酶工程电子教案 第四章酶分孑修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过 程称为酶分子修饰。 ◆通过酶分子修饰,可以使酶分子结构发生某些改变,就有可能提高酶的活力,增强酶 的稳定性,降低或消除酶的抗原性等。 ◆通过酶分子修饰,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理 因素对酶分子空间构象的影响,可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。 ◆酶分子修饰主要包括金属离孑置换修饰,大分孑结合修饰,侧链基团修饰,肽链有限 水解修饰,核苷酸链有限水解修饰,氨基酸置换修饰,核苷酸置换修饰和酶分孑的物理修饰 等 1金属离子置换修饰 ◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为 金属离子置换修饰 ◆有些酶分子中含有金属离子,而且往往是酶活性中心的组成部分,对酶催化功能的发挥有 重要作用 α-淀粉酶中的钙离子(Ca+-) 谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn+) 过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe++) 酰基氨基酸酶分子中的锌离子(Zn++) 超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu+zn+)等。 ◆若从酶分子中除去其所含的金属离子,酶往往会丧失其催化活性
1 酶工程电子教案 第四章 酶分子修饰 ◆通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过 程称为酶分子修饰。 ◆通过酶分子修饰，可以使酶分子结构发生某些改变，就有可能提高酶的活力，增强酶 的稳定性，降低或消除酶的抗原性等。 ◆通过酶分子修饰，研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理 因素对酶分子空间构象的影响，可以进一步探讨其结构与功能之间的关系。 ◆酶分子修饰主要包括金属离子置换修饰, 大分子结合修饰，侧链基团修饰，肽链有限 水解修饰，核苷酸链有限水解修饰，氨基酸置换修饰，核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰 等。 1.金属离子置换修饰 ◆把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为 金属离子置换修饰。 ◆有些酶分子中含有金属离子，而且往往是酶活性中心的组成部分，对酶催化功能的发挥有 重要作用。 α-淀粉酶中的钙离子（Ca++） 谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn++) 过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe++) 酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn++） 超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu++,Zn++)等。 ◆若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性
◆若用另一种金属离子进行置换,则可使酶呈现出不同的特性。 1.1金属离子置换修饰的方法: ◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 ◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤 (1)酶的分离纯化:首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化,除去杂质,获得具有一定纯度的 酶液 (2)除去原有的金属离子:在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂,如乙二胺四乙酸 (EDTA)等,使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物 (3)加入置换离子:于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子,酶蛋白与新加入的金 属离子结合,除去多余的置换离子,就可以得到经过金属离子置换后的酶。 ◆用于金属离子置换修饰的金属离子,一般都是二价金属离子。 12金属离子置换修饰的作用 ◆通过金属离子置换修饰可以达到下列目的 (1)阐明金属离子对酶催化作用的影响 (2提高酶活力 (3)增强酶的稳定性 (4改变酶的动力学特性 2大分子结合修饰 ◆采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合,使酶分子的空间构象发生改变,从而改变酶 的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。 21大分子结合修饰的方法 ◆其修饰的主要过程如下
