厦门大学：化学工程与生物工程系生物工程专业实验指导书（共十个实验）

专业实验指导书(生物工程)厦门大学化学工程与生物工程系2011年7月

专业实验指导书 (生物工程) 厦门大学化学工程与生物工程系 2011 年 7 月

目录实验一重组大肠杆菌产L-色氨酸的补料-分批发酵实验二发酵液中L-色氨酸的提取纯化实验三L-色氨酸含量和纯度的测定实验四质粒DNA的提取实验11实验五聚合酶链式反应体外扩增DNA.-14实验六琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒DNA..19实验七大肠杆菌的DNA转化实验22-实验八厌氧细菌丁酸梭菌的培养24.实验九碱性磷酸酶的酶促反应动力学实验28.实验十荧光显微镜检测大肠杆菌基因工程菌死活细胞-32

I 目 录 实验一 重组大肠杆菌产 L-色氨酸的补料-分批发酵.- 1 - 实验二 发酵液中 L-色氨酸的提取纯化 .- 4 - 实验三 L-色氨酸含量和纯度的测定 .- 7 - 实验四 质粒 DNA 的提取实验.- 11 - 实验五 聚合酶链式反应体外扩增 DNA.- 14 - 实验六 琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定质粒 DNA.- 19 - 实验七 大肠杆菌的 DNA 转化实验.- 22 - 实验八 厌氧细菌丁酸梭菌的培养 .- 24 - 实验九 碱性磷酸酶的酶促反应动力学实验 .- 28 - 实验十 荧光显微镜检测大肠杆菌基因工程菌死活细胞 .- 32 -

实验一重组大肠杆菌产L-色氨酸的补料-分批发酵一、实验目的1.通过对L-色氨酸的发酵，了解L-色氨酸的补料-分批发酵的基本过程；2.初步掌握微生物发酵的基本操作。二、概述和原理L-色氨酸（L-Trp）是含有吲哚的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺少的必需氨基酸之一。L-色氨酸不仅在营养代谢中起重要作用，而且还广泛应用于医药、食品、饲料等方面[1-2]，随着市场需求量的日益增加，L-色氨酸具有广阔的应用前景。早期的L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪90年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实用并且处于主导地位，微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大规模生产L-色氨酸的首选技术。该法主要是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利用优良的L-色氨酸生产菌种来生产L-色氨酸。补料-分批发酵，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养成分的一种发酵方法，现已经广泛应用于发酵工业。流加操作的主要特点就是能够调节微生物生长反应环境中营养物质的浓度，可以避免营养成分的初始浓度过高而出现的底物抑制现象，同时也能阻正某些限制性营养成分由于在反应过程中被耗尽而影响微生物的生长和产物的形成。在发酵生产L-色氨酸过程中，菌体主要以葡萄糖为碳源，由于在高浓度的葡萄糖条件下，大肠杆菌容易产生乙酸，而当发酵液中乙酸浓度积累到2g/L时，菌体将停止生长并且抑制外源基因的表达3]。因此本实验需采用补料-分批发酵的方式。补料培养基加入形式可以分为非反馈补料和反馈补料，非反馈补料主要包括恒速补料、指数补料、逐级提速流加等几种流加形式，而反馈补料根据所选反馈指标的不同可分为恒pH值法、恒溶解氧法、菌体浓度反馈、CER法、DO-stat法等几种补料方法。反馈补料由于能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，从而能够很好地控制系统-1-

