Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 ●●● 制作:郑穗平
Chapter 3 The Extraction, Separation and Purification of Enzyme 酶的分离纯化 制作：郑穗平
●● ●●●●● ●●●● ●●●● Contents of chapter 3 ●●●● 1、酶的提取与分离纯化技术路线 ∞2、细胞破碎 ∞3、酶的提取 4、酶的分离方法 Go 酶的组合分离纯化策略 6、酶的浓缩、干燥与结晶
Contents of chapter 3 1、酶的提取与分离纯化技术路线 2、细胞破碎 3、酶的提取 4、酶的分离方法 Go Go Go Go Go 5、酶的组合分离纯化策略 Go 6、酶的浓缩、干燥与结晶
●● ●●●●● ●●●● ●●●● 细胞结构与酶分布 ●●●● Plant Cell Structure Cell Plasma chloroplast me mbrane Plasmo- Central vacuole Mitochondrion Bacterial Cell Structure Ribosomes Lysosome Pili Golgi Nuclear DNA apparatus Ribosomes Nucleus Rough Nucleolus endoplasmi Smooth→ reticulum Flagellum endoplasmIc Cytoplasm reticulum Animal Cell Structure Capsule Golgi Microvilli apparatus Plasma Cell wall membrane Plasma Centriole membrane Smooth endoplasmic lysosome Nuclear envelope Mitochon- drion Rou plasm Nucleus reticule Cytoplasm
细胞结构与酶分布
●● ●●●●● ●●●● ●●●● 3.1酶的提取、分离纯化技术路线 ●●●● 细胞破碎动物、植物或微生物细胞 酶提取 发酵液 酶分离纯化 酶浓缩 离心分离,过滤分离,沉淀分 酶贮存 离,层析分离,电泳分离,萃 取分离,结晶分离等
3.1 酶的提取、分离纯化技术路线 细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 动物、植物或微生物细胞 发酵液 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等
A純化階段 B分析方法 酶分离纯化不同阶段 Material Background knowledge about Mat erial 酶的纯化过程,约可分为 Extraction Protein/ Adivity assay 三个阶段: Protein (1)粗蛋白质( crude Electrophoresis fractionation Native-PAGE protein):采样→均质 Ampniumsulate SDS-PAGE okrent Gradient PAGe 打破细胞→抽出全蛋白 多使用盐析沉淀法;可以 Chromatography Kinetic study Mol ecular weight Sedimentation coeffi cent 粗略去除蛋白质以外的物 determinati on 州 finity chomatography 质 FPLC Quaternary structure 月. ElectrophoresIs Isoelectric focusing Pepti de mapping (2)部分纯化 (partially purified): Amino acid analysis 初步的纯化,使用各钟柱 Pure enzyme Amino acid sequencing Extinct on coefficient 层析法。 Antibody production iMmunoassays: (3)均质酶 Monocbral or conrentional antibodies Immunoblotting 2 ELISA ( homogeneous):目标酶 X-Ray Double diffusion Crystal 的进一步精制纯化,可用 crystallography Irmmunoeledropharesis 制备式电泳或HPLC Spectroscopic methods CD, ORD, NMR& ESR
酶的纯化过程，约可分为 三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质 打破细胞 → 抽出全蛋白， 多使用 盐 析沉淀 法；可以 粗略去除蛋白质以外的物 质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使用各钟 柱 层析法 。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 的进一步精制纯化，可用 制备 式电泳 或 HPLC 。 酶分离纯化不同阶段 本章 目录
●● ●●●●● ●●●● 32细胞破碎 ●●●● ●●●● 许多酶存在于细胞内。 JY92-ⅢD超声波 为了提取这些胞内酶, 首先需要对细胞进行破 细胞粉碎机 碎处理。 高压细胞破碎机 1)机械破碎 2)物理破碎 3)化学破碎 4)酶解破碎 DY89-型电动玻璃匀浆机 细胞破碎珠
3.2 细胞破碎 许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎 JY92-II D超声波 细胞粉碎机 细 胞 破 碎 珠 高 压 细 胞 破 碎 机 DY89-I型电动玻璃匀浆机
●● 细胞破碎方法及其原理 ●●●●● ●●●● ●●●● 捣碎法 ●●● 机械破碎→通过机械运动产生的剪切 ●●●● 研磨法 匀浆法 通过各种物理因素的作用, 温度差破碎法 物理破碎 使组织、细胞的外层结构破 →压力差破碎法 坏,而使细胞破碎。 超声波破碎法 有机溶剂: 化学破碎□→ 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用,而使细胞破碎 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂 Triton、 Tween 通过细胞本身的酶系或外 酶促破碎 加酶制剂的催化作用,使 自溶法 细胞外层结构受到破坏 外加酶制剂法 而达到细胞破碎
机械破碎 捣碎法 研磨法 匀浆法 物理破碎 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 化学破碎 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 酶促破碎 自溶法 外加酶制剂法 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。 通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎 通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 本章 目录
●● ●●●●● ●●●● ●●●● 3.3酶的提取 ●●●● 酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶剂或溶液处理含酶原料, 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质,选择适当的溶剂。一般说 来,极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性的有机溶 剂中,酸性物质易溶于碱性溶剂中,碱性物质易溶于酸性溶剂中 ●酶都能溶解于水,通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取, 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则可用有机溶剂提取。 提高温度,降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离,增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度,从而增大提取效果 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活,在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件
⚫ 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料， 使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 ⚫ 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说 来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶 剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 ⚫ 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取， 有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 3.3 酶的提取 提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件
●● 酶的主要提取方法 ●●●●● ●●●● ●●●● ●●●● 提取方法使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取0.02~0.5πol/L的盐溶用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 液 较大的酶 酸溶液提取PH2~6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大, 且稳定性较好的酶 碱溶液提取PH8~12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶 Salting-in 大多数蛋白类酶都溶于水,而 x且在低浓度的盐存在的条件下 onic strength 酶的溶解度随盐浓度的升高而 分子在其等帮贴時·容易互相吸引+聚台成沉殿;加入 增加,这称为盐溶现象 锦账子會破擦些吸引力·使分子散開·溶入水中
酶的主要提取方法 提取方法 使用的溶剂或溶液 提取对象 盐溶液提取 0.02～0.5mol/L的盐溶 液 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 酸溶液提取 PH2～6的水溶液 用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 碱溶液提取 PH8～12的水溶液 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶 大多数蛋白类酶都溶于水，而 且在低浓度的盐存在的条件下， 酶的溶解度随盐浓度的升高而 增加，这称为盐溶现象。 本章 目录
●● ●●●●● ●●●● ●●●● 34酶的分离方法 ●●●● Go 、沉淀分离 02、离心分离 03、过滤与膜分离 a04、层析分离 电泳分离 o6、萃取分离
3.4 酶的分离方法 1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 Go Go Go Go Go 5、电泳分离 Go 6、萃取分离 本章 目录