2.分子克隆及相关试验技术2分子生物学实验技术2.1分子克隆及相关实验技术2.1.1分子克隆2.1.2引物设计2.1.3 Gibson assembly2.1.4质粒抽提2.1.5化学法E.Coli感受态制备2.1.6电转化感受态制备2.1.7氯化法感受态2.1.8Trizol法提取真核细胞总RNA2.1.9体外逆转录2.1.10实时荧光定量PCR2.1.11 基因定点突变2.1分子克隆及相关实验技术2.1.1分子克隆质粒含目的基因的外源DNA限制性切+限制性酶切DNA连接酬+目的基因重组质粒非转化菌转化O筛选受体菌转化菌扩增简介（INTRODUCTION）完整的分子克隆可以简述为“分一切一→接→转一筛一→表”六个实验，如上图。PCR、酶切、连接、转化是传统基因克隆方法获得重组质粒必不可少的步骤。用PCR方法扩增要克隆的目的基因，限制性内切酶使插入片段和克隆载体之间建立互补配对的碱基序列，再经连接酶的连接反应完成插入片段和线性载体之间的重组。考虑到重组效率，通常要先将连接的产物转化到用于扩增质粒的克隆大肠杆菌感受态细胞中，进一步筛选正确的重组子。PCR：即多聚酶链式反应。它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。反应过程分为三步：变性，退火，延伸。变性：双链DNA解旋形成单链。退火：特定引物与DNA单链模板结合。延伸：从5端向3’端延伸。酶切：限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。分子克隆实验中最常用的是II型酶，且是那些识别4个或6个碱基对
2. 分子克隆及相关试验技术 2 分子生物学实验技术 2.1分子克隆及相关实验技术 2.1.1 分子克隆 2.1.2 引物设计 2.1.3 Gibson assembly 2.1.4 质粒抽提 2.1.5 化学法E. Coli感受态制备 2.1.6 电转化感受态制备 2.1.7 氯化铷法感受态 2.1.8 Trizol 法提取真核细胞总RNA 2.1.9 体外逆转录 2.1.10 实时荧光定量PCR 2.1.11 基因定点突变 2.1 分子克隆及相关实验技术 2.1.1分子克隆 简介（INTRODUCTION） 完整的分子克隆可以简述为“分→切→接→转→筛→表”六个实验，如上图。PCR、酶切、连 接、转化是传统基因克隆方法获得重组质粒必不可少的步骤。用PCR方法扩增要克隆的目的基因，限 制性内切酶使插入片段和克隆载体之间建立互补配对的碱基序列，再经连接酶的连接反应完成插入 片段和线性载体之间的重组。考虑到重组效率，通常要先将连接的产物转化到用于扩增质粒的克隆 大肠杆菌感受态细胞中，进一步筛选正确的重组子。 PCR：即多聚酶链式反应。它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是 生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。反应过程分为三步：变 性，退火，延伸。变性：双链DNA解旋形成单链。退火：特定引物与DNA单链模板结合。延伸：从 5’端向3’端延伸。 酶切：限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异性位点上，并切割双链DNA。分子克隆实验中最常用的是Ⅱ型酶，且是那些识别4个或6个碱基对
的限制性内切酶。IⅡI型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序。切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。连接：DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5-P末端与3-OH间形成3'.5-磷酸二酯键。一个DNA片段的5'-P末端与另一个3-OH末端相靠时互近，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。常用的DNA连接酶是T4DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平未端。转化：体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌放入0C的CaCI2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42C热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基培养几小时，细胞得以恢复和增殖，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。材料（MATERIALS）口PCR试剂核酸模板、引物（1OμM，上下游引物）dNTPsMix、MgCI2、DNA聚合酶、HF或GCbuffer、DMSO、ddH20口酶切试剂限制性核酸酶切酶比如SalIHF、NotIHF、酶切buffer4、insertorvector口连接试剂T4DNA连接酶、10xT4DNA连接酶buffer口转化试剂感受态细胞（如DH5α、TOP10）、抗性LB平板、无菌无抗的SOC或LB培养基实验步骤（PROCEDURE）PCR部分：1.建立PCR反应体系（以Pfu-XIDNA聚合酶为例）试剂20 μL50 μL4 μL10 μL5xHF/GCBuffer10xdNTP(2.5mMeach)2 μL5 μL50mMMgCl20-0.2 μL0.5 μL0.2 μLPfu-XI polymerase0.2-0.5μLPrimers0.5μL+0.5μL1 μL+1 μL0.1-1 μLDNAtemplate0.1-1 μLDMSO*（一般不加）0.2 μL0.5 μLddH20Add to 20 μLAdd to50 μL选择薄壁的PCR管，按照上述体积系数，将上述物质依次加入混匀。关键步骤：酶催化反应通常最后加入酶，并冰上操作：DMSO能够减少模版二级结构，从而促进引物与模板的结合，但也会增加突变的概率；在执行PCR扩增程序时，最好每管20~50μL，过大的体积会使PCR仪中的反应溶液的温度变化的均一性降低，反应条件不准确；具体情况具体分析。2.建立PCR反应程序（以PfuDNA聚合酶为例）Pfu-XIDNA聚合酶常用的PCR扩增程序预变性98°℃ 1~5min变性98°℃10s28~35个循环退火62°℃10s延伸72°℃1kb/15~30s再延伸72℃5min保温12°℃10min
的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序。切割后得到的是带粘性末端 或平末端的线性DNA。 连接：DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个 DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相靠时互近，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在 的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是 双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。 转化：体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后， 才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或 纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌 放入0 °C的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42 °C热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适 的（筛选）培养基培养几小时，细胞得以恢复和增殖，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条 件可以区分转化细胞和非转化细胞。 材料（MATERIALS） r PCR试剂 核酸模板、引物（10 μM，上下游引物）、dNTPs Mix、MgCl2、DNA聚合酶、HF或GC buffer、 DMSO、ddH2O r 酶切试剂 限制性核酸酶切酶比如Sal I HF、Not I HF、酶切buffer 4、insert or vector r 连接试剂 T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶buffer r 转化试剂 感受态细胞（如DH5α、TOP10）、抗性LB平板、无菌无抗的SOC或LB培养基 实验步骤（PROCEDURE） PCR部分： 1.