2 ◆若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。 1.1 金属离子置换修饰的方法： ◆金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 ◆金属离子置换修饰的过程主要包括如下步骤： (1)酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的 酶液。 (2)除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸 （EDTA）等，使酶分子中的金属离子与 EDTA 等形成螯合物。 (3) 加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金 属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 ◆用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。 1.2 金属离子置换修饰的作用： ◆通过金属离子置换修饰可以达到下列目的： (1)阐明金属离子对酶催化作用的影响： (2)提高酶活力： (3)增强酶的稳定性： (4)改变酶的动力学特性： 2.大分子结合修饰 ◆采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶 的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。 2.1 大分子结合修饰的方法： ◆其修饰的主要过程如下：
(1)修饰剂的选择 ◆大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如,聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、 蔗糖聚合物( Ficoll)、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等 在众多的大分子修饰剂中,相对分子质量为1000~10000的PEG应用最为广泛 (2)修饰剂的活化 作为修饰剂使用的水溶性大分子含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而 结合在一起。在使用之前一般需要经过活化,活化基团才能在一定条件下可以与酶分子的某 侧链基团进行反应 用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有 ①聚乙二醇均三嗪衍生物 ②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 ③聚乙二醇马来酸酐衍生物 ④聚乙二醇胺类衍生物 (3)修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的 温度、pH值等条件下反应一段时间,使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键 结合,对酶分子进行修饰。 例如,右旋糖酐先经过高碘酸(HIO4)活化处理,然后与酶分子的氨基共价结合,如 图4-3所示 I04
3 (1)修饰剂的选择： ◆大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、 蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。 ◆在众多的大分子修饰剂中，相对分子质量为 1 000～10 000 的 PEG 应用最为广泛。 (2)修饰剂的活化： 作为修饰剂使用的水溶性大分子含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而 结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，活化基团才能在一定条件下可以与酶分子的某 侧链基团进行反应。 用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有： ①聚乙二醇均三嗪衍生物 ②聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 ③聚乙二醇马来酸酐衍生物 ④聚乙二醇胺类衍生物： (3)修饰： 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的 温度、pH 值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键 结合，对酶分子进行修饰。 ◇例如，右旋糖酐先经过高碘酸（HIO4）活化处理，然后与酶分子的氨基共价结合，如 图 4-3 所示。 CH2 CH CH2 CH O O HIO4 O O HO HO HO HO HO OH O O OH O OH O O C C O n H H n
(右旋糖酐) (活化右旋糖酐) P (修饰酶) 图5-3右旋糖酐修饰酶分子的过程 4)分离 酶经过大分子结合修饰后,不同酶分子的修饰效果往往有所差别,需要通过凝胶层析等 方法进行分离,将具有不同修饰度的酶分孑分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 22大分子结合修饰的作用 (1)通过修饰提高酶活力:: (2)通过修饰可以增强酶的稳定性 (3)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性 3酶的侧链基团修饰 ◆采用一定的方法(一般为化学法)使酶的侧链基团发生改变,从而改变酶分子的特性和功 能的修饰方法称为侧链基团修饰。 ◆酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们的侧链基团不同,修饰方法也有所区别。 (1)蛋白类酶主要由蛋白质组成,酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上 的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形 成各种副键,对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白
