实验九质粒DNA的提取与检测
实验九 质粒DNA的提取与检测
实验目的.....................实验原理试剂器材实验步骤思考题5
1 实验目的 2 实验原理 3 试剂器材 4 实验步骤 5 思考题
实验日的1、学习质粒DNA的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；2、掌握质粒DNA的提取方法3、掌握电泳检测DNA的方法
实验目的 1、学习质粒 DNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电 泳原理； 2、掌握质粒 DNA 的提取方法； 3、掌握电泳检测DNA的方法
实验原理质粒（Plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(OpencircularDNA，简称ocDNA)：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快
实验原理 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1- 200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,以超螺旋状态存在于宿 主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具 有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并 表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺 旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会 产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链 发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰 型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)； 如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形 式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快
实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：DNA的分子大小，琼脂糖浓度，DNA分子的构象，电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料漠化乙啶（Ethidiumbromide，EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置
实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度 取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的 DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA 的分 子大小，琼脂糖浓度，DNA 分子的构象，电源电压，嵌入染 料的存在及离子强度等。 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心 法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴 化乙啶(Ethidium bromide, EB） 染色,在紫外光下至少可以检 出1-10ng 的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位 置
器材试剂材料：含pET32a的E.coliDH5α菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管）离心管架。设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅）涡旋振荡器，移液枪（20ul,200ul1000μl)及枪头，琼脂糖平板电泳装置，微波炉或电炉，紫外透射仪。试剂：LB液体培养基、LB固体培养基、氨苄青霉素、溶菌酶溶液、3mol/INaAc（pH5.2)、溶液I、溶液工、溶液Ⅲ、RNA酶A母液、酚：氯仿：异戊醇一25:24:1VVV)、TE缓冲液、TBE缓冲液（5×）、上样缓冲液（6×）、溴化乙锭
器材试剂 • 材料：含pET32a的E. coli DH5α菌株，1.5ml 塑料离心管(又称 eppendorf 管),离心管架。 • 设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，移液枪(20μl,200μl,1000μl)及枪头，琼脂糖平板电泳 装置，微波炉或电炉,紫外透射仪。 • 试剂：LB 液体培养基、LB 固体培养基、氨苄青霉素、溶菌酶溶 液、3mol/l NaAc (pH5.2)、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、RNA 酶A 母液、酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(V/V/V)、TE 缓冲液、TBE 缓冲 液(5×)、上样缓冲液(6×)、溴化乙锭
实验步骤1.细菌的培养和收集将含有质粒pET32a的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50ug/mlAmp）中，37C培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50ug/mlAmp）中，37C振荡培养约12小时至对数生长后期2.质粒DNA快速提取①取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4C下12000g离心30秒。②充上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽③菌体沉淀重悬浮于100ul溶液I中（需剧烈振荡），室温下放置510分钟。④加入新配制的溶液Ⅱ200ul，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟
实验步骤 1.细菌的培养和收集 将含有质粒pET32a 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含 50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落 接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约 12 小时至对数生长后期。 2.质粒DNA快速提取 ①取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心 30 秒。 ②弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 ③菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5- 10 分钟。 ④加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟
5加入150叫预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃C冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。弃上清，将管口开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70%乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空于燥10分钟或室温干燥。将沉淀溶于20μlTE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中
⑤ 加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温 和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。 ⑥ 上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿 (1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5分钟。 ⑦ 将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙 醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下 12000g 离心10 分钟。 ⑧ 弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 离心5-10 分钟。 ⑨ 吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10 分钟或室温干燥。 ⑩ 将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA) 中，储于-20℃冰箱中
3.质粒DNA的检测①取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用②胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里（或电炉上）加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发
3. 质粒DNA的检测 ①取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀 释缓冲液,待用。 ②胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入 50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至 琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过 程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加 热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏（宽约1cm）紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5XTBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起，阻碍缓冲液进入样品槽中，所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约 1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品 梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间 隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待 琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液 形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀, 速度也不可太快,否则容易出现气 泡。待胶完全凝固后拨出 梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽 附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保 证样品槽中应注满缓冲液