- 1 - 实验一 重组大肠杆菌产 L-色氨酸的补料-分批发酵 一、 实验目的 1. 通过对 L-色氨酸的发酵，了解 L-色氨酸的补料-分批发酵的基本过程； 2. 初步掌握微生物发酵的基本操作。 二、 概述和原理 L-色氨酸（L-Trp）是含有吲哚的中性芳香族氨基酸，是人和动物生命活动中不可缺 少的必需氨基酸之一。L-色氨酸不仅在营养代谢中起重要作用，而且还广泛应用于医药、 食品、饲料等方面[1-2]，随着市场需求量的日益增加，L-色氨酸具有广阔的应用前景。 早期的 L-色氨酸的生产方法主要依靠化学合成法和蛋白质水解法，但是由于这些方 法存在着材料来源有限、周期长、工艺复杂、产品成分复杂等缺点，因而在上世纪 90 年代逐渐被淘汰，随着对微生物法生产 L-色氨酸研究的不断深入，微生物法已经走向实 用并且处于主导地位，微生物发酵法具有产酸高、成本低、质量好等优势，将是未来大 规模生产 L-色氨酸的首选技术。该法主要是以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉价原料为碳源，利 用优良的 L-色氨酸生产菌种来生产 L-色氨酸。 补料-分批发酵，是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养成分的一种发 酵方法，现已经广泛应用于发酵工业。流加操作的主要特点就是能够调节微生物生长反 应环境中营养物质的浓度，可以避免营养成分的初始浓度过高而出现的底物抑制现象， 同时也能阻止某些限制性营养成分由于在反应过程中被耗尽而影响微生物的生长和产物 的形成。在发酵生产 L-色氨酸过程中，菌体主要以葡萄糖为碳源，由于在高浓度的葡萄 糖条件下，大肠杆菌容易产生乙酸，而当发酵液中乙酸浓度积累到 2 g/L 时，菌体将停 止生长并且抑制外源基因的表达[3]。因此本实验需采用补料-分批发酵的方式。 补料培养基加入形式可以分为非反馈补料和反馈补料，非反馈补料主要包括恒速补 料、指数补料、逐级提速流加等几种流加形式，而反馈补料根据所选反馈指标的不同可 分为恒 pH 值法、恒溶解氧法、菌体浓度反馈、CER 法、DO-stat 法等几种补料方法。反 馈补料由于能够根据反馈的信息及时调整补料的速率和策略，从而能够很好地控制系统

的营养浓度，防止营养浓度过高，故在大肠杆菌培养中常被广泛采用4]。本实验主要采用溶氧反馈流加葡萄糖的方式，即当发酵液中葡萄糖耗尽时，溶氧值表现为上升，开始流加葡萄糖；当溶氧值降低时，停止流加葡萄糖。通过溶氧反馈补料能够很好的控制发酵液中葡萄糖的浓度，从而实现L-色氨酸的高效表达。本实验以重组大肠杆菌为菌种，进行L-色氨酸补料-分批发酵，并测定发酵液中L-色氨酸的含量。三、实验材料、试剂与仪器1.菌种重组大肠杆菌K12W3110。2.培养基（1）摇瓶种子培养基：K2HPO42.0%，酵母粉2.0%，KH2PO41.0%，葡萄糖3.0%MgSO4-7H2O0.1%，pH7.4;（2）发酵罐培养基：K,HPO40.5%，酵母粉0.2%，MgSO47H2O0.1%，(NH4)SO40.1%，柠檬酸0.3%，FeSO4·7H200.005%，葡萄糖0.8%；（3）摇瓶种子培养基为300mL三角瓶装培养基50mL；流加葡萄糖浓度为600g/L；以上培养基均于0.1MPa下灭菌20min，其中葡萄糖单消后加入。3.仪器紫外-可见分光光度计，往复式恒温摇床，离心机，pH计，灭菌锅，显微镜，四、实验操作步骤1．摇瓶种子培养打开冷冻甘油管，取500μL的菌液加入种子摇瓶中，摇瓶于37℃、200rpm摇床中培养10~12h，取样测定菌体浓度，使得最终OD660值为6～7。2.发酵罐培养以10%的接种量将培养好的种子培养液接入发酵罐中，发酵罐装液量50%，pH用25%氨水控制在6.5，温度35℃，搅拌速度900rpm，溶氧自动显示，空气流量2VVM，培养时间36h。当初糖耗尽溶氧表现为突然上升时，设定合适的流加泵补料周期（如设-2-

