作用除去某 些不需要的物质而得到所需的产品。 (1)酶法生产 L–氨基酸： 利用酶或固定化酶的催化作用，可以将各种底物转化为 L–氨基酸，或将 DL-氨基酸拆分 而生产 L–氨基酸。 (2) 酶法生产有机酸： 各种有机酸是一类有重要应用价值的轻工、化工产品。通过酶的催化作用可以生产各种有 机酸。 (3) 酶法制造化工原料： 化工原料的生产通常采用化学合成法，需要在高温高压的条件下进行反应。对设备的要求 高，投资大，甚至造成环境污染。如果采用酶催化，则由于酶具有作用条件温和等显著特点， 所以可以在常温常压的条件下生产许多化工原料，从而减少设备投资，降低生产成本。例如， 腈水合酶可以催化腈类化合物加水，合成丙烯酰胺，烟酰胺，5-腈基苯戊胺等重要的化工原料。 3.3 加酶增强产品的使用效果 在某些轻工产品中添加一定量的酶，可以显著地增强产品的使用效果。现举例如下： (1)加酶洗涤剂： (2)加酶牙膏、牙粉和漱口水： (3)加酶饲料： (4)加酶护肤用品： 4. 酶在环境保护方面的应用 4.1 酶在环境监测方面的应用： (1)利用胆碱酯酶检测有机磷农药污染： (2)利用乳酸脱氢酶的同工酶监测重金属污染： (3)通过β-葡聚糖苷酸酶监测大肠杆菌污染： (4)利用亚硝酸还原酶检测水中亚硝酸盐浓度： 4.2 酶在废水处理方面的应用： ◆不同的废水，含有各种不同的物质，要根据所含物质的不同，采用不同的酶进行处理。 ◆有的废水中含有淀粉、蛋白质、脂肪等各种有机物质，可以在有氧和无氧的条件下用微生物处
理,也可以通过固定化淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等进行处理。 ◆冶金工业产生的含酚废水,可以采用固定化酚氧化酶进行处理 ◆含有硝酸盐、亚硝酸盐的地下水或废水,可以采用固定化硝酸还原酶( nitrate reductase, EC1.7994)亚硝酸还原酶( nitrite reductase,EC1.7.99.3)和氧化一氮还原酶( nitric- oxide reductase,EC1.7.99.2)进行处理。使硝酸根、亚硝酸根逐步还原,最终成为氮气。其反应过 硝酸还原酶 HNO3+还原型受体== =HNO2+受体 亚硝酸还原酶 HNO2+还原型受体三==============NO+H2O+受体 氧化一氮还原酶 2NO+还原型受体三==============N2+受体 4.3酶在可生物降解材料开发方面的应用 利用酶在有机介质中的催化作用合成的可生物降解材料主要有:利用脂肪酶的有机介质催 化合成聚酯类物质、聚糖酯类物质;利用蛋白酶或脂肪酶合成多肽类或聚酰胺类物质等。 酶在生物技术方面的应用 ◆主要包括:酶在除去细胞壁方面的应用,酶在大分子切割方面的应用以及酶在大分子连 接方面的应用。 51酶在除去细胞壁方面的应用 ◆在生物工程方面,很多时候都需要除去细胞壁 (1)胞内物质的提取 (2)原生质体的制备 52酶在大分子切割方面的应用 (1)限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶是一类在特定的位点上,催化双链DNA水解的磷酸二酯酶。 至今为止已发现的核酸内切酶有300多种,已成为基因工程中必不可缺的常用工具酶 限制性核酸内切酶具有高度的专—性。表现在它能够识别双链DNA中的某段碱基的排列 顺序,并且只能在某个特定位点上将DNA分子切开。 表8-5一些限制性核酸内切酶的来源与作用位点 酶 识别序列与作用位点5′-3′ 来 Alu I AG↓CT Arthrobacter luteus
6 理，也可以通过固定化淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等进行处理。 ◆冶金工业产生的含酚废水，可以采用固定化酚氧化酶进行处理。 ◆含有硝酸盐、亚硝酸盐的地下水或废水，可以采用固定化硝酸还原酶（nitrate reductase, EC1.7.99.4）、亚硝酸还原酶( nitrite reductase , EC1.7.99.3)和氧化一氮还原酶( nitric-oxide reductase, EC1.7.99.2)进行处理。使硝酸根、亚硝酸根逐步还原，最终成为氮气。其反应过 程如下： 硝酸还原酶 HNO3 + 还原型受体 ============== HNO2 + 受体 亚硝酸还原酶 HNO2 + 还原型受体 =============== NO + H2O + 受体 氧化一氮还原酶 2NO + 还原型受体 =============== N2 + 受体 4.3 酶在可生物降解材料开发方面的应用： 利用酶在有机介质中的催化作用合成的可生物降解材料主要有：利用脂肪酶的有机介质催 化合成聚酯类物质、聚糖酯类物质；利用蛋白酶或脂肪酶合成多肽类或聚酰胺类物质等。 