实验5细菌革兰氏染色目的要求了解细菌染色方法的原理，1.掌握革兰氏染色方法的操作技术2.染色原理二、1.染色方法·简单染色法·复染色法
实验5 细菌革兰氏染色 一、目的要求 1. 了解细菌染色方法的原理。 2. 掌握革兰氏染色方法的操作技术。 二、染色原理 1. 染色方法 • 简单染色法 • 复染色法
简单染色微生物细胞内含水，对光的吸收和反射与水的差别不大，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色：使菌体与背景形成明显的反差复染色法用两种或多种染料染细菌，自的是为了鉴别不同性质的细菌，主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色法
• 简单染色 微生物细胞内含水，对光的吸收和反射与水的差别 不大，机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差， 在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色， 使菌体与背景形成明显的反差。 • 复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性 质的细菌，主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸染色 法
简单染色：酵母菌没有染色与美兰染色后对比复染色法鉴别两种形态的菌
简单染色：酵母菌没有染色与美兰染色后对比 复染色法鉴别两种形态的菌
2.革兰氏染色原理革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（C)两种类型，这是（1）这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的：革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低。肽聚糖本身并不结合碘-结晶紫复合物，但其所具有的网结构可以滞留结晶紫复合物，乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘结晶紫复合物滞留在细胞壁菌体保持原有的蓝紫色。革兰氏阴性细菌肽聚糖含量低，交联度低。壁薄且脂质含量高。乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加。原先滞留在细胞壁中的碘--结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）复染色后文变为复染剂颜色（红色）
2.革兰氏染色原理 革兰氏染色法可将细菌分成革兰氏阳性(G+)和革兰氏阴性(C-)两种类型， 这是 （1）这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的： 革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低。肽聚糖本身并 不结合碘-结晶紫复合物，但其所具有的网结构可以滞留结晶紫复合物。 乙醇处理可以使肽聚糖网孔收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁， 菌体保持原有的蓝紫色。 革兰氏阴性细菌肽聚糖含量低，交联度低．壁薄且脂质含量高。乙醇处 理时脂质溶解，细胞壁通透性增加。原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫 复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红)复染色后 又变为复染剂颜色（红色）
2.革兰氏染色原理（拓展）·(2)G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色·(3)G+菌等电点比G-菌低，在同一pH条件下阳性菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷的碱性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色
2.革兰氏染色原理（拓展） • (2)G+菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、 结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色。 G-菌菌体内核糖核酸镁盐含量小，易被乙醇脱色。 • (3)G+菌等电点比G-菌低，在同一pH条件下阳性 菌比阴性菌所带阴电荷要多，故与带正电荷的碱 性染料(结晶紫)结合牢固，不易被乙醇脱色
厚肽聚糖层海肽聚榭层外脂多糖层调面空间质膜周质空间抗膜LPSproteinsurfaceproteinsteichoicacid-Opolysaccharide-lipidAlipoteichoicacid.一outerL1membranepeptidoglycanlipoproteinOOOOONAM NAGpeptidoglycan.OOOOOOOOOOpeptidecytoplasmiccytoplasmicmembranemembranephospholipidphospholipid革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌
革兰氏阴性菌 革兰氏阳性菌
三、应用·革兰染色法的实际应用意义有三·(1)按照革兰染色法可把细菌分为G+和G-两大类：·(2)G+菌和G-菌的致病性不同，所致疾病各异：·(3)对G+和G-菌，选择不同抗菌物治疗。大多数革兰氏阳性菌对青霉素敏感，所以首先区分病原菌是革兰氏阳性菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大
三、应用 • 革兰染色法的实际应用意义有三： • (1)按照革兰染色法可把细菌分为G+和G-两大类； • (2)G+菌和G-菌的致病性不同，所致疾病各异； • (3)对G +和G-菌，选择不同抗菌物治疗。大多数革兰氏阳 性菌对青霉素敏感 ，所以首先区分病原菌是革兰氏阳性 菌还是阴性菌，在选择抗生素方面意义重大
四、材料1、菌种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌培养18～24h后的培养物、第二次实验从土壤样品中筛出的细菌。2、溶液和试剂草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液，按教材P237方法配制。3、用具显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、无水乙醇、载玻片、镊子、吸水纸、擦镜纸、染色缸、打火机、烧杯、滴管或移液枪等
四、材料 1、菌种 大肠杆菌、 金黄色葡萄球菌培养18～ 24h后的培养物、第二 次实验从土壤样品中筛出的细菌。 2、溶液和试剂 草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%酒精、番红复染液， 按教材P237方法配制。 3、用具 显微镜、酒精灯、接种环、无菌水、无水乙醇、载玻片、 镊子、吸水纸、擦镜纸、染色缸、打火机、烧杯、滴管或移液 枪等
五、实验步骤革兰氏染色法操作流程流水冲洗流水冲洗流水冲洗碘液覆盖媒染1分钟结晶紫初染一分钟制片自然干燥流水冲洗番红复染2分钟酒精脱色3秒干燥卢氏碘液冲洗镜检固定
制 片 干 燥 固 定 结 晶 紫 初 染 1-2 分 钟 自 然 干 燥 镜 检 流 水 冲 洗 流 水 冲 洗 番 红 复 染 2 分 钟 碘 液 覆 盖 媒 染 1 分 钟 流 水 冲 洗 卢 氏 碘 液 冲 洗 流 水 冲 洗 酒 精 脱 色 30 秒 五、实验步骤 -革兰氏染色法操作流程
GramPositiveG+GGramNegative固定I结晶紫初染I碘液媒染95%酒精脱色沙黄或复红复染据革兰氏染色反应不同，可以把细菌分为两大类：G+革兰氏阳性菌G革兰氏阴性菌