- 2 - 的营养浓度，防止营养浓度过高，故在大肠杆菌培养中常被广泛采用[4]。本实验主要采 用溶氧反馈流加葡萄糖的方式，即当发酵液中葡萄糖耗尽时，溶氧值表现为上升，开始 流加葡萄糖；当溶氧值降低时，停止流加葡萄糖。通过溶氧反馈补料能够很好的控制发 酵液中葡萄糖的浓度，从而实现 L-色氨酸的高效表达。 本实验以重组大肠杆菌为菌种，进行 L-色氨酸补料-分批发酵，并测定发酵液中 L- 色氨酸的含量。 三、 实验材料、试剂与仪器 1. 菌种 重组大肠杆菌 K12 W3110。 2. 培养基 （1）摇瓶种子培养基：K2HPO4 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO4 1.0%，葡萄糖 3.0%， MgSO4·7H2O 0.1%，pH7.4； （2）发酵罐培养基：K2HPO4 0.5%，酵母粉 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，(NH4)2SO4 0.1%，柠檬酸 0.3%，FeSO4·7H2O 0.005%，葡萄糖 0.8%； （3）摇瓶种子培养基为 300 mL 三角瓶装培养基 50 mL；流加葡萄糖浓度为 600 g/L； 以上培养基均于 0.1 MPa 下灭菌 20 min，其中葡萄糖单消后加入。 3. 仪器 紫外-可见分光光度计，往复式恒温摇床，离心机，pH 计，灭菌锅，显微镜。 四、 实验操作步骤 1. 摇瓶种子培养 打开冷冻甘油管，取 500 L 的菌液加入种子摇瓶中，摇瓶于 37 ℃、200 rpm 摇床中 培养 10～12 h，取样测定菌体浓度，使得最终 OD660 值为 6～7。 2. 发酵罐培养 以 10%的接种量将培养好的种子培养液接入发酵罐中，发酵罐装液量 50%， pH 用 25%氨水控制在 6.5，温度 35 ℃，搅拌速度 900 rpm，溶氧自动显示，空气流量 2 VVM， 培养时间 36 h。当初糖耗尽溶氧表现为突然上升时，设定合适的流加泵补料周期（如设

定流加周期10s：工作2s，停8s），使得溶氧值处于上下波动状态。每隔4h从发酵罐中取样，在紫外-可见分光光度计上测定发酵液660nm处的光密度值A(OD660)，在pH计上测定pH值，记录溶氧值。3.无菌体发酵液的制备（实验三备用）取1mL发酵液加入离心管，10000rpm离心5min，取上清，将上清液稀释100倍后，4℃冰箱保存。五、实验结果及其处理根据不同发酵时间发酵液的OD660、DO、pH和L-色氨酸产量(此值实验三测得)，绘制菌体的生长曲线。六、思考题1．微生物发酵罐发酵有哪几种方法？发酵罐发酵主要检测哪几种指标？2.工业发酵罐常用何种灭菌方式？七、参考文献[1]陈涛，陈宁.L-色氨酸的生产及其代谢控制育种)[]生物科技通讯,2000,2:141-145[2] Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K.Biotechnological production of amino acids andderivatives: current status and prospects []. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 1-8.[3] Shiloach J, Fass R. Growing E. coli to high cell density—A historical perspective on methoddevelopment[JJ.Biotechnology Advances, 2005, 23(5): 345-357[4] Yuan H, Yang X, Hua Z C. Optimization of expression of anannexin V-hirudin chimeric protein inEscherichia coli[J].Microbiological Research, 2004, 159(2): 147-156-3

- 3 - 定流加周期 10 s：工作 2 s，停 8 s），使得溶氧值处于上下波动状态。每隔 4 h 从发酵罐 中取样，在紫外-可见分光光度计上测定发酵液 660 nm 处的光密度值 A(OD660)，在 pH 计上测定 pH 值，记录溶氧值。 3. 无菌体发酵液的制备(实验三备用) 取 1 mL 发酵液加入离心管，10000 rpm 离心 5 min，取上清，将上清液稀释 100 倍 后，4 ℃冰箱保存。 五、 实验结果及其处理 根据不同发酵时间发酵液的 OD660、DO、pH 和 L-色氨酸产量(此值实验三测得)，绘 制菌体的生长曲线。 六、 思考题 1. 微生物发酵罐发酵有哪几种方法？发酵罐发酵主要检测哪几种指标？ 2. 工业发酵罐常用何种灭菌方式？ 七、 参考文献 [1] 陈涛, 陈宁. L-色氨酸的生产及其代谢控制育种)[J]. 生物科技通讯, 2000, 2: 141-145. [2] Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K. Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects [J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2005, 69(1): 1-8. [3] Shiloach J, Fass R. Growing E. coli to high cell density—A historical perspective on method development[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(5): 345-357. [4] Yuan H, Yang X, Hua Z C. Optimization of expression of anannexin V-hirudin chimeric protein in Escherichia coli[J]. Microbiological Research, 2004, 159(2): 147-156

