绿色荧光蛋白基因的重组背景知识绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP由3个外显子组成，长2.6kb：GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为27.0kD，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理。1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm，宽240nm，由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位手大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成。实验目的学习DNA的酶切、电泳、胶回收纯化、连接、细菌转化和PCR等分子生物学的基本操作方法了解基因重组的一般程序。实验原理将携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达载体pEGFP-N3质粒进行BamHI和NotI双酶切，切割下EGFP基因，同时对原核表达空载体pET32a也进行同样的双酶切产生互补的粘性末端，对切割下的EGFP基因片段和pET32a片段分别进行电泳和切胶纯化后，再进行连接（定向克隆）产生pET32aEGFP重组质粒。以重组质粒转化大肠杆菌克隆菌株DH5α，抗生素筛选后再以菌落PCR法筛选到阳性克隆
1 绿色荧光蛋白基因的重组 背景知识 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括 水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光 激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其 蛋白质一级序列固有的。GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb；GFP 是 由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为 27. 0 kD，其蛋白 性质十分稳定，能耐受 60℃处理。1996 年 GFP 的晶体结构被解出， 蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个 围绕中心 α 螺旋的反平行 β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺 旋开始的，桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直 片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其 蛋白质内部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成。 实验目的 学习 DNA 的酶切、电泳、胶回收纯化、连接、细菌转化和 PCR 等分子生物学的基本操作方法， 了解基因重组的一般程序。 实验原理 将携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的真核表达载体 pEGFP-N3 质粒进行 BamHI 和 NotI 双酶切，切割下 EGFP 基因，同时对原核表达空载体 pET32a 也进行同样的双酶切产生互补的粘性末 端，对切割下的 EGFP 基因片段和 pET32a 片段分别进行电泳和切胶纯化后，再进行连接（定向克 隆）产生 pET32a_EGFP 重组质粒。以重组质粒转化大肠杆菌克隆菌株 DH5α，抗生素筛选后再以菌 落 PCR 法筛选到阳性克隆
1.pEGFP-N3质粒全图谱Asel(8)SnaBIApaLI(341)(4358)MCS(591665)PCMV IEpUCEc001091ori(3852)/HSVTKEGFPpolyApEGFP-N3BsrG I (1385)4.7 kbSV40NotI (1398)Kan'polyAXba |* (1408)Neorf1SV40oriporiPsV40AflIl(1636)Dra III (1870)Stul(2575)591611621631641651661601671EGFPGCTAGC GCTACC GGA CTC AGA TCT CGAGCT CAA GCTTCG AAT TCT GCA GTC GAC GGTACC GCG GGC CCG GGA TCC ATC GCC ACC ATG GTGNhel Eco47 IlIHind IlApalBamHIBglllXholEcoRIPstlSallKpnIXcmlSaclBsp120lXmalAcc1Asp7181Ec/136 1ISacllSmaipEGFP-N3质粒全图谱及多克隆位点实验使用的EGFP基因取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-N3的蛋白质编码序列。此质粒原本被设计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PcMV（巨细胞病毒启动子）真核启动子与SV40（猿猴病毒40）真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的BamHI及NotI限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列。2
2 1．pEGFP-N3 质粒全图谱 pEGFP-N3 质粒全图谱及多克隆位点 实验使用的EGFP基因取自原核-真核穿梭质粒pEGFP-N3的蛋白质编码序列。此质粒原本被设 计于在原核系统中进行扩增，并可在真核哺乳动物细胞中进行表达。本质粒主要包括位于PCMV（巨 细胞病毒启动子）真核启动子与SV40（猿猴病毒40）真核多聚腺苷酸尾部之间的EGFP编码序列与 位于EGFP上游的多克隆位点；一个由SV40 早期启动子启动的卡那霉素/新霉素抗性基因，以及上 游的细菌启动子可启动在原核系统中的复制与卡那抗性。在EGFP编码序列上下游，存在特异的 BamH I及Not I限制性内切酶位点，可切下整段EGFP编码序列