建立PCR反应体系（以Pfu-XI DNA聚合酶为例） 试剂 20 μL 50 μL 5×HF/GC Buffer 4 μL 10 μL 10×dNTP （2.5 mM each） 2 μL 5 μL 50 mM MgCl2 0-0.2 μL 0.5 μL Pfu-XI polymerase 0.2 μL 0.2-0.5 μL Primers 0.5 μL+0.5 μL 1 μL+1 μL DNA template 0.1-1 μL 0.1-1 μL DMSO*（一般不加） ddH2O 0.2 μL Add to 20 μL 0.5 μL Add to 50 μL 选择薄壁的PCR管，按照上述体积系数，将上述物质依次加入混匀。 ▲关键步骤： 酶催化反应通常最后加入酶，并冰上操作；DMSO能够减少模版二级结构，从而促进引物与模板的 结合，但也会增加突变的概率；在执行PCR扩增程序时，最好每管20~50 μL，过大的体积会使PCR 仪中的反应溶液的温度变化的均一性降低，反应条件不准确；具体情况具体分析。 2.建立PCR反应程序（以Pfu DNA聚合酶为例） Pfu-XI DNA聚合酶常用的PCR扩增程序 预变性 98 °C 1~5 min 28~35个循环 变性 98 °C 10 s 退火 62 °C 10 s 延伸 72 °C 1 kb/15~30 s 再延伸 72 °C 5 min 保温 12 °C 10 min
选择合适的琼脂糖凝胶浓度及合适大小的DNAMarker。4.PCR产物纯化回收若条带产物较纯，推荐用PCR产物回收试剂盒回收，若条带较杂可用胶回收。操作步骤见试剂盒说明书。酶切部分：1.建立酶切体系：2.插入片段的酶切体系：插入片段可以是已经纯化回收的PCR产物或含有插入片段的质粒。以SalI/NotI系列的内切酶为例，酶切PCR产物的体系如下：PCR products1~2 μg10xbuffer310 μLSal I0.5 μLNot I0.5 μLH20Addto50μL放置于37C水浴锅，反应2~3h。注意事项JBy definition, 1 U restriction enzyme can cleave 1 μg DNA plasmid in I hour.Sal I, Sal I HF, Not I HF is20U/μL, which means in most cases, 0.5μLor10U ismore than enough选择合适的内切酶和该酶所对应的特定的酶切buffer，每种内切酶都有其高效反应buffer。如果不清楚双酶切的共用buffer时，建议去NEB官网查下具体的酶切信息http://nebbuffer：有些内切酶的反应可能要求加入BSA（胎牛血清中的一种球蛋白：牛血清白蛋白，是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附），是否添加可在NEB官网查到：刀严格控制酶切体系中的甘油浓度在10%以下，否则容易出现酶切的“星活性”现象，即酶切的专一性被放宽，酶切“序列识别”的严谨度下降（比如从严格识别的6个碱基才能酶切到只要识别4个相似碱基时就可以切割），不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点，出现乱切现象。乱切原因：a.低盐浓度（pH8.0）：c.存在有机溶剂（如DMSO、乙醇乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）；d.用其他二价离子替代镁离子（如Mn，Cu,Co，Zn等）。乱切解决办法：a.尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；b.尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；c.将离子浓度提高到100~150mM（若酶活性不受离子强度影响)。3.酶切产物回收酶切产物试剂盒回收法或琼脂糖凝胶胶回收方法4.克隆载体酶切效果检测（可选步骤）：酶切后的载体和完整载体分别转化，对比转化结果。连接部分：1.建立连接反应体系：典型的体系为10μL反应体系（以T4ligase&10xligationbuffer为例）T4ligase10μL反应体系Insert(015×610×条带大小)+（1000×）μLVector0.015×610×条带大小+(1000×）μL10xligationbuffer1 μLT4 ligase1 μLH20Addto10μuL
▲关键步骤： ♫不同的DNA聚合酶有不同的效率：Pfu-XI：1 kb/20 sec，Taq：1 kb/1 min； ♫ 若是以菌落或菌液为模板，预变性时间可适当提高至3-5 min； 3.琼脂糖凝胶电泳实验鉴定 PCR 结果 ▲选择合适的琼脂糖凝胶浓度及合适大小的DNA Marker。 4.PCR 产物纯化回收 若条带产物较纯，推荐用PCR产物回收试剂盒回收，若条带较杂可用胶回收。操作步骤见试剂盒 说明书。 酶切部分： 1.建立酶切体系： 2.插入片段的酶切体系：插入片段可以是已经纯化回收的 PCR 产物或含有插入片段的质粒。以Sal I /Not I 系列的内切酶为例，酶切 PCR 产物的体系如下： PCR products 1~2 μg 10× buffer 3 10 μL Sal I 0.5 μL Not I H2O 0.5 μL Add to 50 μL 放置于37 °C水浴锅，反应2~3 h。 ▲注意事项 ♫ By definition, 1 U restriction enzyme can cleave 1 μg DNA plasmid in 1 hour. Sal I, Sal I HF, Not I HF is 20 U/μL, which means in most cases, 0.5 μL or 10 U is more than enough. ♫ 选择合适的内切酶和该酶所对应的特定的酶切buffer，每种内切酶都有其高效反应buffer。如果不 清楚双酶切的共用buffer时，建议去NEB官网查下具体的酶切信息http://nebbuffer； ♫ 有些内切酶的反应可能要求加入BSA（胎牛血清中的一种球蛋白：牛血清白蛋白，是酶的稳定 剂，防止酶的分解和非特异性吸附），是否添加可在NEB官网查到； ♫ 严格控制酶切体系中的甘油浓度在10%以下，否则容易出现酶切的“星活性”现象，即酶切的专 一性被放宽，酶切“序列识别”的严谨度下降（比如从严格识别的6个碱基才能酶切到只要识别4个 相似碱基时就可以切割），不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点，出现乱 切现象。 ♫ 乱切原因：a.低盐浓度（pH 8.0）；c.存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、 乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）；d.用其他二价离子替代镁离子（如 Mn，Cu，Co，Zn 等）。 ♫ 乱切解决办法：a. 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓 度；b.尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；c.将离子浓度提高到100~150 mM (若酶 活性不受离子强度影响)。 3. 酶切产物回收 酶切产物试剂盒回收法或琼脂糖凝胶胶回收方法 4.克隆载体酶切效果检测（可选步骤）：酶切后的载体和完整载体分别转化，对比转化结果。 连接部分： 1. 建立连接反应体系：典型的体系为10 μL反应体系（以T4 ligase & 10×ligation buffer为例） T4 ligase 10 μL反应体系 Insert μL Vector μL 10×ligation buffer 1 μL T4 ligase H2O 1 μL Add to 10 μL