实验二发酵液中L-色氨酸的提取纯化实验目的一、1.了解氨基酸的一般提取纯化工艺：2.掌握离子交换过程的反应机理。二、概述和原理分离纯化是氨基酸工业生产中的一个重要组成部分，它在投资及产品中的费用都占有很大比例。因此，研究分离纯化技术，降低其成本，对氨基酸工业的发展是非常重要的。发酵液是极其复杂的多相体系，含有微生物细胞、代谢产物、未耗用的培养基等。氨基酸的提取纯化，主要是应用它的物理化学性质，如两性电解质的特性，溶解度，分子大小，分配系数及与吸附剂吸附特性等，达到把发酵液氨基酸提取出来的目的。一般的氨基酸分离纯化步骤可简分为：浓缩脱色浓缩洗脱过滤发酵液离子交结晶洗脱液脱色液预处理换吸附其中离子交换法具有设备投资少、纯化效果好、工艺简单、污染小、节能的优点，常用于工业生产中氨基酸的提取。其原理主要是应用氨基酸的两性电解质特性：在酸性溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子交换树脂交换吸附；在碱性溶液中，氨基酸以阴离子状态存在，因而能被阴离子交换树脂交换吸附。根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、pI值的差异，通过调节氨基酸发酵液的pH值，使不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，再通过选择合适的离子交换树脂就能分离纯化各种氨基酸。三、实验试剂及仪器1.试剂-4-

- 4 - 实验二 发酵液中 L-色氨酸的提取纯化 一、 实验目的 1. 了解氨基酸的一般提取纯化工艺； 2. 掌握离子交换过程的反应机理。 二、 概述和原理 分离纯化是氨基酸工业生产中的一个重要组成部分，它在投资及产品中的费用都占 有很大比例。因此，研究分离纯化技术，降低其成本，对氨基酸工业的发展是非常重要 的。 发酵液是极其复杂的多相体系，含有微生物细胞、代谢产物、未耗用的培养基等。 氨基酸的提取纯化，主要是应用它的物理化学性质，如两性电解质的特性，溶解度，分 子大小，分配系数及与吸附剂吸附特性等，达到把发酵液氨基酸提取出来的目的。 一般的氨基酸分离纯化步骤可简分为： 其中离子交换法具有设备投资少、纯化效果好、工艺简单、污染小、节能的优点， 常用于工业生产中氨基酸的提取。其原理主要是应用氨基酸的两性电解质特性：在酸性 溶液中，氨基酸以阳离子状态存在，因而能被阳离子交换树脂交换吸附；在碱性溶液中， 氨基酸以阴离子状态存在，因而能被阴离子交换树脂交换吸附。根据氨基酸是两性电解 质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸 pK、pI 值的差异，通过调节氨基酸发酵液 的 pH 值，使不同氨基酸的带电性质及解离状态不同，再通过选择合适的离子交换树脂 就能分离纯化各种氨基酸。 三、 实验试剂及仪器 1. 试剂 发酵液 预处理 过滤 离子交 换吸附 洗脱 洗脱液 浓缩 脱色 脱色液 浓缩 结晶

L-色氨酸发酵液（由实验一提供）；浓硫酸（AR95.5%)：盐酸：氢氧化钠：氨水；冰醋酸；001×7型阳离子交换树脂。2.仪器离子交换柱，离心机，控温磁力搅拌器，旋转蒸发仪，蠕动泵、真空干燥箱。四、实验操作步骤1.树脂预处理及装柱先用蒸馏水冲洗001×7型阳离子交换树脂除去杂质，然后用2mol/L的HCl和NaOH溶液反复浸泡3次后，再用2mol/L的HCI转成H型，最后用去离子水洗至中性备用；离子交换柱用去离子水冲洗干净后，在柱中先装入半柱水，然后将树脂和水一起倒入柱中，让树脂自然沉降。装柱时应注意柱中的水不能低于树脂界面，否则，树脂间形成气泡，影响交换效率。2.发酵液预处理用浓硫酸将发酵液pH值调至4.0，然后用高速冷冻离心机10000rpm离心30min，除去发酵液中含有的菌体和蛋白质等杂质。3.离子交换树脂吸附及洗脱（1）使用蠕动泵将预处理后的发酵液打入交换柱中，调节交换柱顶部的进料速度和底部的出料速度均为1倍柱体积/h，每5～10min收集并测定流出液pH值和L-色氨酸浓度，当流出液浓度与上柱液浓度相同时停止上柱（流出液颜色与进料液颜色相近时）。（2）树脂吸附结束后，使用1～2倍柱体积的去离子水进行水洗，流速为1.5倍柱体积/h;（3）水洗结束后，使用浓度为2mol/L氨水进行洗脱实验，洗脱流速为1倍柱体积/h，收集洗脱液，每5～10min测定流出液pH值和L-色氨酸浓度，当流出液颜色变淡时停止洗脱。4.洗脱液浓缩脱色（1）使用旋转蒸发仪对洗脱液进行浓缩，控制料液温度在50～60℃，浓缩液中L色氨酸含量控制在25g/L左右：-5-