5. 酶在生物技术方面的应用 ◆主要包括：酶在除去细胞壁方面的应用，酶在大分子切割方面的应用以及酶在大分子连 接方面的应用。 5.1 酶在除去细胞壁方面的应用 ◆在生物工程方面，很多时候都需要除去细胞壁。 (1)胞内物质的提取 (2)原生质体的制备 5.2 酶在大分子切割方面的应用 (1)限制性核酸内切酶 ◆限制性核酸内切酶是一类在特定的位点上，催化双链 DNA 水解的磷酸二酯酶。 ◆至今为止已发现的核酸内切酶有 300 多种，已成为基因工程中必不可缺的常用工具酶。 ◆限制性核酸内切酶具有高度的专一性。表现在它能够识别双链 DNA 中的某段碱基的排列 顺序，并且只能在某个特定位点上将 DNA 分子切开。 表 8－5 一些限制性核酸内切酶的来源与作用位点 酶 识别序列与作用位点 5′－3′ 来 源 AluⅠ AG↓CT AG↓CT Arthrobacter luteus
C. PyCGPuG Anabaena variabilis G↓ GATCO Bacillus amyloliquefaciens Bgl II A↓ GATCT Bacillu globigi Eco RI G↓ AATTC Escherichia coli Rve 13 HindⅢ A↓ AGCTT iTT↓AAC GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae Pst I CTGCA↓G ncia smarr G↓ TCGAC Streptomyces albus Sma CCC↓GGG Serratia marcen T↓ CTAGA Xho I C↓ TCGAG Xanthomonas holicola (2)DNA外切核酸酶 这是一类从脱氧核糖核酸(DNA)分子末端开始逐个除去末端核苷酸的酶。这些酶中有些 可以从DNA锵的5′-末端开始作用,有些从3′-末端开始作用,有些则可同时作用于5 未端和3′-未端。它们的作用方式如图9-1所示。 3111 图9-1DNA外切核酸酶的作用方式 (3)碱性磷酸酶 碱性磷酸酶可以除去DNA或RNA链中的5′-磷酸。在基因工程中主要用在为防止质粒 DNA的自我环化而除去5-磷酸,或在用32P对DNA或RNA进行5′-末端标记之前除去5′ 磷酸 (4).核酸酶S1 该酶作用于单链DNA或RNA。在基因工程中,用于从具有单链未端的DNA分子中除去 单链部分的核苷酸而变成平整未端的双链DNA在以mRNA为模板合成互补 DNA( CDNA) 时,往往会发生"发夹状”环,用核酸酶S1就可使这些“发夹状环″除去。 5)自我剪切酶 自我剪切酶(Sel; cleavage ribozyme)是一类催化本身RNA分子进行剪切反应的核酸 类酶。具有自我剪切功能的R酶RNA的前体。它可以在一定条件下催化本身RNA进行剪切反
7 C↓PyCGPuG AvaⅠ C↓PyCGPuG Anabaena vayiabilis BamHⅠ G↓GATCC Bacillus amyloliquefaciens Bgl Ⅱ A↓GATCT Bacillu globigii Eco RⅠ G↓AATTC Escherichia coli Rye13 Hae Ⅲ G↓GCC Hacmophilus aegyptius Hind Ⅲ A↓AGCTT Haemophilus influenzae HpaⅠ GTT↓AAC Hacmophilus parainfluenzae KpnⅠ GGTAC↓C Klebsiella pneumoniae PstⅠ CTGCA↓G Providencia stuartii SalⅠ G↓TCGAC Streptomyces albus SmaⅠ CCC↓GGG Serratia marcens XbaⅠ T↓CTAGA Xanthomonas badrii XhoⅠ C↓TCGAG Xanthomonas holicola (2) DNA 外切核酸酶: 这是一类从脱氧核糖核酸（DNA）分子末端开始逐个除去末端核苷酸的酶。这些酶中有些 可以从 DNA 链的 5’﹣末端开始作用，有些从 3’﹣末端开始作用，有些则可同时作用于 5’ ﹣末端和 3’﹣末端。它们的作用方式如图 9－1 所示。 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 图 9-1 DNA 外切核酸酶的作用方式 (3)碱性磷酸酶 碱性磷酸酶可以除去 DNA 或 RNA 链中的 5′﹣磷酸。