冰上操作，将上述物质加到PCR管中混匀，放置16C或室温反应过夜（8~12h）。为减少蒸发建议使用PCR管。关键步骤：载体酶切的质量是连接成功的关键。连接前要确保载体的酶切效果和浓度；连接体系以小体积建立，以增加分子碰撞的机会；合适的insert：vector比值对连接反应的成功贡献巨大。体积比例的设置依据各物质量比（和insert的大小和浓度相关），insert不低于0.3pmol。体积比值一般选择在1：1到1：8之间，增加insert的量主要是减少载体自连。NEB计算连接反应物质浓度：http://nebiocalculator.neb.com/#/dsdnaamt转化部分：1.从-80C取出感受态细胞放在冰上溶解（大约5min）。做好标记，建议同时取一管感受态细胞做空白对照；2.从4C冰箱取出抗性平板和SOC（根据连接的载体的抗性选择抗性筛选的LB平板），倒置平放在37°C恒温培养箱中孵育备用。设置水浴锅温度为42℃C；3.待感受态细胞的最后一粒冰融化时，取连接反应产物的一半（5uL）转到50L的感受态细胞中，指肚轻弹几下EP管底部混匀。冰上放置20~30min；4.轻轻取出转化管固定在浮板上，42°C热激45~90s。将EP管的1/2或2/3没于水中，定好闹钟。（60s通常是理想的热激时间，热激时间取决于所使用的感受态细胞）；5.冰上放置2~10min，再室温放置2min；6.超净台中取500uL无抗无菌的LBorSOC培养基，37°C摇床摇60min复苏细胞（将EP管倾斜45度放置，注意时间不要超过三个小时，此时杂菌可能成为优势菌）；7.4000rpm离心5min，取出37°C孵育的抗性平板并做好标记（质粒名称、抗性、感受态细胞名称、日期、姓名），在无菌操作台中倒掉离心后的上清至100-200证，重悬细胞，全部涂布到平板中（涂棒在使用前后在酒精灯外焰干烧一会儿以达到无菌，无菌玻璃珠用前用后要专门分开放置）；8.平板先正置放置在37C恒温培养箱放置10min，使菌液凝在培养基上（可选步骤）；9.将平板倒置放置在37°C恒温培养箱。培养16h（一般14~18个小时都正常，24小时后就会杂菌蔓延）。<关键步骤：转化最好做阴性（如感受态细胞、无抗培养基）或和“假阳性”（如空载体）对照，以确保转化操作是Work的，试剂也是可行的，如感受态、SOC/LB、抗性平板等：日对于特别大的质粒可以用电转化的方法，但一般很少用到，此处不作介绍：口因为转化后的培养时间较长，建议转化操作选在一天的下午进行，这样便于第二天上午观察检测结果。2.1.2引物设计简介（INTRODUCTION）引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸出发点而起作用的多核苷酸链。通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。以目的基因为模板设计一对特异寡核苷酸引物，从而进行DNA的体外合成反应。在引物的3'-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3-OH，必须是游离的。PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个目标上取得平衡。基本原则（PRINCIPLE）1.引物长度一般引物长度为18~30碱基。确保退火温度不低于54C的最短的引物可获得最好的效率和特异性。每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。另外引物太长，PCR的最适延伸温度会超过聚合酶的最佳作用温度（70℃），从而降低产物的特异性。2.GC含量
冰上操作，将上述物质加到PCR管中混匀，放置16 °C或室温反应过夜（8~12 h）。为减少蒸发， 建议使用PCR管。 ▲关键步骤： 载体酶切的质量是连接成功的关键。连接前要确保载体的酶切效果和浓度；连接体系以小体积建 立，以增加分子碰撞的机会；合适的insert ：vector比值对连接反应的成功贡献巨大。体积比例的设 置依据各物质量比（和insert的大小和浓度相关），insert不低于0.3 pmol。体积比值一般选择在1：1 到 1 ： 8 之 间 ， 增 加 insert 的 量 主 要 是 减 少 载 体 自 连 。 NEB 计 算 连 接 反 应 物 质 浓 度 ： http://nebiocalculator.neb.com/#!/dsdnaamt 转化部分： 1.从-80 °C取出感受态细胞放在冰上溶解（大约5 min）。做好标记，建议同时取一管感受态细胞做空 白对照； 2.从4 °C冰箱取出抗性平板和SOC（根据连接的载体的抗性选择抗性筛选的LB平板），倒置平放在 37 °C恒温培养箱中孵育备用。设置水浴锅温度为42 °C； 3.待感受态细胞的最后一粒冰融化时，取连接反应产物的一半（5 μL）转到50 μL的感受态细胞中， 指肚轻弹几下EP管底部混匀。冰上放置20~30 min； 4. 轻轻取出转化管固定在浮板上，42 °C热激45~90 s。将EP管的1/2或2/3没于水中，定好闹钟。（60 s通常是理想的热激时间，热激时间取决于所使用的感受态细胞）； 5.冰上放置2~10 min，再室温放置2 min； 6.超净台中取500 μL无抗无菌的LB or SOC培养基，37 °C摇床摇60 min复苏细胞（将EP管倾斜45度 放置，注意时间不要超过三个小时，此时杂菌可能成为优势菌）； 7.4000 rpm离心5 min，取出37 °C孵育的抗性平板并做好标记（质粒名称、抗性、感受态细胞名称、 日期、姓名），在无菌操作台中倒掉离心后的上清至100−200 μL，重悬细胞，全部涂布到平板中 （涂棒在使用前后在酒精灯外焰干烧一会儿以达到无菌，无菌玻璃珠用前用后要专门分开放置）； 8.平板先正置放置在37 °C恒温培养箱放置10 min，使菌液凝在培养基上（可选步骤）； 9.将平板倒置放置在37 °C恒温培养箱。培养16 h（一般14~18个小时都正常，24小时后就会杂菌蔓 延）。 ▲关键步骤： ♫ 转化最好做阴性（如感受态细胞、无抗培养基）或和“假阳性”（如空载体）对照，以确保转化 操作是work的，试剂也是可行的，如感受态、SOC/LB、抗性平板等； ♫ 对于特别大的质粒可以用电转化的方法，但一般很少用到，此处不作介绍； ♫ 因为转化后的培养时间较长，建议转化操作选在一天的下午进行，这样便于第二天上午观察检测 结果。 2.1.2 引物设计 简介（INTRODUCTION） 引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸出发点 而起作用的多核苷酸链。通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。以目的基因为模板 设计一对特异寡核苷酸引物，从而进行DNA的体外合成反应。在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形 式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个 目标上取得平衡。 基本原则（PRINCIPLE） 1. 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。确保退火温度不低于54 °C的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度 的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成 供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。另外引物太长，PCR的最适延伸温度会超过聚合酶 的最佳作用温度（70 °C），从而降低产物的特异性。 2. GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5”端加适量的A、T或G、C尾巴，并且相应的减少或增加引物的长度。3.退火温度（Tm值）一定盐浓度条件下，50°C寡核苷酸双链解链的温度。Tm值计算网站链接见附录。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10°C。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4~6°C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55~75℃间变化。4.模板的二级结构区域对于RT-PCR或Q-RT-PCR的引物设计，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。但是对于蛋白的克隆表达，有时候必须要选择到二级结构区域作为模板，故酌情选择。5.引物的位置（主要针对RT-PCR或Q-RT-PCR检测引物的设计引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。