实验十一检测碱性磷酸酶SDS-PAGE
实 验 十 一 SDS-PAGE 检测碱性磷酸酶
实验目的1.掌握电泳技术的基本原理2.掌握SDS-PAGE检测蛋白质分子的原理和技术
1.掌握电泳技术的基本原理。 2.掌握SDS-PAGE检测蛋白质分子的原理和技术。 实验目的
1.电泳技术的基本原理电泳：#带电粒子在电场中的定向移动。影响泳动率u的因素SampleSamplewellsCathode内因：1.净电荷Buffer2.质点大小Plasticframe3.质点形状GelAnodeBuffer外因：1.V(U/L)（pH恒定）2.缓冲液的pH3.离子强度门最适：0.02-0.24.电渗：液体对固体支持物的相对移动
1. 电泳技术的基本原理 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状 外因：1.V ( U/L) 2.缓冲液的pH (pH恒定) 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动
2.SDS-PAGE电泳原理B样品胶浓缩胶分离胶AY国快离子蛋白质慢离子电泳过程示意图A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带
电泳过程示意图 A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。 2. SDS-PAGE电泳原理
2.SDS-PAGE电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr)和交联剂N，N'一亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同将蛋白质分离成若于条区带。SDS与蛋白质结合，掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只与分子大小相关
2. SDS-PAGE电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (Acr) 和交联剂N，N’—亚甲 基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网 状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异 及分子大小的不同将蛋白质分离成若干条区带。 SDS与蛋白质结合, 掩盖各种蛋白分子间天然的电荷差异。 因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原 有电荷和分子形状的影响，而只与分子大小相关
2.1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris-GlypH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris-HCI，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris-HCl,pH8.8) 。浓缩胶：Cl- >Pr- >Gly-由于C1-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率
2.1.蛋白样品浓缩效应 在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris-Gly， pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris-HCl，pH6.8)、分离胶缓冲 液 (Tris-HCl，pH8.8) 。 浓缩胶：Cl- > Pr- > Gly- 由于C1-很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一 个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高， 这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋 白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶 之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳 的分辨率
2.2.分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，其pH升高，使Gly解离成负离子的效应增加：同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响迁移率急剧下降。分离胶: Cl- > Gly- > Pr-高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动
2.2. 分子筛效应 蛋白质离子进入分离胶后，其pH 升高，使Gly 解离成负离 子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响， 迁移率急剧下降。 分离胶：Cl- > Gly- > Pr- 高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯 度环境中，按其分子的大小移动
试剂和器材1. 试剂凝胶贮液(30%Acr一0.8%Bis)，10%过硫酸铵(AP)：10%TEMED，样品稀释液，1%琼脂（糖)溶液分离胶缓冲液(3.0mol/LpH8.9Tris-HCI缓冲液）浓缩胶缓冲液(0.5mol/LpH6.7Tris-HCI缓冲液）Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3)染色液，脱色液2. 器材微量移液器，EP管垂直板电泳槽，直流稳压电源，微量进样器，玻璃板
试剂和器材 1. 试剂 凝胶贮液(30 %Acr－0.8 %Bis)， 10%过硫酸铵(AP)， 10% TEMED ， 样品稀释液，1% 琼脂(糖)溶液 分离胶缓冲液(3.0 mol/L pH8.9 Tris-HCl缓冲液) 浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L pH6.7 Tris-HCl缓冲液) Tris-甘氨酸电极缓冲液(pH8.3) 染色液， 脱色液 2. 器材 微量移液器， EP管 垂直板电泳槽，直流稳压电源 ，微量进样器 ，玻璃板
实验步骤1.装板将平、凹玻璃板洗干净，和边胶条一同安装在制胶架上，用镊子固定好电泳板。用琼脂将玻璃板的两侧和底部封住。注意安装要平衡、紧密，不漏胶
实验步骤 1. 装板 将平、凹玻璃板洗干净，和边胶条一同安装在 制胶架上，用镊子固定好电泳板。用琼脂将玻璃板 的两侧和底部封住。 注意安装要平衡、紧密，不漏胶
2.配胶本实验采用不连续体系，分离胶浓度10.0%，浓缩胶浓度为3%，具体。操作见下表：配制10mL10%分离胶配制5mL3%浓缩胶试剂名称所需试剂用量/mL所需试剂用量/mL6.660.50凝胶贮液2.50分离胶缓冲液(pH8.9一Tris-HCI)浓缩胶缓冲液(pH6.70.625一Tris-HCI)0.20.02510%TEMED0.20.0510%SDS重蒸水10.443.77510%过硫酸铵0.100.025*浓缩胶的10%过硫酸铵应在分离胶凝固后，灌浓缩胶之前加入
2. 配胶 本实验采用不连续体系，分离胶浓度10.0 %，浓缩胶浓度为3 %，具体 操作见下表: 试剂名称 配制10 mL 10%分离胶 所需试剂用量/mL 配制5 mL 3%浓缩胶 所需试剂用量/mL 凝胶贮液 6.66 0.50 分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl) 2.50 — 浓缩胶缓冲液(pH6.7 Tris-HCl) — 0.625 10%TEMED 0.2 0.025 10%SDS 0.2 0.05 重蒸水 10.44 3.775 10%过硫酸铵 0.10 0.025 *浓缩胶的10%过硫酸铵应在分离胶凝固后，灌浓缩胶之前加入