College of Life Scie 第三章酶的分离提纯 酶的分离纯化是酶工程的主要内容, 也是酶学研究过程中必不可少的环节。 酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他 含酶原料中提取出来,再与杂质分开 以获得符合研究或使用要求的酶的过 程。其主要内容包括细胞破碎、酶的 提取、离心分离、过滤与膜分离、沉 淀分离、层析分离、电泳分离、萃取生 分离、结晶等。 命 科 学 学 院
第三章 酶的分离提纯 • 酶的分离纯化是酶工程的主要内容， 也是酶学研究过程中必不可少的环节。 • 酶的分离纯化是指将酶从细胞或其他 含酶原料中提取出来，再与杂质分开， 以获得符合研究或使用要求的酶的过 程。其主要内容包括细胞破碎、酶的 提取、离心分离、过滤与膜分离、沉 淀分离、层析分离、电泳分离、萃取 分离、结晶等
College of Life Science 第一节细胞破碎 程们存在不同生物体的不同成 酶的种类繁多,已知的约4000种 除了动物和植物体液中的酶和微生物 胞外酶之外,大多数酶都存在于细胞 之中。为了获得细胞内的酶,就得收 集细胞并进行细胞或组织破碎 对于不同的生物体,或同一生物体的 不同组织的细胞,由于结构不同,所 采用的细胞破碎方法和条件亦有所不 生 同,必须根据具体情况进行适当的选命 择,以达到预期的效果。 科 学 学 院
第一节 细胞破碎 • 酶的种类繁多，已知的约 4000种，它 们存在于不同生物体的不同部位。 • 除了动物和植物体液中的酶和微生物 胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞 之中。为了获得细胞内的酶，就得收 集细胞并进行细胞或组织破碎。 • 对于不同的生物体，或同一生物体的 不同组织的细胞，由于结构不同，所 采用的细胞破碎方法和条件亦有所不 同，必须根据具体情况进行适当的选 择，以达到预期的效果
College of Life Science 细胞破碎的方法很多,可以分为机械 破碎法、微量破碎法、化学破碎法和 程酶促破碎法等 ·1机械破碎法通过机械运动所产生的剪 切力的作用使细胞破碎的方法,称为 机械破碎法。常用的破碎机械有组织 捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。 2物理破碎法通过温度、压力、声波等 各种物理因素的作用使组织细胞破碎 生 的方法,称为物理破碎法。物理破碎命 法多用于微生物细胞的破碎 科 学 学 院
• 细胞破碎的方法很多，可以分为机械 破碎法、微量破碎法、化学破碎法和 酶促破碎法等。 • 1.机械破碎法通过机械运动所产生的剪 切力的作用使细胞破碎的方法，称为 机械破碎法。常用的破碎机械有组织 捣碎机、细胞研磨器、匀浆器等。 • 2.物理破碎法通过温度、压力、声波等 各种物理因素的作用使组织细胞破碎 的方法，称为物理破碎法。物理破碎 法多用于微生物细胞的破碎
College of Life Scie 常用的物理破碎法方法有: (1)温度差破碎法:利用温度的突然变化,细胞 由于热胀冷缩的作用而破碎。 (2)压力差破碎法:通过压力的突然变化,使细 胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压 变化等方法 (3)超声波破碎法:利用超声波发生器所发出的 10~20kHz的声波或超声波的作用,使细胞膜产 生空穴作用( cavitation)而使细胞破碎。 3化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的 作用使细胞破碎的方法,称为化学破碎法 常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有命 机溶剂和特里顿( Triton)、吐温( Tween)等科 表面活性剂。 学 学 院
• 常用的物理破碎法方法有： （1）温度差破碎法：利用温度的突然变化，细胞 由于热胀冷缩的作用而破碎。 （2）压力差破碎法：通过压力的突然变化，使细 胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压及渗透压 变化等方法。 （3）超声波破碎法：利用超声波发生器所发出的 10~20kHz的声波或超声波的作用，使细胞膜产 生空穴作用（cavitation）而使细胞破碎。 • 3.化学破碎法通过各种化学试剂对细胞膜的 作用使细胞破碎的方法，称为化学破碎法。 – 常用的化学试剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有 机溶剂和特里顿（Triton）、吐温（Tween）等 表面活性剂
College of Life Science 酶工程 4酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用,使细胞外层结构受到破坏, 而送到细胞破碎的百的。 利用细胞本身的酶系的作用,在一定的pH值和 品度条件下保温一段时间,使细胞破坏,而使细 胞内物质释出的方法,称为自溶法。自溶法效果 的好坏取决于温度、pH值、离子强度等自溶条 件的选择与控制。 根据细胞外层结构的特点,还可以外加适当的酶 作用于细胞,使细胞壁受到破坏,并在低渗透压 的溶液中使细胞破裂。例如,革兰氏阳性菌主要 依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状,外加溶菌 胞壁破坏;酵母细胞的破碎是外加葡聚糖酶 使其细胞壁的β-1,3-葡聚糖水解;霉菌可用几生 质酶机械细胞破碎;纤维素酶、半纤维素酶和命 果胶酶的混合使用,对植物细胞壁有良好的破碎科 效果。 学 学 院
4.酶促破碎法通过细胞本身的酶系或外加酶制 剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎的目的。 – 利用细胞本身的酶系的作用，在一定的 pH 值和 温度条件下保温一段时间，使细胞破坏，而使细 胞内物质释出的方法，称为自溶法。自溶法效果 的好坏取决于温度、pH 值、离子强度等自溶条 件的选择与控制。 – 根据细胞外层结构的特点，还可以外加适当的酶 作用于细胞，使细胞壁受到破坏，并在低渗透压 的溶液中使细胞破裂。例如，革兰氏阳性菌主要 依靠肽多糖维持细胞壁的结构和形状，外加溶菌 酶，作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键，而使其细 胞壁破坏；酵母细胞的破碎是外加!-葡聚糖酶， 使其细胞壁的β -1，3-葡聚糖水解；霉菌可用几 丁质酶机械细胞破碎；纤维素酶、半纤维素酶和 果胶酶的混合使用，对植物细胞壁有良好的破碎 效果