6.引物自身的检查表达1）引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，特别是引物的未端应避免回文结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。2)上下游引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。3）3未端：引物3”端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3”端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3端也不能形成任何二级结构和不能发生错配。如扩增编码区域，引物3，端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。如果可能的话，每个引物的3”末端碱基应为G或C。4）5'端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等：引入蛋白质结合DNA序列：引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。实验步骤（PROCEDURE）1.在NCBI（PUBMED）上搜索目的基因，找到该基因的mRNA序列，在CDS选项中，找到编码区所在位置，复制到SeBuilder建立序列文件。·对于RT-PCR和Q-RT-PCR所需的鉴定引物，建议用PrimerPremier5搜索最佳打分引物。即Tm值在55~70C之间，GC%含量在45~55%之间，上下游引物Tm相差2C以下，并且不存在发卡、二聚体、引物间交叉二聚体和错配等二级结构。·对于蛋白的克隆表达所需引物：Full-length蛋白的克隆，老老实实按照ATG·TAA起始密码子和终于密码子全部扩增出来。2.设计PCR引物时需要在酶切位点序列的外侧添加保护碱基以提高酶切时的活性。实验室常用保护碱基为：GTC、CTA针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.引物纯化主要方式：无特殊实验要求，克隆实验一般推荐RPC纯化方式。2.一般默认模板序列排列方式是5-3'为主链，因此上游引物与模板是一致的，而下游引物是与模板序列反向互补的序列，在复制设计好的引物时切忌检查。本实验常用软件SeqBuilder里，标记引物使用filledarrow，方便于将设计好的引物直接复制粘贴。3.设计的引物太短，特异性降低；引物太长，影响产物的生成。建议结合引物序列GC含量和Tm值，选择最适的长度。值得注意的是引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分，不包括为后续克
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严 重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，并且相应的减少或增加引物 的长度。 3. 退火温度（Tm值） 一定盐浓度条件下，50 °C寡核苷酸双链解链的温度。Tm值计算网站链接见附录。PCR扩增中的复 性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10 °C。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度， 这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。 一对引物的退火温度相差4~6 °C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样 的，可以在55~75 °C间变化。 4. 模板的二级结构区域 对于RT-PCR或Q-RT-PCR的引物设计，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算 机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。但是对于蛋白的克隆表达，有时 候必须要选择到二级结构区域作为模板，故酌情选择。 5. 引物的位置（主要针对RT-PCR或Q-RT-PCR检测引物的设计 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组 的非特异结合，提高反应的特异性。若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的 编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生 的产物在大小上相区别。 6. 引物自身的检查表达 1) 引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，特别是引物 的末端应避免回文结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判 断，引物自身连续互补碱基不能大于3 bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3’端的互补重 叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 2) 上下游引物的互补性：一个引物的3’末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 3) 3’末端：引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续 的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3’端也不能形成任何二级结构和不能发生错 配。如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响 扩增特异性与效率。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基应为G或C。 4) 5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括： 加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物 二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 在NCBI（PUBMED）上搜索目的基因，找到该基因的mRNA序列，在CDS选项中，找到编码区所 在位置，复制到Seq Builder建立序列文件。 对于RT-PCR和Q-RT-PCR所需的鉴定引物，建议用Primer Premier5搜索最佳打分引物。即Tm 值在55~70 °C之间，GC%含量在45~55%之间，上下游引物Tm相差2 °C以下，并且不存在发 卡、二聚体、引物间交叉二聚体和错配等二级结构。 对于蛋白的克隆表达所需引物：Full-length蛋白的克隆，老老实实按照ATG.TAA起始密码子 和终于密码子全部扩增出来。 2. 设计PCR引物时需要在酶切位点序列的外侧添加保护碱基以提高酶切时的活性。实验室常用保护 碱基为：GTC、CTA 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 引物纯化主要方式：无特殊实验要求，克隆实验一般推荐RPC纯化方式。 2. 一般默认模板序列排列方式是5′-3′为主链，因此上游引物与模板是一致的，而下游引物是与模板 序列反向互补的序列，在复制设计好的引物时切忌检查。本实验常用软件Seq Builder里，标记引物使 用filled arrow，方便于将设计好的引物直接复制粘贴。 3. 设计的引物太短，特异性降低；引物太长，影响产物的生成。建议结合引物序列GC含量和Tm 值，选择最适的长度。值得注意的是引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分，不包括为后续克