al(158)Xho(158)Eag.(166)Not(166ind Il(173)Sal i(179)2.pET32a质粒全图谱Sac l(190)Bpu1102 (a0)EcoRI(192)BamH(198)EcoR.V(206)Nco l(212)Bgl I(241)Kpnl(238)Dra I(5658)MS1291260Rsrl(589)1 orgin(5434-5889)trxAXba (729)(366SgrA I(840)Sca l(4995)OOSph (996)Pvu I(4885)=5EcoN I(1056)6Pst I(4760)bb)ApaB (1205)12Bsa (4576)Eam1105(4357)lacl(1171),Mlu (1521)pET-32a(+)Bcl (1535)(5900bp)BstE I(1702)Bmg(1730)1Apal(1732)AlwN I(4038)BssH Il(1932)Hpa l(2027)BspLU11(3622)PshA I(2366)Sapl(3506)Bst1107(3393)Psp51(2628)Tth111(3367)BspG I(3148)T7promoterlac operatorXbalrbsMTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATrx-TagHis-TagMsclTATACATATGAGC.315bP..CTGGCCGGTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTCTGGTGCCACGCGGTTCTMetSer105aa..LeuAlaGlySerGlySerGlyHisMetHisHIsHisHiSHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySens-Tagprimer#69945-3S·TagthrombinNspVBalllKpniGGTATGAAAGAAACCGCTGCTGCTAAATTCGAACGCCAGCACATGGACAGCCCAGATCTGGGTACCGACGACGACGACAAGGlyMetLysGluThrAlaAlaAlaLysPheGluArgGInHisMetAspSerProAspLeuGlyThrAspAspAspAspLysTenterokinasepET-32a(+)Ava!1EcoRVBamHIEcoRI SaclSalIHindIlHis·TagNcolXhoGCCATGGCTGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAAlaMetAlaAsplleGlySerGluPheGluLeuArgArgGlnAlaCysGlyArgThrArgAlaProProProProProLeuArgSerGlyCysEndGCCATGGCGATATCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAApET-32b(+)AlaMetAlalleSerAspProAsnSerSerSerValAspLysLeuAlaAlaAlaLeuGluHisHisHisHisHisHisEndGCCATGGGATATCTGTGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAAPET-32C(+)AlaMetGlyTyrLeuTrplleArglleArgAlaProSerThrSerLeuArgProHIsSerSerThrThrThrThrThrThrGlulleArqLeuLeuThrT7terminatorBpu11021CAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGLysProGluArgLysLeuSerTrpLeuLeuProProLeuSerAsnAsnEndT7terminatorprimer#69337-3pET-32a-c(+)cloning/expressionregion表达EGFP蛋白使用的pET32a原核表达载体包含有在多克隆位点两侧的His-tagpoly(His）编码序列：用于表达蛋白的T7启动子以及T7终止子：编码lac阻遏蛋白的lacI编码序列，选择性筛选使用的氨苄青霉素（Amp）抗性序列，pBR322启动子，以及为产生单链DNA产物的f1启动子。3
3 2．pET32a质粒全图谱 表达EGFP 蛋白使用的pET32a原核表达载体包含有在多克隆位点两侧的His-tag poly(His) 编码 序列；用于表达蛋白的T7启动子以及T7 终止子；编码lac阻遏蛋白的lacI编码序列，选择性筛选使 用的氨苄青霉素（Amp）抗性序列，pBR322 启动子，以及为产生单链DNA产物的f1 启动子
准备（周一，约半天）实验一DNA重组（周二，1天）一、实验目的学习使用限制性内切酶及DNA连接酶进行DNA酶切、重组的原理和方法，同时学习琼脂糖凝胶电泳检测和纯化DNA的方法和技术。二、实验原理迄今已发现了3000多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶中最普遍的如EcoRI、HindIII、BamHI和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列：但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC：HindIII识别AAGCTT，BamHI识别GIGATCC；NotI识别GCIGGCCGC）：而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：(i）两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoRI酶切后产生末端；（i）两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末5'-G↓AATTC-3'3'-CTTAA↓G-5"端，如HaelII酶切后产生5"-GG↓CC-3"3”-CC↓GG-5′。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒存在3中构型：超螺旋共价闭合质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒在凝胶电泳中的迁移率不同，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基（-OH)，和在另一条DNA链的5"-末端具有一个磷酸基团（~P）。4