- 5 - L-色氨酸发酵液(由实验一提供)；浓硫酸(AR 95.5%)；盐酸；氢氧化钠；氨水；冰醋 酸；001×7 型阳离子交换树脂。 2. 仪器 离子交换柱，离心机，控温磁力搅拌器，旋转蒸发仪，蠕动泵、真空干燥箱。 四、 实验操作步骤 1. 树脂预处理及装柱 先用蒸馏水冲洗 001×7 型阳离子交换树脂除去杂质，然后用 2 mol/L 的 HCl 和 NaOH 溶液反复浸泡 3 次后，再用 2 mol/L 的 HCl 转成 H +型，最后用去离子水洗至中性备用； 离子交换柱用去离子水冲洗干净后，在柱中先装入半柱水，然后将树脂和水一起倒入柱 中，让树脂自然沉降。装柱时应注意柱中的水不能低于树脂界面，否则，树脂间形成气 泡，影响交换效率。 2. 发酵液预处理 用浓硫酸将发酵液 pH 值调至 4.0，然后用高速冷冻离心机 10000 rpm 离心 30 min， 除去发酵液中含有的菌体和蛋白质等杂质。 3. 离子交换树脂吸附及洗脱 （1）使用蠕动泵将预处理后的发酵液打入交换柱中，调节交换柱顶部的进料速度和 底部的出料速度均为 1 倍柱体积/h，每 5～10 min 收集并测定流出液 pH 值和 L-色氨酸 浓度，当流出液浓度与上柱液浓度相同时停止上柱（流出液颜色与进料液颜色相近时）。 （2）树脂吸附结束后，使用 1～2 倍柱体积的去离子水进行水洗，流速为 1.5 倍柱体 积/h； （3）水洗结束后，使用浓度为 2 mol/L 氨水进行洗脱实验，洗脱流速为 1 倍柱体积 /h，收集洗脱液，每 5～10 min 测定流出液 pH 值和 L-色氨酸浓度，当流出液颜色变淡时 停止洗脱。 4. 洗脱液浓缩脱色 （1）使用旋转蒸发仪对洗脱液进行浓缩，控制料液温度在 50～60 ℃，浓缩液中 L- 色氨酸含量控制在 25 g/L 左右；

（2）浓缩液使用80%的醋酸调节pH值至6.0～7.0，然后加入1%的活性炭，升温至55～65℃搅拌1h，然后使用抽滤瓶进行过滤，可得到脱色液。5.脱色液浓缩使用旋转蒸发仪对脱色液进行浓缩，控制料液温度在50～60℃，浓缩液中L-色氨酸含量控制在40g/L左右，浓缩过程中应避免结晶析出。6.结晶将浓缩的脱色液搅拌降温至25℃左右时，L-色氨酸析出，保温1h后进行离心分离，得到L-色氨酸的结晶湿粉。7.干燥将结晶湿粉置于真空干燥箱内80℃过夜干燥（实验三测定纯度）。五、实验结果及其处理绘制L-色氨酸的吸附和洗脱曲线；六、 思考题1．洗脱液脱色的目的？2．树脂在吸附和洗脱过程中流出液的pH和L-色氨酸含量的变化趋势？七、参考文献[1]甘林火，翁连进，王士斌.国产732型阳离子交换树脂吸附L-精氨酸的特性[]．离子交换与吸附,2002,18(6):559-563[2]徐虹，藤农，应汉杰，等，离子交换法提取L-苯丙氨酸的研究[].离子交换与吸附，1999,15(1):81-85[3]梅丛笑.L-色氨酸提取工艺的研究[D].天津：天津轻工业学院,2000[4]武彩莲，郭长江，杨继军，等.发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺研究[]氨基酸与生物资源，2007,29(3):42-46-6-