降而添加的酶切位点以及额外保护碱基序列。4.引物的3”末端的第一和第二个碱基影响DNA聚合酶的延伸效率，故其影响PCR反应的扩增效率和特异性。建议引物3’末端选择G或C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。5.引物使用浓度：建议0.1~1.0μM，默认是1μM。浓度太高会导致错配、引物二聚体增加；浓度太低导致PCR效率降低。2.1.3Gibson assembly简介（INTRODUCTION）Gibsonassembly是一种onestep，onepot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15~60min就可以得到组装好的DNA。H装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5exonuclease），高保真DNA聚合酶（Phusionpolymerase）和耐热DNA连接酶（TaqDNAligase）的共同作用。首先，T5核酸外切酶消化DNA片段的方向是从5”端到3”端。每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火后，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。最近我们实验室所使用的是5×T5试剂（里面只有一种T5exonuclease外切酶，没有其他组分），依靠细菌自身的重组能力进行重组转化克隆。下面是组装的示意图。最近文献和我们的结果显示，只采用T5exonuclease一种酶，等DNA退火后，可以直接转化入感受态细胞，利用细胞内DNA修复机制修复，从而复制完整双链质粒。这种方案效率更好，但是不能用电转法。材料（MATERIALS)口试剂（REAGENTS）NAD，H2O，1MMgCl2，1MDTT,10mMdNTPmix，1MTris-HClpH7.5，50%PEG-8000,2.7mg/mLTagligase，0.85μg/mLT5_ExO，Phusion（1×）、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）口实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。加入量4xisothermalassemblybufferNAD20 mgH20300 μL1 M MgCl2300μL1MDTT300μL10 mM dNTP mix600 μL
隆而添加的酶切位点以及额外保护碱基序列。 4. 引物的3’末端的第一和第二个碱基影响DNA聚合酶的延伸效率，故其影响PCR反应的扩增效率和 特异性。建议引物3’末端选择G或C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。 5. 引物使用浓度：建议0.1~1.0 μM，默认是1 μM。浓度太高会导致错配、引物二聚体增加；浓度太 低导致PCR效率降低。 2.1.3 Gibson assembly 简介（INTRODUCTION） Gibson assembly是一种one step，one pot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种 酶混合在同一个管内在50 °C下培养15~60 min就可以得到组装好的DNA。 装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5 exonuclease），高 保真DNA聚合酶（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。首先， T5核酸外切酶消化DNA片段的方向是从5’端到3’端。每个DNA片段分别形成一个单链的突出部 分，由于这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火后，互补的序列 重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3’方向将对应的脱氧 核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重 叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。最近我们实验室所使用的是5×T5试剂（里面只有一 种T5 exonuclease外切酶，没有其他组分），依靠细菌自身的重组能力进行重组转化克隆。下面是组 装的示意图。最近文献和我们的结果显示，只采用T5 exonuclease一种酶，等DNA退火后，可以直接 转化入感受态细胞，利用细胞内DNA修复机制修复，从而复制完整双链质粒。这种方案效率更好， 但是不能用电转法。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） NAD，H2O，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000， 2.7 mg/mL Tag ligase，0.85 μg/mL T5_ExO，Phusion（1×）、LB培养基、抗生素（据载体而 定）、LB平板（相应抗性） r 实验前准备（SETUP） 于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。 4x isothermal assembly buffer 加入量 NAD 20 mg H2O 300 μL 1 M MgCl2 300 μL 1 M DTT 300 μL 10 mM dNTP mix 600 μL
3 mL1 M Tris-HCI pH 7.53 mL50%PEG-8000加水到7.5mL，每管分500uL存于-20°C或-80C冰箱，够3000个反应。加入量2x assembly mix: best combination:1 mL100reaction10 μL2.7 mg/mL Tag ligase100 μL0.85 μg/ mL T5_ExO25 μLPhusion(1x)500 μL4xisothermal assemblebuffer加水365μL，存于-20C冰箱，有效期1年。实验步骤（PROCEDURE）1.设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40bp，同时要求这部分对应的退火温度高于50℃。2.进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收，或者PCR产物回收试剂盒回收。3.进行重组反应，以20反应体系为例：组分加入量10 μLIsothermal assembly Master Mix线性化载体10~100 ng (1~2 μL)插入片段8~9μL（3~5倍载体）补足至20μLSterilized ddH2050C反应15~60min。4.转化10uL的重组反应产物，涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。针对性建议1.线性化载体的制备有两种，第一种是使用内切酶对克隆载体进行酶切，此方法的优点是载体的突变率较低，高保真，但缺点是酶切不完全会使假阳性克隆空载体的出现影响单克隆的鉴定。第二种是反向PCR扩增制备线性化克隆载体，再采用胶回收或者DpnI消化以去除环状载体质粒模板的影响，此方法的优点是假阳性克隆较少，但缺点是因PCR扩增的条带较长，突变的概率也会相应增加。2.在进行DNA纯化时，PCR产物最好进行琼脂糖电泳，然后进行胶回收以去除PCR扩增时加入环状质粒模板对克隆鉴定的影响。3.在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20bp区域内GC含量均在40%60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。4.Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性未端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响，优点是可以同时进行多个片段的组装克隆。5.在进行重组反应时，载体用量一般在50~100ng较好，载体和片段的摩尔比为1：1至1：3，当片段小于200bp时，片段的用量可增加到载体的5倍量。6.50℃C反应的时间最好不要超过60分钟。2.1.4质粒抽提-大抽简介（INTRODUCTION）本方法使用QIAGEN（德国凯杰）质粒提取试剂盒。QIAGEN-tips内独特的阴离子交换树脂专为纯化核酸设计。它独特的分离特性，使纯化的DNA的纯度相当于连续2次CsCI梯度离心得到的DNA纯
