药敏试验附件3药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻盼（CFT），头孢噻（CTX），庆大霉素（GEN），啶酸（NAL），环丙沙星（CIP），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新诺明（SMZ）。药敏结果判定标准按照NCCLs手册2005版。1.操作方法：（1）将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。（2）用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈保证涂均匀。（3）待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。在菌接种后15分钟内贴完纸片。（4）将平板反转，孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表6）。抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。（5）每次药敏试验必须用ATCC25922大肠杆菌做质控。只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。ATCC25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告在附表6中。0.5麦氏比浊管配制方法：0.5ml0.048MBaCL2(1.17%W/VBaCL2.2H2O)99.5ml0.36NH2SO4(1%,V/V)将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月
附件 3 药敏试验 药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的 K-B 琼脂法进行，药 敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素： 氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX）， 庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），环丙沙星（CIP），四环素（TBT），利福平 （RFA），复方新诺明（SMZ）。药敏结果判定标准按照 NCCLs 手册 2005 版。 1. 操作方法： （1）将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养 16～18 小时，然后挑取 普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于 3ml 生理盐水中，混匀后与菌液比浊管 比浊。以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5 麦氏单位）相同。 （2）用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。用棉拭子涂布 整个 M-H 培养基表面，反复几次，每次将平板旋转 60 度，最后沿周边绕两圈， 保证涂均匀。 （3）待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。用无菌镊子取药敏纸片 贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴 5 张纸片，每张纸片间距不 少于 24mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15mm。在菌接种后 15 分钟内贴完纸 片。 （4）将平板反转，孵育 18～24 小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直 径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表 6）。抑菌环的边缘以肉 眼见不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药 在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。结果判断依据鉴定所 药敏纸片判定标准。 （5）每次药敏试验必须用 ATCC 25922 大肠杆菌做质控。只有当质控菌株 的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。ATCC 25922 的结果必 须与测试菌株同时记录和报告在附表 6 中。 0.5 麦氏比浊管配制方法： 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为 6 个月
2.注意事项：(1）制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。(2）药敏纸片长期储存应于一20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后，放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。过期纸片不能使用，应弃去。(3）不稳定药物如亚胺培南，头孢克洛，克拉维酸复合药等，应冷冻保存，最好在-40℃以下。(4）保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。3.质量控制质量控制方法是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同
2. 注意事项： (1) 制备 MH 琼脂平板应用直径 90mm 平皿，在水平的实验台上倾注。琼 脂厚为 4±0.5mm（约 25-30ml 培养基），琼脂凝固后塑料包装放 4℃保存，在 5 日内用完，使用前应在 37℃培养箱烤干平皿表面水滴。倾注平皿前应用 pH 计 测 pH 值是否正确(pH 应为 7.3)。pH 过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失 效，而青霉素活力增强。 (2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在 4℃，但 应至于含干燥剂的密封容器内。使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打 开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。 过期纸片不能使用, 应弃 去。 (3) 不稳定药物如亚胺培南, 头孢克洛, 克拉维酸复合药等, 应冷冻保存, 最好在-40 ℃以下。 (4) 保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的 MH 平板复活。然后每株细菌接种 10 支高层琼脂管，放置冰箱保存。每月取出一 支，传出细菌供常规用。待用剩至最后一支，可传种在 M-H 平板上，再接种一 批高层琼脂管备用。如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。 3.质量控制 质量控制方法 是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。 应使用新鲜传代的菌种。接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种 类也应与常规测定的种类相同