4 准备（周一，约半天） 实验一 DNA 重组（周二，1 天） 一、实验目的 学习使用限制性内切酶及 DNA 连接酶进行 DNA 酶切、重组的原理和方法，同时学习琼脂糖凝 胶电泳检测和纯化 DNA 的方法和技术。 二、实验原理 迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别 位点、辅助因子等因素划分为三大类。II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开 DNA 链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆的一类。 II 型限制性内切酶中最普遍的如 EcoR I、Hind III、BamHI 和 Not I 这样在识别序列中进行切割 的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到 DNA 上，因 而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到 DNA 上，识别非对称序列。一些酶识别连续 的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC；HindIII 识别 AAGCTT; BamHI 识别 G↓GATCC; Not I 识别 GC↓GGCCGC）；而另一些识别不连续的序列（如 Bgl I 识别 GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端：(i) 两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如 EcoR I 酶切后产 生 末端；(ii) 两条链的断裂位置处在一个对称结构的中心，产生平末 端，如 HaeIII 酶切后产生 DNA分子在琼脂糖 凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子在高于等电点的 pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移 动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构 型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与 相对分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子量的DNA，也可以分离相对分 子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒存在3中构型：超螺旋共价闭合质粒DNA，开环质粒 DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生 断裂。这3种构型的质粒在凝胶电泳中的迁移率不同，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒DNA。 DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端 具有一个游离的羟基（-OH），和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团（~ P）。 5’-G↓AATTC-3’ 3’-CTTAA↓G-5’ 5’-GG↓CC-3’ 3’-CC↓GG-5’
ligas53在本实验3'5中，采用BamHI和NotI两种限制酶将EGFP基因从真核表达质粒pEGFP-N3中切割下来（双酶切反应），同时对原核表达载体pET32a质粒也进行同样的双酶切反应，产生具有相同酶切末端的质粒片段。电泳分析(分离)后，将酶切产生的EGFP基因片段和pET32a质粒片段分别进行纯化回收，并由T4DNA连接酶进行连接，获得含pET32aEGFP重组原核表达质粒的连接产物，用于转化大肠杆菌克隆菌株DH5α来进行阳性克隆的筛选。三、实验材料、仪器及试剂3.1实验材料pEGFP-N3质粒，pET-32a质粒3.2仪器准备微波炉、水浴锅、恒温摇床、移液器、电泳槽、电泳仪、制冰机、紫外透射仪3.3试剂1.BamHI酶（碧云天，D6053）2.NotI酶（碧云天，D6497）3.50×TAE电泳缓冲液4.10x凝胶电泳上样缓冲液5.琼脂糖6.DNA荧光染料7.DNA凝胶回收试剂盒8.T4-DNA连接酶及连接缓冲液（碧云天，D7006）四、操作步骤（一）酶切1.在灭菌的EP管中，建立如下双酶切反应体系（20μuL）：反应物（uL）pEGFP-N3体系pET-32a体系质粒<1 μg pEGFP-N3<1μgpET32a2 μL10xbufferO2 μL灭菌水xμLxμLBamHI1 μL1 μLNot I1 μL1 μL