1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL 50% PEG-8000 3 mL 加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20 °C或-80 °C冰箱，够3000个反应。 2× assembly mix: best combination: 加入量 100 reaction 1 mL 2.7 mg/mL Tag ligase 10 μL 0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μL Phusion（1×） 25 μL 4× isothermal assemble buffer 500 μL 加水365 μL，存于-20 °C冰箱，有效期1年。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为15-40 bp，同时要求这部分对应的退火温度高于50 °C。 2. 进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收，或者PCR产物回收试剂盒回收。 3. 进行重组反应，以20 μL反应体系为例： 组分 加入量 Isothermal assembly Master Mix 10 μL 线性化载体 10~100 ng（1~2 μL） 插入片段 8~9 μL （3~5倍载体） Sterilized ddH2O 补足至20 μL 50 °C反应15~60 min。 4. 转化10 μL的重组反应产物，涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。 针对性建议 1. 线性化载体的制备有两种，第一种是使用内切酶对克隆载体进行酶切，此方法的优点是载体的突 变率较低，高保真，但缺点是酶切不完全会使假阳性克隆空载体的出现影响单克隆的鉴定。第二种 是反向PCR扩增制备线性化克隆载体，再采用胶回收或者Dpn I消化以去除环状载体质粒模板的影 响，此方法的优点是假阳性克隆较少，但缺点是因PCR扩增的条带较长，突变的概率也会相应增 加。 2. 在进行DNA纯化时，PCR产物最好进行琼脂糖电泳，然后进行胶回收以去除PCR扩增时加入环状 质粒模板对克隆鉴定的影响。 3. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50 bp内有重复序列的区域。当克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于 70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。 4. Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200 bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性末端形 成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响，优点是可以同时进行多个 片段的组装克隆。 5. 在进行重组反应时，载体用量一般在50~100 ng较好，载体和片段的摩尔比为1：1至1：3，当片段 小于200 bp时，片段的用量可增加到载体的5倍量。 6. 50 °C反应的时间最好不要超过60分钟。 2.1.4 质粒抽提-大抽 简介（INTRODUCTION） 本方法使用QIAGEN（德国凯杰）质粒提取试剂盒。QIAGEN-tips内独特的阴离子交换树脂专为 纯化核酸设计。它独特的分离特性，使纯化的DNA的纯度相当于连续2次CsCl梯度离心得到的DNA纯
度。预装的QIAGEN-tips利用重力流原理工作，缩短了纯化质粒的手动操作时间。整套QIAGEN质粒纯化体系避免使用苯酚、氯仿、漠化乙锭和CsCI等有毒物质，减小对使用者和环境的危害。应用：QIAGENPlasmidKits纯化得到的质粒DNA适合多种应用，如：转染、克隆、PCR、体外转录。实验步骤（PROCEDURE）1.细菌培养物的生长挑取单菌落接种到2~5mL含有适当抗生素的LB液体培养基，37°C，200rpm/h的摇床中振荡8小时。用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。高拷贝质粒用100~200μL含菌落液体培养基接种到100mLLB培养基中；低拷贝质粒用250~500μL含菌落培养基接种到250~1000mLLB培养基，37°C，200rpm/h的摇床中振荡12~16小时。2.细菌的收获和裂解3000g，4℃离心15min收获细菌。加入20mLBufferP1重悬细菌，后分到两个50mL离心管。再各添加10mLBufferP2，剧烈晃动离心管4~6次使其彻底混匀，室温放置5min裂解。然后各加入10mLBufferP3到此溶菌产物中，晃动离心管4~6次混匀。冰育15~20min，中和碱。4000rpm，4C离心30min。将上清液倒入针口密封的过滤器中，打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将上清液过滤到一新的50mL离心管中。再一次去除细胞渣淬。3.质粒DNA的纯化1）将QIAGEN-tip500的柱子挂在一个接废液容器上，加10mLBufferQBT，让管中溶液滴下排空，润洗。2）将第6步上清液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下，用废液容器接废液。3）用2×30mLBufferQC洗QIAGEN-tip柱。4）再用15mLBufferQE洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液洗脱。5）加入10.5mL异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。6000g，4C用尖底管离心30min，离心后小心倒出上清液，倒扣管子。6）37℃C烘干离心管底部的质粒5~10min；用500μL无内毒素的BufferEB（小抽Kit中有）重新溶解DNA。2.1.5化学法E.Coli感受态制备简介（INTRODUCTION）在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建重组质粒过程中，由于缺乏转移所必需的mob基因，重组质粒一般不能自主进入受体菌，而是需要帮助才能穿过细胞膜进入细胞内，随着受体菌的生长、增殖，重组质粒才得以复制、扩增。1972年Cohen等人采用CaCl2处理大肠埃希菌细胞，发现其能作为一个很好的受体有效接受外源质粒DNA。CaCI2制备感受态细胞的方法具有操作简单、重复性好、转化率高等优点。在这种化学方法中，低温和钙离子的主要作用是破坏细胞膜上的脂质阵列，细菌在CaCI2低渗溶液中膨胀为球形，转化混合物中的DNA形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42°C热休克后促使细胞吸收外源DNA。在丰富培养基中生长后，细胞复原并分裂增殖，重组质粒中的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上即可筛选所需要的转化子。除了CaCl2法之外，还有RbCI（KCI）法制备感受态细胞，RbCl（KCI）法制备的感受态细胞转化效率较高，我们实验室常用TB法制备感受态细胞，这种方法是在CaCI2法的基础上进行了一些改进，将CaCl2溶液换成TB溶液，将LB培养基换成SOB++培养基，将摇菌温度改为18C，冻存时将15%甘油换成7%DMSO，可以更好地提高感受态细胞的效率。我们实验室常用的感受态菌株主要有DH5α、BL21、Rosetta、DH10Bac，其中DH5α用于基因克隆，BL21、Rosetta用于原核表达，DH10Bac用于昆虫表达中Bacmid的制备。下面以摇500mLDH5α菌液，最终制备20mLDH5α感受态细胞为例。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）
