贵州师范大学：生命科学学院《微生物学实验》课程授课教案.pdf_大学文库

《微生物学》实验课教案一、目的要求训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时通过实验课教学提高学生动手能力及观察、解决、分析问题的能力，培养严肃认真、实事求是的科学态度。二、实验室规则微生物学实验是一个严肃的实验场地，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，预期数量、条件、感染途径等有关，为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施（一）每次实验前应对实验内容充分预习，并到生物学实验教学中心网站（http://skysyzx.gznu.edu.cn/）查看实验相关视频和课件，了解实验目的、原理和方法。（二）学生应按规定时间进入实验室。保持实验室安静，不得进行与实验无关的活动。（三）事先准备好实验用的材料和工具，实验后清洗干净，查点清楚，原样放回。（四）每次的实验报告应在教师指定时间内完成。（五）实验结束，于离开实验室前，应清理好自已的实验桌，要轮流打扫实验室保持整洁。（六）爱护实验室的一切物品，避免损坏或浪费。损坏物品时，应主动向教师报告。和操作步骤。把必需的实验用品带到实验室。(二)实验开始时应认真听教师的讲解。三、实验报告（一）除绘图外，实验报告还包括解答实验指导中提出的问题和必要的记录等，并应把它写在笔记本上。（二）实验报告须用钢笔或圆珠笔书写，两行之间应留适当空隙，以便教师修改，每次实验报告及笔记均另起一页。实验一培养基的制备与消毒灭菌教学目标1.了解微生物培养基性质和配制方法。2．了解几种常用灭菌原理以及方法。教学重点1、配制培养基的原理与方法2、常用灭菌方法和注意事项

《微生物学》实验课教案一、目的要求训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时通过实验课教学提高学生动手能力及观察、解决、分析问题的能力，培养严肃认真、实事求是的科学态度。二、实验室规则微生物学实验是一个严肃的实验场地，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，预期数量、条件、感染途径等有关，为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施：（一）每次实验前应对实验内容充分预习，并到生物学实验教学中心网站（http://skysyzx.gznu.edu.cn/）查看实验相关视频和课件，了解实验目的、原理和方法。（二）学生应按规定时间进入实验室。保持实验室安静，不得进行与实验无关的活动。（三）事先准备好实验用的材料和工具，实验后清洗干净，查点清楚，原样放回。（四）每次的实验报告应在教师指定时间内完成。（五）实验结束，于离开实验室前，应清理好自己的实验桌，要轮流打扫实验室，保持整洁。（六）爱护实验室的一切物品，避免损坏或浪费。损坏物品时，应主动向教师报告。和操作步骤。把必需的实验用品带到实验室。 (二)实验开始时应认真听教师的讲解。三、实验报告 (一)除绘图外，实验报告还包括解答实验指导中提出的问题和必要的记录等，并应把它写在笔记本上。 (二)实验报告须用钢笔或圆珠笔书写，两行之间应留适当空隙，以便教师修改，每次实验报告及笔记均另起一页。实验一培养基的制备与消毒灭菌教学目标 1．了解微生物培养基性质和配制方法。 2．了解几种常用灭菌原理以及方法。教学重点 1、配制培养基的原理与方法 2、常用灭菌方法和注意事项

教学方法课堂讲授、指导学生操作课时安排4课时实验器材1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白陈，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl，KH,PO4，MgSO4·7H,OKNO31g，K2HPO4.3H20，FeSO4.7H2O，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素2、仪器和其它用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，药匙，pH试纸，纱布，高压蒸汽灭菌锅等课程内容牛肉膏蛋白陈培养基的制备一、实验原理（一）培养基的配制培养基一一是按照微生物生长繁殖所需要的各种物质，用人工方法配制而成的一种基质（也就是讲，这种培养基是微生物的食物），培养基中含有C、N、无机盐、维生素以及水，这些成分提供了微生物能源以及新陈代谢中所起的调节作用，从而来合成细胞物质。由于微生物营养种类不同（营养类型不同），它们对营养物质的要求也各不相同。因此需要配制各种不同的培养基，以适应各种微生物对营养的要求。配制培养基除了考虑上面提到的营养要求外，还需要考虑微生物生长的其它条件，如适应的酸减度（PH），渗透压等。因此根据不同微生物对酸碱度的要求，需要将培养基调到一定的pH范围（象细菌和放线菌适应在偏碱性的条件下生长，一般在配制培养基时，将pH值调到7.2~7.6左右，而真菌适应在偏酸性的条件下生长，一般在配制时把培养基调到4.5~6.0，通常pH自然）。其次根据培养基所选用的营养物质的来源不同，可将培养基分为：①天然培养基、②半合成培养基、③合成培养基：另外按照培养基物理形状的不同，可将培养基分为：①液体培养基、②固体培养基、③半固体培养基三种形状。固体培养基和液体培养基所含的营养成分相同，不同处，只是在液体培养基中加入一种凝固剂作支持物，我们通常用的支持物是1.5~2%的琼脂（洋菜），但也可用明胶和硅胶等。因明胶和硅胶容易被大部分微生物分解，因而不常用，以及根据培养基使用的目的不同，又将培养基分为：①繁殖培养基、②保存培养基、③加富培养基、④选择培养基、③鉴别培养基等。使用培养基的原则是根据不同的微生物和不同的目的来选择所需要的培养基。二、操作步骤牛肉膏蛋白陈培养基的制备1.称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白陈、NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面血中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白陈很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。（牛肉膏3.0g，蛋白陈10.0g，NaC15.0g，水1000mL，琼脂15-20g）2.溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药

