土壤脲酶活性测定(NH释放量法) 脲酶是酰胺水解酶的一种,在自然界中分布广泛,植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。 土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应: H NCONH +HO →>2NH3+CO2 在反应过程中,氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等 化合物的水解。脲酶含有镍,分子量在151,000Da~480,00Da之间。能够抑制脲酶活性 的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于50的重金属的盐、含氟化合物、 醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。 1.试验原理 通过对新鲜土壤与尿素溶液在37℃培养2h后测定氨释放量,估计脲酶的活性( Tabatabai, 1994) 2.试验仪器 50mL容量瓶;培养箱或恒温水浴;蒸馏定氮仪。 3.试验试剂(所用试剂均为分析纯) 甲苯(C6HsCH3); b.缓冲液:三(羟甲基)氨基甲烷[c(C2HON3)=0.05md·L,pH90]:称取6.1g三 (羟甲基)氨基甲烷(Ti( hydroxymethyl) aminomethane)溶入700mL蒸馏水中,用c(H2SO) =0.2molL的硫酸溶液调pH至9.0,再用蒸馏水定容至1000mL; c.尿素溶液{cCO(NH)]=0.2mol·L}:称取1.2g尿素溶入约80mL缓冲液中,后用该 缓冲液定容至100mL。尿素溶液要当天配制,并在4℃下保存备用 d.氯化钾硫酸银混合溶液|c(KC)=25 molL-I-p(Ag2SO)=100mgL:先将100mg Ag2SO4溶于700mL蒸馏水中,再加入188g的KCl1(分析纯)使之溶解,在定容至100mL; e.氧化镁(MgO):于高温电炉中,将氧化镁在600℃-700℃温度下灼烧2h,再放置于干 燥器中冷却,贮于瓶中 f.混合指示剂:溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇(95%纯度) g.硼酸指示剂溶液Iρ(H3BO3)=20gLl:溶解20g硼酸于950m的热蒸馏水中,泠却, 加入20m的混合指示剂,充分混匀后,小心滴加氢氧化钠溶液[c(NaOH=0. Imol L-,直至 溶液呈红紫色(pH约4.5),稀释成ll
土壤脲酶活性测定（NH4 +释放量法） 脲酶是酰胺水解酶的一种，在自然界中分布广泛，植物、动物和微生物细胞中均含有此酶。 土壤中的脲酶主要来源于微生物和植物。脲酶催化尿素的水解反应： H NCONH + H O 2NH +CO 2 2 2 3 2 ⎯⎯⎯→ 脲酶 在反应过程中，氨基甲酸盐是中间产物。脲酶还能够催化羟基脲、二羟基脲、半卡巴脲等 化合物的水解。脲酶含有镍，分子量在 151，000 Da～480，00 Da 之间。能够抑制脲酶活性 的化合物有含硼化合物、尿素衍生物、甲醛、原子量大于 50 的重金属的盐、含氟化合物、 醌和多元酚、抗代谢剂、杂环硫醇等。 1. 试验原理 通过对新鲜土壤与尿素溶液在 37℃培养 2h 后测定氨释放量，估计脲酶的活性 (Tabatabai, 1994)。 2. 试验仪器 50mL 容量瓶；培养箱或恒温水浴；蒸馏定氮仪。 3. 试验试剂（所用试剂均为分析纯） a. 甲苯（C6H5CH3）; b. 缓冲液：三（羟甲基）氨基甲烷[c（C2H8O3N3）=0.05mol·L -1 , pH9.0]：称取 6.1g 三 （羟甲基）氨基甲烷（Tris (hydroxymethyl) aminomethane）溶入 700mL 蒸馏水中，用 （c H2SO4） =0.2mol·L -1 的硫酸溶液调 pH 至 9.0，再用蒸馏水定容至 1000mL; c. 尿素溶液{c[CO(NH2)2]=0.2 mol·L -1}：称取 1.2g 尿素溶入约 80mL 缓冲液中，后用该 缓冲液定容至 100mL。尿素溶液要当天配制，并在 4℃下保存备用； d. 氯化钾硫酸银混合溶液[c（KCl）＝2.5mol·L-1 ]－[ρ（Ag2SO4）=100mg·L-1 ]：先将 100mg Ag2SO4 溶于 700mL 蒸馏水中，再加入 188g 的 KCl（分析纯）使之溶解，在定容至 1000mL； e. 氧化镁（MgO）：于高温电炉中，将氧化镁在 600℃-700℃温度下灼烧 2h，再放置于干 燥器中冷却，贮于瓶中； f. 混合指示剂：溶解 0.099g 的溴甲酚绿和 0.066g 甲基红于 100mL 的乙醇（95％纯度） 中； g. 硼酸指示剂溶液[ρ（H3BO3）=20g·L-1 ]：溶解 20g 硼酸于 950mL 的热蒸馏水中，冷却， 加入 20mL 的混合指示剂，充分混匀后，小心滴加氢氧化钠溶液[c(NaOH)=0.1mol·L-1 ],直至 溶液呈红紫色（pH 约 4.5），稀释成 1L；