4 (右旋糖酐) （活化右旋糖酐） NH2 CH2 CH O O OH HO HO OH HO O HO C C O N n （修饰酶） 图 5-3 右旋糖酐修饰酶分子的过程 (4)分离： 酶经过大分子结合修饰后，不同酶分子的修饰效果往往有所差别,需要通过凝胶层析等 方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。 2.2 大分子结合修饰的作用： (1)通过修饰提高酶活力:： (2)通过修饰可以增强酶的稳定性： (3)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性： 3.酶的侧链基团修饰 ◆采用一定的方法（一般为化学法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功 能的修饰方法称为侧链基团修饰。 ◆酶有蛋白类酶和核酸类酶两大类别。它们的侧链基团不同，修饰方法也有所区别。 （1）蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上 的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形 成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白 E E
空间构象的改变,从而改变酶的特性和功能。 (2)核酸类酶主要由核糖核酸(RNA)组成,酶RNA的侧链基团是指组成RNA的 核苷酸残基上的功能团。RNA分子上的侧链基团主要包括磷酸基,核糖上的羟基,嘌呤、 嘧啶碱基上的氨基和羟基(酮基)等。 ◆酶的侧链基团修饰方法主要有∶氨基修饰,羧基修饰,巯基修饰,胍基修饰,酚基修饰, 咪唑基修饰,吲哚基修饰,分子内交联修饰等。 3.1氨基修饰 ◆采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变,从而改变酶蛋白的空间构象的方法 称为氨基修饰。 ◆凡能够使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物,称为氨基修饰剂。主要有:亚硝酸、 24-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、246-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、乙亚胺甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。 3.2羧基修饰 ◆采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应,使蛋白质的空间 构象发生改变的方法称为羧基修饰 ◆可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合物称为羧基修饰剂。例如,碳化二亚胺、重 氮基乙酸盐、乙醇-盐酸试剂、异恶唑盐等。 碳二亚胺可以在比较温和的条件下与酶分子的羧基发生酯化反应 E-C-OH R-N=C=N-R E-C-0-C=N-R 诲)(碳二亚胺)(酶-碳二亚胺衍生物) ◆碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用此修饰法可以定量测定酶分子中
5 空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。 （2）核酸类酶主要由核糖核酸（RNA）组成，酶 RNA 的侧链基团是指组成 RNA 的 核苷酸残基上的功能团。RNA 分子上的侧链基团主要包括磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、 嘧啶碱基上的氨基和羟基（酮基）等。 ◆酶的侧链基团修饰方法主要有：氨基修饰，羧基修饰，巯基修饰，胍基修饰，酚基修饰， 咪唑基修饰，吲哚基修饰，分子内交联修饰等。 3.1 氨基修饰 ◆采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法 称为氨基修饰。 ◆凡能够使酶分子侧链上的氨基发生改变的化合物，称为氨基修饰剂。主要有：亚硝酸、 2,4-二硝基氟苯(DNFB)、丹磺酰氯(DNS)、2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、乙亚胺甲酯、O－甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。 3.2 羧基修饰 ◆采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间 构象发生改变的方法称为羧基修饰。 ◆可与蛋白质侧链上的羧基发生反应的化合物称为羧基修饰剂。例如，碳化二亚胺、重 氮基乙酸盐、乙醇－盐酸试剂、异恶唑盐等。 碳二亚胺可以在比较温和的条件下与酶分子的羧基发生酯化反应： E-C-OH + R-N=C=N-R’ ＝ E-C-O-C=N-R ‖ ‖ | O O NH-R’ (酶) （碳二亚胺） (酶-碳二亚胺衍生物) ◆碳二亚胺是酶分子羧基修饰最普遍采用的修饰剂。用此修饰法可以定量测定酶分子中
羧基的数目。 33巯基修饰 ◆采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合,使巯基发生改变,从而改变酶的空间构 象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。 常用的巯基修饰剂有∶酰化剂、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫 代硫酸盐、硼氢化钠 34胍基修饰 ◆采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环,从而改变酶分子的空间构象的方法称 为胍基修饰。 ◆用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有丁二酮、12-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等 它们可以在中性或者弱碱性的条件下,与精氨酸残基上的胍基反应,生成稳定的杂环类化合 物。 35酚基修饰 ◆蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基发生改 变,从而改变酶蛋白的空间构象和特性的修饰方法称为酚基修饰。酚基的修饰包括酚羟基的 修饰和苯环上的取代修饰。 ◆酚基修饰的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。其中四硝基甲烷(TNM)可 以高度专一地对酚羟基进行修饰。 36咪唑基修饰 ◆通过修饰剂与咪唑基反应,使酶分子中的组氨酸残基发生改变,从而改变酶分子的构 象和特性的修饰方法成为咪唑基修饰。 ◆常用的咪唑基修饰剂有∶碘乙酸,焦碳酸二乙酯等。 6