教学方法课堂讲授、指导学生操作课时安排 4课时实验器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl，KH2 PO4，MgSO4·7H2O， KNO3 1g，K2HPO4· 3H2O，FeSO4· 7H2O，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素 2、仪器和其它用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，药匙，pH试纸，纱布，高压蒸汽灭菌锅等课程内容牛肉膏蛋白胨培养基的制备一、实验原理（一）培养基的配制培养基——是按照微生物生长繁殖所需要的各种物质，用人工方法配制而成的一种基质（也就是讲，这种培养基是微生物的食物），培养基中含有C、N、无机盐、维生素以及水，这些成分提供了微生物能源以及新陈代谢中所起的调节作用，从而来合成细胞物质。由于微生物营养种类不同（营养类型不同），它们对营养物质的要求也各不相同。因此需要配制各种不同的培养基，以适应各种微生物对营养的要求。配制培养基除了考虑上面提到的营养要求外，还需要考虑微生物生长的其它条件，如适应的酸碱度（PH），渗透压等。因此根据不同微生物对酸碱度的要求，需要将培养基调到一定的pH范围（象细菌和放线菌适应在偏碱性的条件下生长，一般在配制培养基时，将pH值调到7.2~7.6左右，而真菌适应在偏酸性的条件下生长，一般在配制时把培养基调到4.5~6.0，通常pH自然）。其次根据培养基所选用的营养物质的来源不同，可将培养基分为：①天然培养基、②半合成培养基、③合成培养基；另外按照培养基物理形状的不同，可将培养基分为：①液体培养基、②固体培养基、③半固体培养基三种形状。固体培养基和液体培养基所含的营养成分相同，不同处，只是在液体培养基中加入一种凝固剂作支持物，我们通常用的支持物是1.5~2%的琼脂（洋菜），但也可用明胶和硅胶等。因明胶和硅胶容易被大部分微生物分解，因而不常用，以及根据培养基使用的目的不同，又将培养基分为：①繁殖培养基、②保存培养基、③加富培养基、④选择培养基、⑤鉴别培养基等。使用培养基的原则是根据不同的微生物和不同的目的来选择所需要的培养基。二、操作步骤牛肉膏蛋白胨培养基的制备 1．称量按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。（牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000mL，琼脂 15-20g） 2．溶化在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药

品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3.调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.4-7.6。反之，则用1mol/LHCI进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。4.过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。5.分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。6.加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能7.包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期，8.灭菌将上述培养基以0.1MPa，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。9.搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。10.无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24一48小时，以检查灭菌是否彻底高氏1号培养基的制备配方：可溶性淀粉20g，NaC10.5g，KNO31g，K,HPO4.3H20，MgSO4.7H2O，FeSO4.7H20琼脂15-25g，水1000ml，pH7.4-7.6（1）称量与溶化：按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状再加入少量所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次溶化。对微量成分FeSO4.7H20可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入，方法是现在100mL水中加入1gFeSO4.7H20，配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mLde0.01g/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补足水。如要配置固体的培养基，溶化过程同牛肉膏蛋白陈培养基的制备

品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。 3．调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.4-7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。 4．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。 5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。 (1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。 (2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。 (3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 6．加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7．包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。 8．灭菌将上述培养基以0.1MPa，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。 9．搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 10．无菌检查将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。高氏1号培养基的制备配方：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4· 3H2O，MgSO4· 7H2O，FeSO4· 7H2O，琼脂15-25g，水1000ml，pH7.4-7.6 （1）称量与溶化：按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少量所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次溶化。对微量成分FeSO4· 7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入，方法是现在100mL水中加入1gFeSO4· 7H2O，配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mLde 0.01g/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补足水。如要配置固体的培养基，溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基的制备