h.硫酸标准溶液[c(1/2H2SO4)=0.005m01L] 4.试验步骤 将5.00g新鲜土样(<2m)放置于50mL容量瓶中,加入0.2mL甲苯(试剂a)和9mL缓 冲溶液(试剂b),轻摇混匀后加入1.OmL尿素溶液(试剂c),再次轻摇混匀并塞上瓶塞 在37℃下培养2h。然后加入约35u的KCl-Ag2SO4溶液(试剂d),轻摇容量瓶几秒钟后, 放置至室温(约5min),用KCl-Ag2SO4溶液定容,摇匀。同时要仪同样步骤做空白,只是 培养2h后先加35mL的KCl-Ag2SO4溶液,然后加入1.0mL尿素溶液 燕馏法测氨:取土壤悬浮液20至蒸馏瓶中,加入0.2g的Mg0,用硼酸指示溶液吸收, 蒸馏液的体积约为30mL。用c(1/2HSO4)=0.005 mo1. L-I的H2SO4标准溶液滴定 5.结果计算 c×Vxts×14 O(N) 1000 m×k×2 式中:(N)一单位时间内氨态氮的释放量,mg·kgh2; c-1/2H2SO4标准溶液的浓度, mo1-L-L V一H2SO4标准溶液的体积,mL: ts-分取系数,25 4-氮的摩尔质量,mg·mmol; 2一培养时间,2h: m-样品质量,g; 水分系数 6.注意: 与其他缓冲液(如磷酸盐缓冲液)相比,三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液优点在于它能 够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调pH,因为后者能够 促进脲酶的活性 b.在配制KCl-Ag2SO4溶液时,应将KC1溶于溶解后的Ag2SO4溶液中,因为Ag2SO在 KCl溶液中不溶。加入KCl-Ag2SO4混合溶液后脲酶的活性停止,因此该悬浮液在测定氨之 前可以放置2h 方法来源:鲁如坤.土壤农业化学分析方法.北京:中国农业科技出版社,2000
h. 硫酸标准溶液[c（1/2H2SO4）=0.005mol·L-1]。 4. 试验步骤 将 5.00g 新鲜土样（<2mm）放置于 50mL 容量瓶中，加入 0.2mL 甲苯（试剂 a）和 9mL 缓 冲溶液（试剂 b），轻摇混匀后加入 1.0mL 尿素溶液（试剂 c），再次轻摇混匀并塞上瓶塞。 在 37℃下培养 2h。然后加入约 35mL 的 KCl-Ag2SO4 溶液（试剂 d），轻摇容量瓶几秒钟后， 放置至室温（约 5min），用 KCl-Ag2SO4 溶液定容，摇匀。同时要仪同样步骤做空白，只是 培养 2h 后先加 35mL 的 KCl-Ag2SO4 溶液，然后加入 1.0mL 尿素溶液。 蒸馏法测氨：取土壤悬浮液 20mL 至蒸馏瓶中，加入 0.2g 的 MgO，用硼酸指示溶液吸收， 蒸馏液的体积约为 30mL。用 c（1/2H2SO4）＝0.005 mol·L-1 的 H2SO4 标准溶液滴定。 5. 结果计算 c ts N 1000 m k 2 （ ）＝ V 14 式中：ω（N）－单位时间内氨态氮的释放量，mg·kg-1h -1 ； c－1/2H2SO4 标准溶液的浓度，mol·L-1 ； V－H2SO4 标准溶液的体积，mL； ts－分取系数，2.5； 14－氮的摩尔质量，mg·mmol-1 ； 2－培养时间，2h； m－样品质量，g； k－水分系数。 6. 注意： a. 与其他缓冲液（如磷酸盐缓冲液）相比，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液优点在于它能 够有效地防止铵的固定。在配制该缓冲液时必须用硫酸而不是盐酸来调 pH，因为后者能够 促进脲酶的活性； b. 在配制 KCl-Ag2SO4 溶液时，应将 KCl 溶于溶解后的 Ag2SO4 溶液中，因为 Ag2SO4 在 KCl 溶液中不溶。加入 KCl-Ag2SO4 混合溶液后脲酶的活性停止，因此该悬浮液在测定氨之 前可以放置 2h。 方法来源：鲁如坤. 土壤农业化学分析方法. 北京: 中国农业科技出版社, 2000