6 羧基的数目。 3.3 巯基修饰 ◆采用巯基修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构 象、特性和功能的修饰方法称为巯基修饰。 ◆常用的巯基修饰剂有：酰化剂、烷基化剂、马来酰亚胺、二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫 代硫酸盐、硼氢化钠。 3.4 胍基修饰 ◆采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的杂环，从而改变酶分子的空间构象的方法称 为胍基修饰。 ◆用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有丁二酮、1,2-环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。 它们可以在中性或者弱碱性的条件下，与精氨酸残基上的胍基反应，生成稳定的杂环类化合 物。 3.5 酚基修饰 ◆蛋白质分子的酪氨酸残基上含有酚基。通过修饰剂的作用使酶分子上的酚基发生改 变，从而改变酶蛋白的空间构象和特性的修饰方法称为酚基修饰。酚基的修饰包括酚羟基的 修饰和苯环上的取代修饰。 ◆酚基修饰的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。其中四硝基甲烷（TNM）可 以高度专一地对酚羟基进行修饰。 3.6 咪唑基修饰 ◆通过修饰剂与咪唑基反应，使酶分子中的组氨酸残基发生改变，从而改变酶分子的构 象和特性的修饰方法成为咪唑基修饰。 ◆常用的咪唑基修饰剂有：碘乙酸，焦碳酸二乙酯等
37吲哚基修饰 蛋白质分子中的色氨酸含有吲哚基。通过改变酶分子上的吲哚基而使酶分子的构象和 特性发生改变的修饰方法称为吲哚基修饰。 ◆两种修饰剂对吲哚基进行修饰N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、2-羟基-5-硝基苄溴 (HNBB)和4-硝基苯硫氯。 38分子内交联修饰 ◆含有双功能基团的化合物(又称为双功能试剂),如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛 等,可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联,从而提高酶的稳定性 的修饰方法称为分子内交联修饰。 ◆双功能基团化合物根据其功能基团的特点可以分为同型双功能基团化合物和异型双 功能基团化合物两大类 ◆同型双功能基团化合物的两端具有相同的功能基团预如己二胺[H2N(CH2)6-NH2] 的两端都含有氨基,可以与酶分子中的羧基反应形成酰胺键;戊二醛[OHC(CH2)3-CH 的两端都含有醛基等,可以与酶分子中的氨基反应形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。 ◆异型双功能基团化合物的两端所含的功能基团不相同。可以与酶分子上不同的侧链基 团反应。如,一端与酶分子的氨基作用,另一端与酶分孑的巯基或羧基作用等。 4肽链有限水解修饰 ◆在肽链的限定位点进行水解,使酶的空间结构发生某些精细的改变,从而改变酶的特性和 功能的方法,称为肽链有限水修饰。 ◆有些生物体可以通过生物合成得到不显示酶催化活性的酶原利用具有高度专一性的蛋白 酶对其进行肽链有限水解修饰显示岀酶的催化活性或提高酶活力
7 3.7 吲哚基修饰 ◆蛋白质分子中的色氨酸含有吲哚基。通过改变酶分子上的吲哚基而使酶分子的构象和 特性发生改变的修饰方法称为吲哚基修饰。 ◆两种修饰剂对吲哚基进行修饰:N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）、2-羟基-5-硝基苄溴 （HNBB）和 4-硝基苯硫氯。 3.8 分子内交联修饰 ◆含有双功能基团的化合物（又称为双功能试剂），如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛 等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性 的修饰方法称为分子内交联修饰。 ◆双功能基团化合物根据其功能基团的特点可以分为同型双功能基团化合物和异型双 功能基团化合物两大类。 ◆同型双功能基团化合物的两端具有相同的功能基团，例如，己二胺[H2N-(CH2) 6－NH2] 的两端都含有氨基，可以与酶分子中的羧基反应形成酰胺键,；戊二醛[OHC-(CH2) 3-CHO] 的两端都含有醛基等，可以与酶分子中的氨基反应形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。 ◆异型双功能基团化合物的两端所含的功能基团不相同。可以与酶分子上不同的侧链基 团反应。如，一端与酶分子的氨基作用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等。 4.肽链有限水解修饰 ◆在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和 功能的方法，称为肽链有限水修饰。 ◆有些生物体可以通过生物合成得到不显示酶催化活性的酶原, 利用具有高度专一性的蛋白 酶对其进行肽链有限水解修饰,显示出酶的催化活性或提高酶活力
