贵州师范大学生物分离工程实验课程大纲（2013级使用）院（部)：生命科学学院编制人：余天华审核人：适用专业：生物工程年日月
贵州师范大学生物分离工程实验课程大纲 （2013 级使用） 院（部）： _生命科学学院_ 编制人：_ 余天华_ 审核人：_ 适用专业：_生物工程_ 年 月 日
《生物分离工程实验》实验大纲课程名称：生物分离工程实验课程代码：2310900003学分：2学时：32适用专业（专业类）：生物工程一、课程的目的与任务：本实验课程是对理论教学课程的运用，训练学生掌握生物分离工程最基本的操作技能，了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过实验培养学生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。二、实验项目与学时分配（宋体五号粗体）：内容（宋体五号）实验性质备注学序号实验项目时验综设必选计做证合做实验一：藤茶中二氢杨梅素20J（DMY）的提取、纯化与检测实验二：菌物发酵液中212活性物质的V提取与分析三、课程的基本内容：实验一：藤茶中二氢杨梅素（DMY）的提取、纯化与检测I二氢杨梅素的提取与预纯化1.实验目的：掌握提取藤茶中DMY前的预处理、水提藤茶中DMY及对浸提液进行抽滤和2．结晶的操作流程。2.实验内容：黄酮类化合物单体多为晶体，少数（如黄酮苷类）为无定型粉末。黄酮的聚集状态很大程度上是由其纯度决定的，纯度越高，越呈现晶体状态。植物中提取的黄酮多为总黄酮混合物，会掺杂黄酮苷等不易分离的物质，故纯度不高，为粉末晶体混杂状态，常显黄色。二氢杨梅素（(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3.4,5-三羟基苯基）苯并二氢吡喃-4-酮，Dihydromyricetin，DMY）（图1）具有六个羟基，其中有五个为酚羟基，易溶于丙酮、甲醇、乙醇、热水等极性溶剂，不溶于石油醚等非极性溶剂
《生物分离工程实验》实验大纲 课程名称：生物分离工程实验 课程代码：2310900003 学 分：2 学 时：32 适用专业（专业类）：生物工程 一、课程的目的与任务：本实验课程是对理论教学课程的运用，训练学生掌握生物分离工程最 基本的操作技能，了解生物分离的基本知识，加深理解课堂讲授的某些生物分离理论，同时，通过 实验培养学生观察思考、分析问题和解决问题的能力，培养学生实事求是、严肃认真的科学态度以 及勤俭节约、爱护公物的良好作风，为今后的学习和工作打下坚实的基础。 二、实验项目与学时分配（宋体 五号 粗体）：内容（宋体 五号） 序号 实验项目 学 时 实验性质 备注 验 证 综 合 设 计 必 做 选 做 1 实验一： 藤茶中二氢 杨梅素 （DMY）的 提取、纯化 与检测 20 √ √ 2 实验二：菌 物发酵液中 活性物质的 提取与分析 12 √ √ 三、课程的基本内容： 实验一：藤茶中二氢杨梅素（DMY）的提取、纯化与检测 Ⅰ 二氢杨梅素的提取与预纯化 1． 实验目的：掌握提取藤茶中 DMY 前的预处理、水提藤茶中 DMY 及对浸提液进行抽滤和 2． 结晶的操作流程。 2．实验内容：黄酮类化合物单体多为晶体，少数（如黄酮苷类）为无定型粉末。黄酮的聚集 状态很大程度上是由其纯度决定的，纯度越高，越呈现晶体状态。植物中提取的黄酮多为总黄酮混 合物，会掺杂黄酮苷等不易分离的物质，故纯度不高，为粉末晶体混杂状态，常显黄色。 二氢杨梅素（(2R,3R)-3,5,7-三羟基-2-(3,4,5-三羟基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮，Dihydromyricetin， DMY）（图 1）具有六个羟基，其中有五个为酚羟基，易溶于丙酮、甲醇、乙醇、热水等极性溶剂， 不溶于石油醚等非极性溶剂