5 在本实验 中，采用 BamH I 和 Not I 两种限制酶将EGFP基因从真核表达质粒pEGFP-N3中切割下来（双酶切反应），同 时对原核表达载体pET32a质粒也进行同样的双酶切反应，产生具有相同酶切末端的质粒片段。电泳 分析(分离)后，将酶切产生的EGFP基因片段和pET32a质粒片段分别进行纯化回收，并由T4 DNA连 接酶进行连接，获得含pET32a_EGFP重组原核表达质粒的连接产物，用于转化大肠杆菌克隆菌株 DH5α来进行阳性克隆的筛选。 三、实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料 pEGFP-N3质粒，pET-32a 质粒 3.2 仪器准备 微波炉、水浴锅、恒温摇床、移液器、电泳槽、电泳仪、制冰机、紫外透射仪 3.3 试剂 1．BamH I 酶（碧云天，D6053） 2．Not I 酶（碧云天，D6497） 3．50 ×TAE 电泳缓冲液 4．10×凝胶电泳上样缓冲液 5．琼脂糖 6．DNA荧光染料 7．DNA凝胶回收试剂盒 8．T4-DNA连接酶及连接缓冲液（碧云天，D7006） 四、操作步骤 （一） 酶切 1． 在灭菌的EP管中，建立如下双酶切反应体系（20 μL）： 反应物（μL） pEGFP-N3 体系 pET-32a 体系 质粒 <1 μg pEGFP-N3 <1 μg pET32a 10×buffer O 2 μL 2 μL 灭菌水 x μL x μL BamH I 1 μL 1 μL Not I 1 μL 1 μL ligas 5’ e 3’ 5’ 3’
总体积20 μL20 μL2.酶最后加入，加样枪轻轻混匀，离心10秒，放置于37℃水浴中酶切1-3小时。（二）酶切产物的电泳检测、分离（该部分操作均应带一次性PE手套！）4.配置1%普通琼脂糖凝胶50mL，0.5g琼脂糖在锥形瓶中溶于50mL1×TAE缓冲液，微波炉加热至完全溶化，取出摇匀，适当放置冷却：5.待溶液温度降至60℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。待凝胶凝固好以后，拨下梳子：6.酶切产物中加入10×上样缓冲液，混匀，用加样枪将酶切液全部加入凝胶孔中：同时加入DNA分子量标准；7.电泳槽中1xTAE电泳缓冲液应淹没凝胶块，接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)，100V（3-4V/cm）电压下电泳30min。8.小心取出凝胶，浸入DNA染色液中，染色（15min）以观察琼脂糖凝胶中的DNA带（戴手套操作！），取出后放置于紫外投射仪中观察结果，照相。（三）回收、纯化酶切产物（采用碧云天DNA凝胶回收试剂盒进行回收）（该部分操作均应带一次性PE手套！）9.切胶：在紫外透射仪中用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下（操作尽量要快快，因为紫外的长时间照射会损伤DNA)，小心转入PE管中：10.回收：（按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行）（四）连接11：在灭过菌的PCR管中按照以下反应体系进行连接，20-25℃C连接1-2小时，或PCR仪中16℃过6
6 2．酶最后加入，加样枪轻轻混匀，离心10秒，放置于37℃水浴中酶切1-3小时。 （二）酶切产物的电泳检测、分离（该部分操作均应带一次性PE手套！） 4．配置1%普通琼脂糖凝胶50 mL，0.5 g 琼脂糖在锥形瓶中溶于50 mL 1×TAE缓冲液，微波 炉加热至完全溶化，取出摇匀，适当放置冷却； 5．待溶液温度降至60℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。待凝胶凝固好以后，拨下梳子； 6．酶切产物中加入10×上样缓冲液，混匀，用加样枪将酶切液全部加入凝胶孔中；同时加入 DNA分子量标准； 7．电泳槽中1×TAE电泳缓冲液应淹没凝胶块，接通电泳槽与电泳仪的电源 (注意正负极， DNA片段从负极向正极移动)，100 V (3-4V/cm) 电压下电泳30 min。 8．小心取出凝胶，浸入DNA染色液中，染色 (15 min) 以观察琼脂糖凝胶中的DNA带 (戴手 套操作！)，取出后放置于紫外投射仪中观察结果，照相。 （三）回收、纯化酶切产物（采用碧云天DNA凝胶回收试剂盒进行回收） （该部分操作均应带一次性PE手套！） 9．切胶：在紫外透射仪中用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下 (操作尽量要快快， 因为紫外的长时间照射会损伤DNA)，小心转入PE管中； 10．回收：（按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行） （四）连接 11．在灭过菌的PCR管中按照以下反应体系进行连接，20-25℃连接1-2小时，或PCR仪中16℃过 总体积 20 μL 20 μL
夜。量反应物回收纯化的pET-32a质粒50-100 ng回收纯化的GFP基因片段约为质粒摩尔数的3倍连接缓冲液（10×）2 μLT4连接酶0.5 μL总体积20μuL（灭菌水补足）实验二大肠杆菌DH5α的转化（周三，约1天）一、实验目的了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。感受态指细菌细胞具有能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用CaC2处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下加入到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，菌细胞膨胀成球形，此时的细胞即呈现为感受态。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，45~90Sec.）诱导细胞吸收DNA。转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。三、实验材料、仪器及试剂3.1实验材料DH5α感受态细胞，实验一的连接产物，EP管，培养血3.2仪器准备水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、振荡培养箱，制冰机3.3试剂1.LB液体培养基（配置每升培养基，在950mL去离子水中加入：胰蛋白陈（typtone）10g，酵母提取物（yeastextract）5g，NaCI10g，用NaOH调节pH至7.0（每升加5mol/LNaOH200μL），加去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min）7