度。预装的QIAGEN-tips利用重力流原理工作，缩短了纯化质粒的手动操作时间。整套QIAGEN质粒 纯化体系避免使用苯酚、氯仿、溴化乙锭和CsCl等有毒物质，减小对使用者和环境的危害。 应用：QIAGEN Plasmid Kits纯化得到的质粒DNA适合多种应用，如：转染、克隆、PCR、体外转 录。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 细菌培养物的生长 挑取单菌落接种到2~5 mL含有适当抗生素的LB液体培养基，37 °C，200 rpm/h的摇床中振荡8小 时。用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。高拷贝质粒用100~200 μL含菌落液 体培养基接种到100 mL LB培养基中；低拷贝质粒用250~500 μL含菌落培养基接种到250~1000 mL LB培养基，37 °C，200 rpm/h的摇床中振荡12~16小时。 2.细菌的收获和裂解 3000 g，4 °C离心15 min收获细菌。加入20 mL Buffer P1重悬细菌，后分到两个50 mL离心管。再 各添加10 mL Buffer P2，剧烈晃动离心管4~6次使其彻底混匀，室温放置5 min裂解。然后各加入 10 mL Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4~6次混匀。冰育15~20 min，中和碱。4000 rpm，4 °C离心30 min。将上清液倒入针口密封的过滤器中，打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将上清液 过滤到一新的50 mL离心管中。再一次去除细胞渣滓。 3.质粒DNA的纯化 1) 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在一个接废液容器上，加10 mL Buffer QBT，让管中溶液滴下排 空，润洗。 2) 将第6步上清液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下，用废液容器接废液。 3) 用2×30 mL Buffer QC 洗QIAGEN-tip柱。 4) 再用15 mL Buffer QF 洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液洗脱。 5) 加入10.5 mL异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。6000 g，4 °C用尖底管离心30 min， 离心后小心倒出上清液，倒扣管子。 6) 37 °C烘干离心管底部的质粒5~10 min；用500 μL无内毒素的Buffer EB（小抽Kit中有）重新溶 解DNA。 2.1.5 化学法E. Coli感受态制备 简介（INTRODUCTION） 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建重组质粒过程 中，由于缺乏转移所必需的mob基因，重组质粒一般不能自主进入受体菌，而是需要帮助才能穿过细 胞膜进入细胞内，随着受体菌的生长、增殖，重组质粒才得以复制、扩增。 1972年Cohen等人采用CaCl2处理大肠埃希菌细胞，发现其能作为一个很好的受体有效接受外源质 粒DNA。CaCl2制备感受态细胞的方法具有操作简单、重复性好、转化率高等优点。在这种化学方法 中，低温和钙离子的主要作用是破坏细胞膜上的脂质阵列，细菌在CaCl2低渗溶液中膨胀为球形，转 化混合物中的DNA形成羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42 °C热休克后促使细胞吸收外源 DNA。在丰富培养基中生长后，细胞复原并分裂增殖，重组质粒中的基因在被转化的细菌中得到表 达，在选择性培养基平板上即可筛选所需要的转化子。 除了CaCl2法之外，还有RbCl（KCl）法制备感受态细胞，RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化 效率较高，我们实验室常用TB法制备感受态细胞，这种方法是在CaCl2法的基础上进行了一些改进， 将CaCl2溶液换成TB溶液，将LB 培养基换成SOB++培养基，将摇菌温度改为18 °C，冻存时将15％甘 油换成7％DMSO，可以更好地提高感受态细胞的效率。 我们实验室常用的感受态菌株主要有DH5α、BL21、Rosetta、DH10Bac，其中DH5α用于基因克 隆，BL21、Rosetta用于原核表达，DH10Bac用于昆虫表达中Bacmid的制备。 下面以摇500 mL DH5α菌液，最终制备20 mL DH5α感受态细胞为例。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS）
无抗LB平板：20g/L蛋白陈、5g/L酵母提取物、5g/LNaCl、15g/L琼脂糖5mLLB培养基：20g/L蛋白陈、5g/L酵母提取物、5g/LNaCIDMSO1MMgCl2溶液（无菌）1MMgMgSO4溶液（无菌）500mLSOB++培养基：20g/L蛋白陈、5g/L酵母提取物、0.5g/LNaCl、0.186g/LKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4（先将其他成分配好，高压蒸汽灭菌后再加入无菌的MgCl2和MgSO4）120mLTB溶液：10mMHEPES（pH6.7）、15mMCaCl2、55mMMnCl2、250mMKCl（先将除MnCl2外的其他成分配置好，使用KOH将pH调至6.7，加入MnCl2后再使用0.22μm的滤膜过滤除菌）口实验前准备（SETUP）500mL离心瓶5mL枪头50mL离心管0.22μm滤膜一次性注射器适量1.5mLEp管口器械（EQUIPMENT）分液器、移液器分析天平、pH计超净工作台、摇床Thermo落地式离心机（使用前预冷至4C）实验步骤（PROCEDURE）活化DH5α细胞预计消耗时间：40min（Day1）1.将超净工作台提前用紫外照射30min，将无抗LB平板提前放入37C培养箱孵育。2.从-80C冰箱迅速取出保藏的DH5α菌种，立即用一次性无菌接种环蘸取菌液，在孵育好的无抗平板上划线。3.37°C培养14~16h。物品准备，高压蒸汽灭菌预计消耗时间：2h（Day2）1.配置所需培养基和溶液，并将培养基、溶液和所需所有物品进行高压蒸汽灭菌。2.预约后面一天的摇床，并提前对摇床进行紫外消毒。DH5α菌液小摇预计消耗时间：40min（Day2）1.将超净工作台提前用紫外照射30min。2.从平板上挑取DH5α单克隆菌落至5mL无抗LB培养基中。3.放入37C摇床过夜摇菌。DH5α菌液大摇预计消耗时间：2~3h（Day3)1.将超净工作台和37°C摇床提前用紫外照射30min。2.按照1：100将5mL菌液加入到500mLSOB++培养基中。3.18℃，220rpm摇菌，期间测量菌液OD600值，直至达到0.5左右。关键步骤：口摇菌大约需要6h。万18°C时细菌生长更缓慢，形成的细胞壁更薄，更有利于吸收外源DNA。37C时每20分钟，细菌增殖一代，OD600值翻倍，可作为参考，估算OD600值。制备DH5α感受态细胞预计消耗时间：2h（Day3）1.以下所有操作均在超净工作台中，且在冰上进行。2.将落地离心机4C预冷，将TB溶液放置于冰上预冷，将500mL离心瓶、1.5mLEp管放入冰箱预冷。3.将菌液转移到500mL离心瓶中，冰上放置10min
无抗LB平板：20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl、15 g/L琼脂糖 5 mL LB培养基：20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl DMSO 1 M MgCl2溶液（无菌） 1 M Mg MgSO4溶液（无菌） 500 mL SOB++培养基：20 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、0.5 g/L NaCl、0.186 g/L KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4（先将其他成分配好，高压蒸汽灭菌后再加入无菌的MgCl2和MgSO4） 120 mL TB溶液：10 mM HEPES（pH 6.7）、15 mM CaCl2、55 mM MnCl2、250 mM KCl（先将 除MnCl2外的其他成分配置好，使用KOH将pH调至6.7，加入MnCl2后再使用0.22 μm的滤膜过滤除 菌） r 实验前准备（SETUP） 500 mL离心瓶 5 mL枪头 50 mL离心管 0.22 μm滤膜 一次性注射器 适量1.5 mL Ep管 r 器械（EQUIPMENT） 分液器、移液器 分析天平、pH计 超净工作台、摇床 Thermo落地式离心机（使用前预冷至4 °C） 实验步骤（PROCEDURE） ► 活化DH5α细胞 ►预计消耗时间：40 min（Day 1） 1.将超净工作台提前用紫外照射30 min，将无抗LB平板提前放入37 °C培养箱孵育。 2.