JHO-OFVOHOHO图1：二氢杨梅素结构示意图二氢杨梅素对水温具有溶解依赖性，DMY在45℃以下溶解度很低，70℃左右溶解度增加较快，至95℃变化则不明显。故可用结晶法对其进行初步纯化。生产和研究中采用的重结晶方法可制取较高纯度的黄酮化合物，此法对藤茶中富含的二氢杨梅素的纯化更为有效，一般经过三次重结晶就可获得90%以上纯度的二氢杨梅素。ⅡI双水相萃取法纯化DMY1.实验目的：通过双水相萃取法纯化DMY，掌握双水相萃取法在生物产品纯化过程中的应用。2.实验内容：传统的分离技术获得的产品收率小，纯度低，成本高，在一定程度上阻碍了产品的工业化发展。双水相体系具有分相快，使用温度低，易于操作等特点。随着双水相技术研究的不断深入，新的双水相体系，如表面活性剂-表面活性剂体系、普通有机物-无机盐体系、双水相胶束体系等相继出现，其中普通有机物型双水相体系最大的优点是价廉、低毒、溶剂的回收利用及后续处理工作简单，且由于组成体系成分的极性较大，尤其适用于极性物质的提取和分离。目前已有乙醇、丙醇、异丙醇等普通有机物与无机盐形成的双水相体系被用于天然产物等的分离。由于藤茶中二氢杨梅素含量高而黄酮苷含量低，且其具有相同的母核结构，所以二氢杨梅素提取的主要难题即是除去与之共存的大量的苷。二氢杨梅素较易溶于丙酮溶液，而黄酮苷在丙酮中的溶解度较小，在水中溶解度较大，因此可用内酮-盐溶液体系纯化二氢杨梅素。根据预试验结果，利用二氢杨梅素几不溶于水，易溶于丙酮，而黄酮苷易溶于水，难溶于丙酮的性质，确定用丙酮作为所选双水相体系的有机相主成分。此外，丙酮沸点较低，易回收。因此，本实验结合普通有机物型双水相体系的优势，以丙酮盐体系作为研究对象，研究硫酸铵在该体系中分相能力，并以此体系纯化二氢杨梅素。I制备薄层层析（PTLC）法纯化DMY1.实验目的：掌握PTLC的制备方法及生物产品分离纯化过程中的原理及应用。2．实验内容：制备薄层色谱法也是薄层层析法，属于吸附层析分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而使各成分互相分离，通过分别收取不同层析条带的化合物，可实现自标化合物制备的目的。PTLC可分离克量级的样品，绝大多数情况下用它来分离毫克级的样品。制备薄层色谱和柱吸附色谱一样，化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而比移值（Rr值）较小。利用化合物极性的不同，用硅胶薄层色谱可将一些结构相近或顺反异构体分开。IVDMY纯度的测定1.实验目的：了解高效液相色谱的结构及其特点，掌握其检测原理。2.实验内容：高效液相色谱仪的系统由储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部
O OH OH OH HO O OH OH 图 1： 二氢杨梅素结构示意图 二氢杨梅素对水温具有溶解依赖性，DMY 在 45℃以下溶解度很低，70℃左右溶解度增加较快， 至 95℃变化则不明显。故可用结晶法对其进行初步纯化。生产和研究中采用的重结晶方法可制取较 高纯度的黄酮化合物，此法对藤茶中富含的二氢杨梅素的纯化更为有效，一般经过三次重结晶就可 获得 90%以上纯度的二氢杨梅素。 Ⅱ 双水相萃取法纯化 DMY 1．实验目的：通过双水相萃取法纯化 DMY，掌握双水相萃取法在生物产品纯化过程中的应用。 2．实验内容：传统的分离技术获得的产品收率小，纯度低，成本高，在一定程度上阻碍了产 品的工业化发展。双水相体系具有分相快，使用温度低，易于操作等特点。 随着双水相技术研究的不断深入，新的双水相体系，如表面活性剂-表面活性剂体系、普通有机 物-无机盐体系、双水相胶束体系等相继出现，其中普通有机物型双水相体系最大的优点是价廉、低 毒、溶剂的回收利用及后续处理工作简单，且由于组成体系成分的极性较大，尤其适用于极性物质 的提取和分离。目前已有乙醇、丙醇、异丙醇等普通有机物与无机盐形成的双水相体系被用于天然 产物等的分离。 由于藤茶中二氢杨梅素含量高而黄酮苷含量低，且其具有相同的母核结构，所以二氢杨梅素提 取的主要难题即是除去与之共存的大量的苷。二氢杨梅素较易溶于丙酮溶液，而黄酮苷在丙酮中的 溶解度较小，在水中溶解度较大，因此可用丙酮-盐溶液体系纯化二氢杨梅素。根据预试验结果，利 用二氢杨梅素几不溶于水，易溶于丙酮，而黄酮苷易溶于水，难溶于丙酮的性质，确定用丙酮作为 所选双水相体系的有机相主成分。此外，丙酮沸点较低，易回收。 因此，本实验结合普通有机物型双水相体系的优势，以丙酮盐体系作为研究对象，研究硫酸铵 在该体系中分相能力，并以此体系纯化二氢杨梅素。 