7 夜。 实验二 大肠杆菌 DH5α 的转化（周三，约 1 天） 一、实验目的 了解和掌握质粒 DNA 转化大肠杆菌细胞的原理和方法。 二、实验原理 外源 DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，转化是指质粒 DNA 或以它为载体构建的 重组子导入细菌的过程。感受态指细菌细胞具有能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。大肠杆菌 的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的 CaCl2 溶液 中，便会使细胞膜的透性发生改变，菌细胞膨胀成球形，此时的细胞即呈现为感受态。制备好的大 肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。在 0℃下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激 （42℃，45~90 Sec.）诱导细胞吸收 DNA。 转化了质粒 DNA 的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养 1hr，可使质粒 DNA 中编码抗生素抗性 的基因得以表达，因此，转化了质粒 DNA 的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而 没有转化的细胞则无法生长。 三、实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料 DH5α感受态细胞，实验一的连接产物，EP管，培养皿 3.2 仪器准备 水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、振荡培养箱，制冰机 3.3 试剂 1．LB液体培养基（配置每升培养基，在950 mL去离子水中加入：胰蛋白胨（typtone）10 g， 酵母提取物（yeast extract）5 g，NaCl 10 g，用NaOH调节 pH 至 7.0（每升加5 mol/L NaOH 200 μL），加去离子水至总体积为1L, 121℃ 湿热灭菌 20 min） 反应物 量 回收纯化的pET-32a质粒 50-100 ng 回收纯化的GFP基因片段 约为质粒摩尔数的3倍 连接缓冲液（10×） 2 μL T4连接酶 总体积 0.5 μL 20 μL（灭菌水补足）
2.氨青霉素（Amp），用无菌水配置成30mg/mL溶液，置-20℃储存，抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应使培养基降温至60℃左右后，再加入抗生素（终浓度30μg/mL)。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。4.LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入15g琼脂（Agar）四、操作步骤1.取2管DH5α感受态细胞（100μL），第1管加20μL无菌水（对照），第2管加入质粒DNA溶液20μL（上一实验的DNA连接产物），轻轻混匀，冰上放置30min；2.42℃水浴中热激45~90S，热激后迅速置于冰上冷却5min；3.分别向管中加入800μLLB液体培养基，混匀后在37℃振荡培养50min。4.将两管培养液以4000rpm/min离心3min，弃去上清，用100μuLLB培养液悬浮沉淀，从管1中取50μL均匀涂于含氨青霉素(Amp)和不含氨青霉素的平板上，从管2中取100μL涂于含氨苄青霉素(Amp)的平板上。正面向上放置约10分钟，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养过夜，次日观察。AmAmpAmp管1管1管250 μL50 μL100 μL五、实验结果在含有氨苄青霉素的平板上生长的菌落即为含有pET32aEGFP或pET32a的质粒，4℃保存平板。实验三重组DNA的菌液PCR法筛选（周四，1天）一、实验目的掌握菌液PCR法鉴定重组质粒DNA的基本原理和操作。二、实验原理菌液PCR鉴定：单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模板从5”→3方向延伸，合成DNA的新互补链。8
8 2．氨苄青霉素（Amp），用无菌水配置成30 mg/mL 溶液，置-20℃储存, 抗生素不抗热，如 果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应使培养基降温至60℃左右后，再加入抗生素（终浓度 30 μg/mL）。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气泡。 4．LB固体培养基：每升LB液体培养基中加入15 g 琼脂（Agar） 四、操作步骤 1. 取 2 管 DH5α 感受态细胞（100 μL），第 1 管加 20 μL 无菌水（对照），第 2 管加入质粒 DNA 溶液 20 μL（上一实验的 DNA 连接产物），轻轻混匀，冰上放置 30 min； 2．42℃水浴中热激 45~90 S，热激后迅速置于冰上冷却 5min； 3．分别向管中加入 800 μL LB 液体培养基，混匀后在 37℃振荡培养 50 min。 4．将两管培养液以 4000 rpm/min 离心 3min，弃去上清，用 100 μL LB 培养液悬浮沉淀，从管 1 中取 50 μL 均匀涂于含氨苄青霉素(Amp)和不含氨苄青霉素的平板上，从管 2 中取 100 μL 涂于含 氨苄青霉素(Amp)的平板上。正面向上放置约10分钟, 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃ 培养过夜，次日观察。 