例如,胰蛋白酶原的活化如图5-2所示。 像 RoQQ999 胰蛋白喜原 S-S 活性中心 游离的六肽—③④因因④ 胰蛋白酶 QQQQQ 图5-2胰蛋白酶原的活化 5.核苷酸链剪切修饰 ◆在核苷酸链的限定位点进行剪切,使酶的结构发生改变,从而改变酶的特性和功能的 方法,称为核苷酸链剪切修饰。 例如,四膜虫rRNA前体经过自我剪接作用形成成熟的rRNA。参看图5-3 56A-K63c1Ws(414t (15nt) GA ○ (399nt) G (4nt) (395nt) L-19IVS(395nt) 图5-3L-19IVS的形成 6氨基酸置换修饰 ◆将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法,称为氨基酸置换修
8 例如，胰蛋白酶原的活化,如图 5-2 所示。 图 5-2 胰蛋白酶原的活化 5.核苷酸链剪切修饰 ◆在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的特性和功能的 方法，称为核苷酸链剪切修饰。 例如，四膜虫 rRNA 前体经过自我剪接作用形成成熟的 rRNA。参看图 5-3。 5’ GA G 3’ G-IVS(414nt) (15nt) GA + （399nt） G (4nt) + (395nt) L-19IVS (395nt) 图 5-3 L-19 IVS 的形成 6.氨基酸置换修饰 ◆将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修
饰。 61氨基酸置换修饰的作用: 蛋白类酶酶分子经过氨基酸置换修饰后,可以提高酶活力、增加酶的稳定性或改变酶 的催化专一性。 62氨基酸置换修饰的方法 (1)化学修饰法 (2定点突变技术 ◆定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下 ①新的酶分子结构的设计 ②突变基因碱基序列的确定 ③突变基因的获得 ④新酶的获得 7核苷酸置换修饰 ◆将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法,称为核苷酸置换 修饰。 ◆核苷酸置换修饰通常采用定位突变技术进行。只要将核苷酸链中的—个几个核苷酸置 换,就可以使核酸类酶的特性和功能发生改变 ◆L-19ⅣS活性中心由第22~27位的六个核苷酸残基组成,只要将其中的碱基置换一 个,就可以使其底物专一性发生改变(参看表5-2)。 表5-2L-19ⅣVS活性中心上碱基的改变引起其底物专一性的变化 L-19IVS 底物 催化产物 22~27位的核苷酸序列1
9 饰。 6.1 氨基酸置换修饰的作用： ◆蛋白类酶酶分子经过氨基酸置换修饰后，可以提高酶活力、增加酶的稳定性或改变酶 的催化专一性。 6.2 氨基酸置换修饰的方法： (1)化学修饰法： (2)定点突变技术： ◆定位突变技术用于酶分子修饰的主要过程如下： ①新的酶分子结构的设计 ②突变基因碱基序列的确定 ③突变基因的获得 ④新酶的获得 7.核苷酸置换修饰 ◆将酶分子核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换 修饰。 ◆核苷酸置换修饰通常采用定位突变技术进行。只要将核苷酸链中的一个几个核苷酸置 换，就可以使核酸类酶的特性和功能发生改变。 ◆L-19 IVS 活性中心由第 22～27 位的六个核苷酸残基组成，只要将其中的碱基置换一 个，就可以使其底物专一性发生改变（参看表 5-2）。 表 5-2 L-19IVS 活性中心上碱基的改变引起其底物专一性的变化 L-19IVS 22～27 位的核苷酸序列 底 物 I Ⅱ 催化产物
5′- GGAGGG-3′| GGCCUCUAAAAA(1) GGCCUCU GGCCUGUAAAAA(2) GGG GAAAAA GGCCGCUAAAAA(3 无反应 无反应 无反应 5′- GCAGGG-3 GGG GGCCUGU GAAAAA 无反应 无反应 5′- GGCGGG-3 GGG 无反应 GGCCGCU GAAAAA 8酶分子的物理修饰 ◆通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能 的方法称为酶分子的物理修饰。 ◆酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团,酶分子中的共价键不发生 改变。只是在物理因素的作用下,副键发生某些变化和重排,使酶分子的空间构象发生某些 改变。 ◆酶分子的空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下,首先使酶分子原有的空间构 象破坏,然后在不同的物理条件下,使酶分子重新构建新的空间构象。 9酶分子修饰的应用
10 5’-GGAGGG-3’ GGCCUCUAAAAA (1) G GGCCUGUAAAAA (2) G GGCCGCUAAAAA (3) G GGCCUCU + GAAAAA 无反应 无反应 5’-GCAGGG-3’ (1) G (2) G (3) G 无反应 GGCCUGU + GAAAAA 无反应 5’-GGCGGG-3’ (1) G (2) G (3) G 无反应 无反应 GGCCGCU + GAAAAA 8.酶分子的物理修饰 ◆通过各种物理方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能 的方法称为酶分子的物理修饰。 ◆酶分子物理修饰的特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生 改变。只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些 改变。 ◆酶分子的空间构象的改变还可以在某些变性剂的作用下，首先使酶分子原有的空间构 象破坏，然后在不同的物理条件下，使酶分子重新构建新的空间构象。 9.酶分子修饰的应用