Ⅲ 制备薄层层析（PTLC）法纯化 DMY 1．实验目的：掌握 PTLC 的制备方法及生物产品分离纯化过程中的原理及应用。 2．实验内容：制备薄层色谱法也是薄层层析法，属于吸附层析分离法，它利用各成分对同一 吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸 附、再吸附、再解吸附，从而使各成分互相分离，通过分别收取不同层析条带的化合物，可实现目 标化合物制备的目的。PTLC 可分离克量级的样品，绝大多数情况下用它来分离毫克级的样品。制备 薄层色谱和柱吸附色谱一样，化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附 较强，因而比移值（Rf 值）较小。利用化合物极性的不同，用硅胶薄层色谱可将一些结构相近或顺 反异构体分开。 Ⅳ DMY 纯度的测定 1．实验目的：了解高效液相色谱的结构及其特点，掌握其检测原理。 2．实验内容：高效液相色谱仪的系统由储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部
分组成。储液瓶中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附、解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式呈现出来。DMY在292nm波长处有最大吸收峰，其浓度（X）与峰面积（A）呈线性相关，以此可以确定供试品溶液中的含量（m），配制供试品所需的结晶质量为M，因此通过关系式①可计算获得的DMY的纯度。思考题：1、影响DMY结晶速率的因素有哪些？2、如果PTLC操作取得的晶体特别少，无法刮取，你会用什么方法进行纯度测定工作？3、工业生产DMY一般采用实验I，请分析此法的优缺点。4、分析本实验过程中你的成功和失误之处。实验二：菌物发酵液中活性物质的提取与分析I液液萃取法提取发酵液活性物质1.实验目的：掌握萃取的原理及应用。2.实验内容：液体培养物含有大量的水溶性物质，和培养物产生的次级代谢产物，在发酵液中加入与其不相混溶（或稍相混溶）的选定的溶剂（如乙酸乙酯），利用发酵液中各组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目的。萃取剂一般选取沸点较低的溶剂，以利于工业生产和萃取剂循环回收利用。ⅡI薄层显色法鉴定活性物质1.实验目的：掌握PTLC在生物产品分离纯化过程中的原理及应用。2.实验内容：薄层层析法，属于吸附层析分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而使各成分互相分离。化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而比移值（Rf值）较小。利用化合物极性的不同，用硅胶薄层色谱可将一些结构相近或顺反异构体分开。IⅡI高压液相色谱（HPLC）法检测活性物质1.实验目的：掌握高效液相色谱的检测原理。2.实验内容：高效液相色谱仪的系统由储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液瓶中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附、解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式呈现出来。含有苯环的化合物如黄酮、多酚等在254nm波长处有吸收峰，其浓度（X）与峰面积（A）呈线性相关，以此可以确定供试品溶液中化合物的种类及相对含量。思考题：1、影响发酵液萃取的因素有哪些？