- 6 - （2）浓缩液使用 80%的醋酸调节 pH 值至 6.0～7.0，然后加入 1%的活性炭，升温至 55～65 ℃搅拌 1 h，然后使用抽滤瓶进行过滤，可得到脱色液。 5. 脱色液浓缩 使用旋转蒸发仪对脱色液进行浓缩，控制料液温度在 50～60 ℃，浓缩液中 L-色氨酸 含量控制在 40 g/L 左右，浓缩过程中应避免结晶析出。 6. 结晶 将浓缩的脱色液搅拌降温至 25 ℃左右时，L-色氨酸析出，保温 1 h 后进行离心分离， 得到 L-色氨酸的结晶湿粉。 7. 干燥 将结晶湿粉置于真空干燥箱内 80 ℃过夜干燥（实验三测定纯度）。 五、 实验结果及其处理 绘制 L-色氨酸的吸附和洗脱曲线； 六、 思考题 1. 洗脱液脱色的目的？ 2. 树脂在吸附和洗脱过程中流出液的 pH 和 L-色氨酸含量的变化趋势？ 七、 参考文献 [1] 甘林火, 翁连进, 王士斌. 国产 732 型阳离子交换树脂吸附 L-精氨酸的特性[J]. 离子交换与 吸附, 2002, 18(6): 559-563. [2] 徐虹, 藤农, 应汉杰, 等. 离子交换法提取 L-苯丙氨酸的研究[J]. 离子交换与吸附, 1999, 15(1): 81-85. [3] 梅丛笑. L-色氨酸提取工艺的研究[D]. 天津: 天津轻工业学院, 2000. [4] 武彩莲, 郭长江, 杨继军, 等. 发酵液中 L-色氨酸分离纯化工艺研究[J]. 氨基酸与生物资源, 2007, 29(3): 42-46

实验三L-色氨酸含量和纯度的测定实验目的一、1.了解对二甲氨基苯甲醛与L-色氨酸的反应机理；2.了解高效液相色谱分析的基本原理；3.掌握L-色氨酸的测定方法。二、概述和原理L-色氨酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪分析法、高效液相色谱分析法、毛细管电泳法、薄层色谱法和分光光度法等。本实验主要采用分光光度法进行L-色酸含量测定。分光光度法测定L-色氨酸的基本原理为：在硫酸溶液中，L-色氨酸与对二甲氨基苯甲醛发生缩合反应，生成的希夫碱对二甲氨基苯甲醛缩色氨酸为蓝色，颜色深度在一定范围内与L-色氨酸含量成线性关系，可在分光光度计下定量测定高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，其系统主要由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，由于该法具有高效、快速和灵敏等特点，不仅可用于L-色氨酸含量的测定，还可用于纯度的测定。其工作原理为：储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。三、实验试剂及仪器1.试剂浓硫酸：对二甲氨基苯甲醛：亚硝酸钠：L-色氨酸标准品：磷酸二氢钾；冰醋酸：甲醇（液相纯）：纯净水；乙腈（液相纯）。-7-

- 7 - 实验三 L-色氨酸含量和纯度的测定 一、 实验目的 1. 了解对二甲氨基苯甲醛与 L-色氨酸的反应机理； 2. 了解高效液相色谱分析的基本原理； 3. 掌握 L-色氨酸的测定方法。 二、 概述和原理 L-色氨酸的分析方法主要有氨基酸自动分析仪分析法、高效液相色谱分析法、毛细 管电泳法、薄层色谱法和分光光度法等。 本实验主要采用分光光度法进行 L-色氨酸含量测定。分光光度法测定 L-色氨酸的基 本原理为：在硫酸溶液中，L-色氨酸与对二甲氨基苯甲醛发生缩合反应，生成的希夫碱 对二甲氨基苯甲醛缩色氨酸为蓝色，颜色深度在一定范围内与 L-色氨酸含量成线性关 系，可在分光光度计下定量测定。 高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，其系统主要由储液器、泵、进样器、色谱 柱、检测器、记录仪等几部分组成，由于该法具有高效、快速和灵敏等特点，不仅可用 于 L-色氨酸含量的测定，还可用于纯度的测定。其工作原理为：储液器中的流动相被高 压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由 于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反 复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组 分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图 谱形式打印出来。 三、 实验试剂及仪器 1. 试剂 浓硫酸；对二甲氨基苯甲醛；亚硝酸钠；L-色氨酸标准品；磷酸二氢钾；冰醋酸； 甲醇（液相纯）；纯净水；乙腈（液相纯）