从-80 °C冰箱迅速取出保藏的DH5α菌种，立即用一次性无菌接种环蘸取菌液，在孵育好的无抗平 板上划线。 3.37 °C培养14~16 h。 ► 物品准备，高压蒸汽灭菌►预计消耗时间：2 h（Day 2） 1.配置所需培养基和溶液，并将培养基、溶液和所需所有物品进行高压蒸汽灭菌。 2.预约后面一天的摇床，并提前对摇床进行紫外消毒。 ► DH5α菌液小摇►预计消耗时间：40 min（Day 2） 1. 将超净工作台提前用紫外照射30 min。 2. 从平板上挑取DH5α单克隆菌落至5 mL无抗LB培养基中。 3. 放入37 °C摇床过夜摇菌。 ► DH5α菌液大摇►预计消耗时间：2~3 h（Day 3） 1. 将超净工作台和37 °C摇床提前用紫外照射30 min。 2. 按照1：100将5 mL菌液加入到500 mL SOB++培养基中。 3. 18 °C，220 rpm摇菌，期间测量菌液OD600值，直至达到0.5左右。 ▲ 关键步骤： ♫ 摇菌大约需要6 h。 ♫ 18 °C时细菌生长更缓慢，形成的细胞壁更薄，更有利于吸收外源DNA。 ♫ 37 °C时每20分钟，细菌增殖一代，OD600值翻倍，可作为参考，估算OD600值。 ► 制备DH5α感受态细胞►预计消耗时间：2 h（Day 3） 1. 以下所有操作均在超净工作台中，且在冰上进行。 2. 将落地离心机4 °C预冷，将TB溶液放置于冰上预冷，将500 mL离心瓶、1.5 mL Ep管放入冰箱预 冷。 3. 将菌液转移到500 mL离心瓶中，冰上放置10 min
4.4℃，3000g，10min，离心，彻底弃去上清。5.用100mL冰上预冷的TB溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30min6.4℃，3000g，10min，离心，彻底弃去上清。7.用18.6mL冰上预冷的TB溶液加入1.4mLDMSO，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min。8.将1.5mLEp管依次插到冰上预冷。9.使用分液器以每份100μL将感受态细胞分装到预冷的1.5mLEp管中，迅速扣上管子。10.迅速转移到液氮中冷冻，再转移到-80C中长期保存。A关键步骤：4操作要轻柔且迅速，插管和扣管子可以找人帮忙。分装时，每次吸取菌液前都要轻轻摇匀。效价检测>预计消耗时间：1.5h（Day3）这里使用puc19质粒检测效价，将高浓度的质粒稀释到1ng/μL，0.1ng/μL。①分别将感受态涂布在Amp和Kan抗性平板上，37°C过夜培养污染检取少量感受态细胞加入到LB培养基中，过夜摇菌后涂布在无抗平板测②上，37℃培养，观察是否出现噬菌斑将1μL高浓度未稀释的puc19质粒转化到感受态后，加入900μL无抗LB培养基复苏一个小时后吸取100μL涂布在Amp抗性板上，37C过3夜培养将1μL1ng/μL的puc19质粒转化到感受态后，加入900μL无抗LB培效价检④养基复苏一个小时后吸取100μL涂布在Amp抗性板上，37C过夜培测养将1μL0.1ng/μL的puc19质粒转化到感受态后，加入900μL无抗LB培养基复苏一个小时后吸取100μL涂布在Amp抗性板上，37C过夜5培养若①中未观察到菌落生长，②中未观察到噬菌斑，则说明未检测到污染。转化子总数=菌落数×质粒稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积计算感受态效率的公式为：③中长出来的克隆数×105。一般③长出一百个以上克隆，那么感受态转化效率在7次方以上，单位为克隆数/微克。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.所需实际可以提前配置好高浓度的母液。2.平板划线可以更好地活化细菌，最好不要省略这一步。3.当菌液OD600值接近0.5时，可以根据每隔20min细菌增殖一代，OD值翻倍来估算一下，防止OD600值过高。4.分装时要迅速，分装后立即置于液氮中冷冻，再转移到-80℃C中长期保存。5.若感受态效价较高，可只检测①②③。2.1.6电转化感受态制备简介（INTRODUCTION）电转化（electrotransformation），也有人称作高压电穿孔法（high-voltageelectroproration），简称电穿孔法（electroproration），可用于将DNA导入真核细胞（如动物细胞和植物细胞）和原核细胞（转化大肠杆菌和其他细菌等）。电转化技术的主要优点在于：对于磷酸钙DNA共沉淀法以及其他技术难以转化的细胞，电穿孔法仍可适用。电转化的效率高，既可用于克隆化基因的瞬间表达，也可用于建立整合有外源基因的细胞系。本实验室曾使用电转化构建噬菌体展示文库，因此在电转化大肠杆菌方面积累了一定的经验，下面介绍的是电转化大肠杆菌的步骤。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）甘油，2xTY培养基（每1L中含16g蛋白陈、10g酵母粉和5gNaCI）
4. 4 °C，3000 g，10 min，离心，彻底弃去上清。 5. 用100 mL冰上预冷的TB溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30 min。 6. 4 °C，3000 g，10 min，离心，彻底弃去上清。 7. 用18.6 mL冰上预冷的TB溶液加入1.4 mL DMSO，轻轻悬浮细胞，冰上放置5 min。 8. 将1.5 mL Ep管依次插到冰上预冷。 9. 使用分液器以每份100 μL将感受态细胞分装到预冷的1.5 mL Ep管中，迅速扣上管子。 10. 迅速转移到液氮中冷冻，再转移到-80 °C中长期保存。 ▲ 关键步骤： ♫ 操作要轻柔且迅速，插管和扣管子可以找人帮忙。 ♫ 分装时，每次吸取菌液前都要轻轻摇匀。 ► 效价检测►预计消耗时间：1.5 h（Day 3） 这里使用puc19质粒检测效价，将高浓度的质粒稀释到1 ng/μL，0.1 ng/μL。 污 染 检 测 ① 分别将感受态涂布在Amp和Kan抗性平板上，37 °C过夜培养 ② 取少量感受态细胞加入到LB培养基中，过夜摇菌后涂布在无抗平板 上，37℃培养，观察是否出现噬菌斑 效 价 检 测 ③ 将1 μL高浓度未稀释的puc19质粒转化到感受态后，加入900 μL无抗 LB培养基复苏一个小时后吸取100 μL涂布在Amp抗性板上，37 °C过 夜培养 ④ 将1 μL 1 ng/μL的puc19质粒转化到感受态后，加入900 μL无抗LB培 养基复苏一个小时后吸取100 μL涂布在Amp抗性板上，37 °C过夜培 养 ⑤ 将1 μL 0.1 ng/μL的puc19质粒转化到感受态后，加入900 μL无抗LB 培养基复苏一个小时后吸取100 μL涂布在Amp抗性板上，37 °C过夜 培养 若①中未观察到菌落生长，②中未观察到噬菌斑，则说明未检测到污染。 转化子总数＝菌落数×质粒稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积 计算感受态效率的公式为：⑤中长出来的克隆数×105。 一般⑤长出一百个以上克隆，那么感受态转化效率在7次方以上，单位为克隆数/微克。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 所需实际可以提前配置好高浓度的母液。 2. 平板划线可以更好地活化细菌，最好不要省略这一步。 3. 当菌液OD600值接近0.5时，可以根据每隔20 min细菌增殖一代，OD值翻倍来估算一下，防止 OD600值过高。 4. 分装时要迅速，分装后立即置于液氮中冷冻，再转移到-80 °C中长期保存。 5. 若感受态效价较高，可只检测①②⑤。 2.1.6 电转化感受态制备 简介（INTRODUCTION） 电转化（electrotransformation）,也有人称作高压电穿孔法（high-voltage electroproration），简称 电穿孔法（electroproration），可用于将DNA导入真核细胞(如动物细胞和植物细胞) 和原核细胞(转化 大肠杆菌和其他细菌等)。电转化技术的主要优点在于：对于磷酸钙DNA共沉淀法以及其他技术难以 转化的细胞，电穿孔法仍可适用。电转化的效率高，既可用于克隆化基因的瞬间表达，也可用于建 立整合有外源基因的细胞系。本实验室曾使用电转化构建噬菌体展示文库，因此在电转化大肠杆菌 方面积累了一定的经验，下面介绍的是电转化大肠杆菌的步骤。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） 甘油，2xTY培养基（每1 L中含16 g蛋白胨、10 g酵母粉和5 g NaCl）