五、实验结果 在含有氨苄青霉素的平板上生长的菌落即为含有 pET32a_EGFP 或 pET32a 的质粒，4℃保存平 板。 实验三 重组 DNA 的菌液 PCR 法筛选（周四，1 天） 一、实验目的 掌握菌液 PCR 法鉴定重组质粒 DNA 的基本原理和操作。 二、实验原理 菌液 PCR 鉴定：单菌落或提取的质粒 DNA 也可以通过 PCR 方法鉴定正确克隆。聚合酶链式反 应（Polymerase Chain Reaction，简称 PCR）是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种方法。典型的 PCR 由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的 DNA 置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引 物在低温下分别在目的片段两侧与 DNA 两条链互补结合；DNA 聚合酶在 72℃将单核苷酸从引物的 3’端开始掺入，沿模板从 5’→3’方向延伸，合成 DNA 的新互补链。 管 1 管 1 管 2 50μL 50μL 100μL Am p - Amp + Amp +
具体地说，PCR反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定DNA聚合酶（Tag酶），脱氧核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。三、实验材料、仪器及试剂3.1实验材料15mL无菌带盖塑料离心管，1.5mLEP管，加样枪，枪头3.2仪器准备恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，恒温水域，PCR仪，电泳槽和电泳仪，小型振荡器，紫外投射仪，数码相机3.3试剂1.含Amp的LB液体培养基2.TagDNA聚合酶及相应缓冲液（ET101-01-01，天根）3.4种dNTP混合液（CD117-11，天根）4.pET32a通用PCR引物：S·TagFW：5-GAACGCCAGCACATGGAC-3T7RV:5-GCTAGTTATTGCTCAGCGGT-35.10×凝胶上样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%煎糖）6.DNA凝胶电泳相关试剂四、操作步骤（一）菌液PCR法筛选阳性克隆1.从转化了重组质粒DNA的平板上随机挑取3个单菌落，各自接种于1mL含Amp的LB液体培养基中，1.5mL塑料离心管，37℃振荡培养：2.取100uL菌液置于EP管中，4000rpm以上离心1min，弃上清；3.沉淀重悬于400uL无菌水中，沸水浴中加热5min使细胞破碎，4000rpm以上离心5min，上清液用作PCR鉴定反应中的模板：4.在PCR管中建立以下PCR反应体系（20μL）样品管（μuL，3负对照管（uL，1支）反应体系组分（uL）支)22dNTP (10mM)2210xBuffer（缓冲液，含Mg2+）11正向引物反向引物111模板DNA（3种）-ddH2O12.513.50.50.5Tag酶（5U/μL）5.将PCR管放入PCR扩增仪中，按如下程序进行扩增：9
9 具体地说，PCR 反应系统有寡核苷酸引物，反应缓冲液，热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶），脱氧 核苷三磷酸底物和靶序列（即模板）等五部分组成，缺一不可。 三、实验材料、仪器及试剂 3.1 实验材料 15 mL无菌带盖塑料离心管，1.5mL EP管，加样枪，枪头 3.2 仪器准备 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，恒温水域，PCR仪，电泳槽 和电泳仪，小型振荡器，紫外投射仪，数码相机 3.3 试剂 1．含Amp的LB液体培养基 2．Taq DNA 聚合酶及相应缓冲液（ET101-01-01，天根） 3．4 种 dNTP 混合液（CD117-11，天根） 4．pET32a通用PCR引物：S•Tag_Fw：5’-GAACGCCAGCACATGGAC -3’ T7_Rv：5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGGT-3’ 5．10×凝胶上样缓冲液（0.25% 溴酚蓝，40% 蔗糖） 6．DNA凝胶电泳相关试剂 四、操作步骤 （一）菌液PCR法筛选阳性克隆 1．从转化了重组质粒DNA的平板上随机挑取3个单菌落，各自接种于1 mL 含Amp的LB液体培 养基中，1.5 mL塑料离心管，37℃振荡培养； 2．取 100 μL 菌液置于 EP 管中，4000 rpm 以上离心 1 min，弃上清； 3．沉淀重悬于 400 μL 无菌水中，沸水浴中加热 5 min 使细胞破碎，4000 rpm 以上离心 5 min， 上清液用作 PCR 鉴定反应中的模板； 4．在 PCR 管中建立以下 PCR 反应体系（20 μL） 5. 将PCR管放入PCR扩增仪中，按如下程序进行扩增： 反应体系组分（μL） 样品管（μL, 3 支） 负对照管（μL, 1支） dNTP（10 mM） 2 2 10×Buffer（缓冲液，含Mg2+） 2 2 正向引物 1 1 反向引物 1 1 模板DNA（3种） 1 ─ ddH2O 12.5 13.5 Taq 酶（5U/μL） 0.5 0.5
95℃5min预变性；（95℃50S，52℃50S，72℃80S）25-30个循环：72℃10min延伸6.PCR产物的检测：向PCR管中加入3μL上样缓冲液（10X），进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，照相，确定阳性克隆。PCR鉴定结果10
10 95℃ 5 min 预变性；（95℃ 50 S, 52℃ 50 S, 72℃ 80 S）25-30个循环；72℃ 10 min 延伸； 6．PCR产物的检测：向PCR管中加入3 μL上样缓冲液（10X），进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，照 相，确定阳性克隆。 PCR 鉴定结果