在基因工程中主要用在为防止质粒 DNA 的自我环化而除去 5′﹣磷酸，或在用 32 P 对 DNA 或 RNA 进行 5′﹣末端标记之前除去 5′ ﹣磷酸。 (4). 核酸酶 S1 该酶作用于单链 DNA 或 RNA。在基因工程中，用于从具有单链末端的 DNA 分子中除去 单链部分的核苷酸，而变成平整末端的双链 DNA。在以 mRNA 为模板，合成互补 DNA（cDNA） 时，往往会发生“发夹状”环，用核酸酶 S1就可使这些“发夹状环”除去。 (5)自我剪切酶： 自我剪切酶（Self-cleavage ribozyme）是一类催化本身 RNA 分子进行剪切反应的核酸 类酶。具有自我剪切功能的 R 酶 RNA 的前体。它可以在一定条件下催化本身 RNA 进行剪切反
应,使RNA前体生成成熟的RNA分子和另一个RNA片断。 1984年,阿比利安( Pinion)发现T4噬菌体RNA前体可以进行自我剪切,将含有215 个核苷酸(nt)的前体剪切成为含139个核苷酸的成熟RNA和另一个76核苷酸的片断 (6)RNA剪切酶 RNA剪切酶是催化其它RNA分子迸行剪切反应的核酸类酶 53酶在分子拼接方面的应用 许多酶都具有分子拼接能力,能将两个或多个分子连接在-起而合成较大的分子。这些 酶类在生物体内是至关重要的,它们催化各种各样的生物合成反应 (1)DNA连接酶 DNA连接酶是1967年发现的能使双链DNA的缺口封闭的酶。它催化DNA片断的 5′-磷酸基与另一DNA片断的3′-OH生成磷酸二酯键。在基因工程中,主要采用的是T4 DNA连接酶,该酶是基因工程中常用的工具酶 (2)DNA聚合酶 DNA聚合酶是一类催化DNA复制和修复DNA分子损伤的酶。主要包括大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ和T4-DNA聚合酶,水栖耐热 菌( Thermus aquaticus)DNA聚合酶( Taq DNA polymerase)等。 DNA聚合酶的共同特点是:(1)需要模板与引物。(2)不能起始新的DNA链的合成。(3) 催化脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3′-OH未端。(4)合成的方向是从5′-末嵽至3′-末端。 ◆PCR技术的基本过程包括:双链DNA的变性、引物与单链DNA退火结合、引物延伸 个步骤(如图9-1所示 5 解链 退火
8 应，使 RNA 前体生成成熟的 RNA 分子和另一个 RNA 片断。 1984 年，阿比利安（Apirion ）发现 T4噬菌体 RNA 前体可以进行自我剪切，将含有 215 个核苷酸（nt）的前体剪切成为含 139 个核苷酸的成熟 RNA 和另一个 76 核苷酸的片断。 (6)RNA 剪切酶 RNA 剪切酶是催化其它 RNA 分子进行剪切反应的核酸类酶。 5.3 酶在分子拼接方面的应用 ◆许多酶都具有分子拼接能力，能将两个或多个分子连接在一起而合成较大的分子。这些 酶类在生物体内是至关重要的，它们催化各种各样的生物合成反应。 (1)DNA 连接酶 DNA 连接酶是 1967 年发现的能使双链 DNA 的缺口封闭的酶。它催化 DNA 片断的 5′﹣磷酸基与另一 DNA 片断的 3′﹣OH 生成磷酸二酯键。在基因工程中，主要采用的是 T4﹣ DNA 连接酶，该酶是基因工程中常用的工具酶。 (2)DNA 聚合酶 DNA 聚合酶是一类催化 DNA 复制和修复 DNA 分子损伤的酶。主要包括大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅱ，大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅲ和 T4﹣DNA 聚合酶，水栖耐热 菌( Thermus aquaticus) DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase）等。 DNA 聚合酶的共同特点是：（1）需要模板与引物。（2）不能起始新的 DNA 链的合成。（3） 催化脱氧核苷三磷酸加到 DNA 链的 3′﹣OH 末端。（4）合成的方向是从 5′﹣末端至 3′﹣末端。 ◆PCR 技术的基本过程包括：双链 DNA 的变性、引物与单链 DNA 退火结合、引物延伸三 个步骤（如图 9-1 所示）。 3’ A 5’ DNA 5’ 3’ B 3’ A 5’ 解链 5’ B 3’ A 3’ 5’ 退火 A’ B’ 5’ 3’ A 3’ 5’