分组成。 储液瓶中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固 定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反 复多次的吸附、解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从 柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式呈现出来。 DMY 在 292nm 波长处有最大吸收峰，其浓度（X）与峰面积（A）呈线性相关，以此可以确定 供试品溶液中的含量（m），配制供试品所需的结晶质量为 M，因此通过关系式①可计算获得的 DMY 的纯度。 思考题： 1、影响 DMY 结晶速率的因素有哪些？ 2、如果 PTLC 操作取得的晶体特别少，无法刮取，你会用什么方法进行纯度测定工作？ 3、工业生产 DMY 一般采用实验Ⅰ，请分析此法的优缺点。 4、分析本实验过程中你的成功和失误之处。 实验二：菌物发酵液中活性物质的提取与分析 Ⅰ 液液萃取法提取发酵液活性物质 1．实验目的：掌握萃取的原理及应用。 2．实验内容：液体培养物含有大量的水溶性物质，和培养物产生的次级代谢产物，在发酵液 中加入与其不相混溶（或稍相混溶）的选定的溶剂（如乙酸乙酯），利用发酵液中各组分在溶剂中的 不同溶解度而达到分离或提取目的。萃取剂一般选取沸点较低的溶剂，以利于工业生产和萃取剂循 环回收利用。 Ⅱ 薄层显色法鉴定活性物质 1．实验目的：掌握 PTLC 在生物产品分离纯化过程中的原理及应用。 2．实验内容：薄层层析法，属于吸附层析分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同， 使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸 附，从而使各成分互相分离。化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附 较强，因而比移值（Rf 值）较小。利用化合物极性的不同，用硅胶薄层色谱可将一些结构相近或顺 反异构体分开。 Ⅲ 高压液相色谱（HPLC）法检测活性物质 1．实验目的：掌握高效液相色谱的检测原理。 2．实验内容：高效液相色谱仪的系统由储液瓶、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部 分组成。 储液瓶中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固 定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反 复多次的吸附、解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从 柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式呈现出来。 含有苯环的化合物如黄酮、多酚等在 254nm 波长处有吸收峰，其浓度（X）与峰面积（A）呈线 性相关，以此可以确定供试品溶液中化合物的种类及相对含量。 思考题： 1、影响发酵液萃取的因素有哪些？
2、影响TLC鉴定结果的因素有哪些？3、评价生物分离工程技术对微生物产品开发的意义。4、分析本实验过程中你的成功和失误之处。四、课程的考核：实验考核成绩采用以百分计算，采用实验平时成绩（包括实验纪律、实验操作和记录等）占总成绩的30%，实验报告考核成绩（包括格式、内容、结果分析及讨论等）占总成绩的30%，实验设计考核（在规定时间内以答卷的形式进行）占总成绩的40%。五、课程参考书、指导书：1．刘叶青、生物分离工程试验、高等教育出版社、20072.刘同军、生物分离工程试验、山东轻工业学院、20063.欧阳平凯、生物分离原理与技术、第二版、化学工业出版社、2010
2、影响 TLC 鉴定结果的因素有哪些？ 3、评价生物分离工程技术对微生物产品开发的意义。 4、分析本实验过程中你的成功和失误之处。 四、课程的考核： 实验考核成绩采用以百分计算，采用实验平时成绩（包括实验纪律、实验操作和记录等）占总 成绩的 30%，实验报告考核成绩（包括格式、内容、结果分析及讨论等）占总成绩的 30%，实验设计 考核（在规定时间内以答卷的形式进行）占总成绩的 40%。 五、课程参考书、指导书： 1． 刘叶青、生物分离工程试验、高等教育出版社、2007 2．刘同军、生物分离工程试验、山东轻工业学院、2006 3. 欧阳平凯、生物分离原理与技术、第二版、化学工业出版社、2010