2.仪器紫外可见分光光度计，Agilent1200Series高效液相色谱仪。四、发酵液中L-色氨酸含量的测定1.对二甲氨基苯甲醛溶液（3g/L）制备准确称取0.3g对二甲氨基苯甲醛，溶于100mL1:1浓硫酸中。2.亚硝酸钠溶液（2%）制备准确称取亚硝酸钠0.2g于10mL容量瓶中，以蒸馏水定容，新鲜配制。3.L-色氨酸标准储备液（100mg/L）制备准确称取25mgL-色氨酸标准品，用纯水定容于250mL棕色容量瓶中，制得浓度为100mg/L的L-色氨酸标准储备液，于4℃冰箱保存备用。4.L-色氨酸标准曲线的测定将L-色氨酸标准储备液稀释至20、40、60、80、100mg/L，分别量取1mL稀释后的标准液与9mL对二甲氨基苯甲醛溶液混合于试管中，沸水加热2min，再加入亚硝酸钠1滴，混匀后，继续加热3min，冷水冷却，最后以试剂作空白，在600nm处测定吸光值。以浓度为纵坐标，相对应的吸光值为横坐标，制作L-色氨酸标准曲线。5.发酵样品的处理取1mL发酵液加入离心管中，10000rpm离心5min，取上清，将上清液稀释100倍后用于L-色氨酸含量的测定。6.发酵样品的测定在与L-色氨酸标准品相同的检测方法下进行样品测定，所得的吸光值与L-色氨酸标准曲线比对，确定发酵液中L-色氨酸的含量。五、L-色氨酸结晶纯度的测定1.流动相的制备称取1.3265gNaH2PO42H2O溶解于850mL水，加0.5mL乙酸，混匀，再加150mL甲醇。过滤，超声。2.色谱条件-8-

- 8 - 2. 仪器 紫外可见分光光度计，Agilent 1200 Series 高效液相色谱仪。 四、 发酵液中 L-色氨酸含量的测定 1. 对二甲氨基苯甲醛溶液（3 g/L）制备 准确称取 0.3 g 对二甲氨基苯甲醛，溶于 100 mL 1:1 浓硫酸中。 2. 亚硝酸钠溶液（2%）制备 准确称取亚硝酸钠 0.2 g 于 10 mL 容量瓶中，以蒸馏水定容，新鲜配制。 3. L-色氨酸标准储备液（100 mg/L）制备 准确称取 25 mg L-色氨酸标准品，用纯水定容于 250 mL 棕色容量瓶中，制得浓度为 100 mg/L 的 L-色氨酸标准储备液，于 4 ℃冰箱保存备用。 4. L-色氨酸标准曲线的测定 将 L-色氨酸标准储备液稀释至 20、40、60、80、100 mg/L，分别量取 1 mL 稀释后 的标准液与 9 mL 对二甲氨基苯甲醛溶液混合于试管中，沸水加热 2 min，再加入亚硝酸 钠 1 滴，混匀后，继续加热 3 min，冷水冷却，最后以试剂作空白，在 600 nm 处测定吸 光值。以浓度为纵坐标，相对应的吸光值为横坐标，制作 L-色氨酸标准曲线。 5. 发酵样品的处理 取 1 mL 发酵液加入离心管中，10000 rpm 离心 5 min，取上清，将上清液稀释 100 倍后用于 L-色氨酸含量的测定。 6. 发酵样品的测定 在与 L-色氨酸标准品相同的检测方法下进行样品测定，所得的吸光值与 L-色氨酸标 准曲线比对，确定发酵液中 L-色氨酸的含量。 五、 L-色氨酸结晶纯度的测定 1. 流动相的制备 称取 1.3265 g NaH2PO4·2H2O 溶解于 850 mL 水，加 0.5 mL 乙酸，混匀，再加 150 mL 甲醇。过滤，超声。 2. 色谱条件