延伸 图9-1PCR的基本过程 (3)末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶( Terminal Deoxynucleotide Transferase,TDT)从小牛胸腺分 离得到。其作用是向DNA的3′-OH末端转移脱氧核苷酸。在基因工程中是利用该酶给DNA 片断加上一段同聚体,形成附加末端。采用32P或者荧光标记的脱氧核苷酸进行3′-末端标记 以便于DNA的分离检测 (4)反转录酶 该酶又称依赖与RNA的DNA聚合酶。它以RNA为模板,以脱氧核苷三磷酸为底物,合 成DNA。 该酶在基因工程中广泛应用于从mRNA反转录生成互补的DNA(CDNA)以获得所需的 基因。现在利用各种反转录酶进行反转录PCR可以简便、快速地获得所需的基因。 (5)蛋白酶 利用蛋白酶进行有机合成的研究非常引人注目,并取得显著成果。 6)脂肪酶和酯酶 脂肪酶和酯酶在水溶液中催化酯类水解成为有机酸和醇,而在非水相介质( nonaqueous media)或微水有机介质( organic media)中却可催化其逆反应,使醇和酸合成酯。 利用这种技术可以在含微量水的有机介质中获得含大量不饱和脂肪酸的油脂以及其他酯 类。有着极其广阔的应用前景。 8)自我剪接酶 自我剪接酶( self-splicing ribozyme)是在一定条件下催化其本身RNA分子同时进行剪 切和连接反应的核酸类酶 自我剪接酶都是RNA前体。根据其结构特点和催化特性的不同,该亚类可分为两个小类。 即含I型ⅣS的R酶和含Ⅱ型ⅣS的R酶。 Ⅰ型ⅣS与四膜虫rRNA前体的间隔序列(ⅣS)结构相似,需要鸟苷(或5-鸟苷酸) 及镁离子(Mg+)参与,才能催化rRNA前体的自我剪接 Ⅱ型ⅣS则与细胞核mRNA前体的ⅣS结构相似,在催化mRNA前体的自我剪接时 需要镁离子参与,但不需要鸟苷或鸟苷酸。 通过自我剪接酶的催化作用,可以将原来由内含子隔开的两个外显子连接在一起,成为成 熟的RNA分子,才能发挥其功用。其催化反应如下式所示 外显子内含子外显子= ===外显子外显子+内含子
9 延伸 A’ B’ 5’ 3’ 图 9-1 PCR 的基本过程 (3)末端脱氧核苷酸转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotide Transferase，TDT）从小牛胸腺分 离得到。其作用是向 DNA 的 3′﹣OH 末端转移脱氧核苷酸。在基因工程中是利用该酶给 DNA 片断加上一段同聚体，形成附加末端。采用 32 P 或者荧光标记的脱氧核苷酸进行 3′﹣末端标记， 以便于 DNA 的分离检测。 (4)反转录酶： 该酶又称依赖与 RNA 的 DNA 聚合酶。它以 RNA 为模板，以脱氧核苷三磷酸为底物，合 成 DNA。 该酶在基因工程中广泛应用于从 mRNA 反转录生成互补的 DNA（cDNA）。以获得所需的 基因。现在利用各种反转录酶进行反转录 PCR, 可以简便、快速地获得所需的基因。 (5) 蛋白酶： 利用蛋白酶进行有机合成的研究非常引人注目，并取得显著成果。 (6)脂肪酶和酯酶 脂肪酶和酯酶在水溶液中催化酯类水解成为有机酸和醇，而在非水相介质（nonaqueous media）或微水有机介质（organic media）中却可催化其逆反应，使醇和酸合成酯。 利用这种技术可以在含微量水的有机介质中获得含大量不饱和脂肪酸的油脂以及其他酯 类。有着极其广阔的应用前景。 (8) 自我剪接酶： 自我剪接酶（self-splicing ribozyme）是在一定条件下催化其本身 RNA 分子同时进行剪 切和连接反应的核酸类酶。 自我剪接酶都是 RNA 前体。根据其结构特点和催化特性的不同，该亚类可分为两个小类。 即含 I 型 IVS 的 R 酶和含 II 型 IVS 的 R 酶。 I 型 IVS 与四膜虫 rRNA 前体的间隔序列（IVS）结构相似，需要鸟苷（或 5’-鸟苷酸） 及镁离子（Mg++）参与，才能催化 rRNA 前体的自我剪接。 II 型 IVS 则与细胞核 mRNA 前体的 IVS 结构相似，在催化 mRNA 前体的自我剪接时， 需要镁离子参与，但不需要鸟苷或鸟苷酸。 通过自我剪接酶的催化作用，可以将原来由内含子隔开的两个外显子连接在一起，成为成 熟的 RNA 分子，才能发挥其功用。其催化反应如下式所示： 外显子·内含子·外显子 =========== 外显子·外显子 + 内含子
(RNA前体 (成熟RNA)
10 （RNA 前体） （成熟 RNA）