College of Life science 酶工程 第二节酶的提取 酶的提取是指在一定的条件下,用适当的溶 剂处理含酶原料,使酶充分溶解到溶剂中的 过程,也称作酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质, 选择适当的溶剂。酶都能溶解于水,可用水 或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些 酶与脂质结合或含有较多的非极性基团,则 可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并 防止酶的变性失活,在提取过程中要注意控 制好温度、pH值等提取条件。 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同,生 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提科 )取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。 学 院
第二节 酶的提取 • 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶 剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的 过程，也称作酶的抽提。 • 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质， 选择适当的溶剂。酶都能溶解于水，可用水 或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取。有些 酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则 可用有机溶剂提取。为了提高酶的提取率并 防止酶的变性失活，在提取过程中要注意控 制好温度、pH 值等提取条件。 • 根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同， 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提 取、碱溶液提取和有机溶剂提取等
College of Life Scie 酶工程 盐溶液提取 大多数蛋白类酶(P酶)都溶于水,而且 在低浓度的盐存在的条件下,酶的溶解度 增加,这称为盐溶现象,所以一般采用稀 盐溶液进行酶的提取。例如,固体发酵生 产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶, 用0.14moL的氯化钠溶液或 0.02~0.05moL的磷酸缓冲液提取;枯草 杄菌碱性磷酸酶用0.1mo儿L氯化镁溶液 提取等。有少数酶,如霉菌脂肪酶,用清 水提取的效果较好 核酸类酶(R-酶)的提取,一般是在细胞生 破碎后,用0.14mo_的氯化钠溶液提取 命 科 得到核糖核蛋白提取液,再进一步与蛋白学 质等杂质分离,而得到酶RNA。 学 院
1.盐溶液提取 – 大多数蛋白类酶（P-酶）都溶于水，而且 在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度 增加，这称为盐溶现象，所以一般采用稀 盐溶液进行酶的提取。例如，固体发酵生 产的麸曲中的淀粉酶、蛋白酶等胞外酶， 用 0.14mol/L 的氯化钠溶液或 0.02~0.05mol/L 的磷酸缓冲液提取；枯草 杆菌碱性磷酸酶用 0.1mol/L 氯化镁溶液 提取等。有少数酶，如霉菌脂肪酶，用清 水提取的效果较好。 – 核酸类酶（R-酶）的提取，一般是在细胞 破碎后，用 0.14mol/L 的氯化钠溶液提取， 得到核糖核蛋白提取液，再进一步与蛋白 质等杂质分离，而得到酶 RNA
College of Life Science 酶工程 2酸溶液提取 有些酶在酸性条件下溶解度较大,且稳定 性较好,宜用酸溶液提取。例如,胰蛋白 酶可用0.12moL的硫酸溶液提取。 3碱溶液提取 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较 好的酶,应采用碱溶液提取。例如,细菌 L-天冬酰胺酶可用pH11~12的碱溶液碱性生 提取。 科
2.酸溶液提取 – 有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定 性较好，宜用酸溶液提取。例如，胰蛋白 酶可用 0.12mol/L 的硫酸溶液提取。 3.碱溶液提取 – 有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较 好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌 L-天冬酰胺酶可用 pH11~12的碱溶液碱性 提取
College of Life Scie 4.有机溶剂提取 有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基 团的P酶,可以采用与水可混溶的丁醇 等有机溶剂提取。 例如,琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。 在R-酶的提取中,经常采用苯酚水溶液。 一般是在细胞破碎、制成匀浆后,加入等 体积的90%苯酚水溶液,振荡一段时间, 结果DNA和蛋白质沉淀于苯酚层,而 RNA溶解于水中。 生命科学学院
4.有机溶剂提取 – 有些与脂质结合牢固或含有较多非极性基 团的 P-酶，可以采用与水可混溶的丁醇 等有机溶剂提取。 – 例如，琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶等的提取。 – 在 R-酶的提取中，经常采用苯酚水溶液。 一般是在细胞破碎、制成匀浆后，加入等 体积的 90% 苯酚水溶液，振荡一段时间， 结果 DNA 和蛋白质沉淀于苯酚层，而 RNA 溶解于水中
College of Life Science 在酶提取过程中,为了防止酶变性失 活,温度不宜高,尤其是采用有机溶 剂提取时,温度应该控制在0~10°C。 有些酶对温度的耐受性较高,可在室 温或更高一些的温度条件下提取。为 了提高酶的溶解度,提取时pH值应该 避开酶的等电点。此外,还可加入某 些保护剂,以提高酶的稳定性 生命科学学院
• 在酶提取过程中，为了防止酶变性失 活，温度不宜高，尤其是采用有机溶 剂提取时，温度应该控制在 0~10℃ 。 有些酶对温度的耐受性较高，可在室 温或更高一些的温度条件下提取。为 了提高酶的溶解度，提取时 pH 值应该 避开酶的等电点。此外，还可加入某 些保护剂，以提高酶的稳定性