（2）剩下步骤同牛肉膏蛋白陈培养基的制备马丁氏培养基的制备马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白陈、KH2PO4MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，RoseBengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白陈主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。配方：KH2PO41gMgS04.7H200.5g蛋白陈5g葡萄糖10g琼脂15—20g水1000ml自然pH此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml.灭菌和消毒（disinfection&sterilization）灭菌和消毒是微生物学实验中最常用的基本技术之一。灭菌一一是应用物理和化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物的细胞和芽孢。一般可用高温过滤或其它的物理、化学方法使器血、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽泡完全杀死或除去。指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒一一是应用物理和化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（特别是病原微生物），物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死，但已不致引起有害作用。一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌的方法可分为四大类：（1）加热灭菌、（2）过滤除菌、（3）辐射灭菌、（4）化学药品灭菌。虽然灭菌的方法有很多种，但由于灭菌的对象不同，实验的目的不同，所采用的灭菌方法也有所差别。例如，一般玻璃器血可采用干热灭菌、培养基可采用高压蒸汽灭菌、对某些不耐高温的培养基则用间歇灭菌或过滤灭菌，无菌室、无菌罩等一般用紫外线或化学药剂处理，如甲醛喷雾或蒸熏等方法灭菌。本实验只讲加热灭菌。加热灭菌又分为干热灭菌和湿热灭菌两类

（2）剩下步骤同牛肉膏蛋白胨培养基的制备马丁氏培养基的制备马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2 PO4、 MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2 PO4和MgSO4 ·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。配方：KH2 PO4 1g MgSO4·7H2O 0.5g 蛋白胨 5g 葡萄糖 10g 琼脂 15—20g 水 1000ml pH 自然此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1%链霉素液 0.3ml。灭菌和消毒（disinfection & sterilization）灭菌和消毒是微生物学实验中最常用的基本技术之一。灭菌——是应用物理和化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物的细胞和芽孢。一般可用高温过滤或其它的物理、化学方法使器皿、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽孢完全杀死或除去。指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒——是应用物理和化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（特别是病原微生物），物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死，但已不致引起有害作用。一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌的方法可分为四大类：（1）加热灭菌、（2）过滤除菌、（3）辐射灭菌、（4）化学药品灭菌。虽然灭菌的方法有很多种，但由于灭菌的对象不同，实验的目的不同，所采用的灭菌方法也有所差别。例如，一般玻璃器皿可采用干热灭菌、培养基可采用高压蒸汽灭菌、对某些不耐高温的培养基则用间歇灭菌或过滤灭菌，无菌室、无菌罩等一般用紫外线或化学药剂处理，如甲醛喷雾或蒸熏等方法灭菌。本实验只讲加热灭菌。加热灭菌又分为干热灭菌和湿热灭菌两类

1.干热灭菌干热灭菌又分为火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。（1）火焰烧灼灭菌直接用火焰灼烧灭菌，对接种环、接种针、玻棒或其它金属用具如镊子、解部刀等采用此方法灭菌。（2）干热灭菌（热空气灭菌）是在电烤箱内利用高温干燥的热空气（160~170°C）使物体升温，然后导致物体上所带的微生物由于干热脱水（细胞内的蛋白质凝固变性）而死亡，这种方法常用于玻璃器血等用具的灭菌。对于橡胶制品、塑料制品以及培养基等不能用此法灭菌。其过程如下：①将要灭菌的器皿（培养皿、试管、吸管等）用报纸包扎好，放入烘箱内。②接通电源，拨开开关，打开电烘箱排气孔，旋开恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100°C时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内温度停止加温，此时如果还未达到所需的160~170°C，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。旋动恒温调节器到160℃，当到此温时，借助于恒温调节的自动控制，保持恒温2小时。③时间一到，关掉电源，当温度降到大约40~50℃（<70°C）后，打开箱门，取出器，并将调节器旋转到“0”。注意事项：①灭菌物品在箱内不能堆放的太满，一般不要超过总容器的2/3，灭菌物品之间应留有一定空隙。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以免包装纸烤焦起火。②灭菌的器血必须干燥，否则容易破裂③灭菌的温度不能超过180℃，否则棉花和纸等要烧焦，甚至发生事故，所以，在使用时，要随时检查温度情况，以防止自动恒稳调节器失调。④灭菌后，如温度没降下就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器血就破裂。2.湿热灭菌湿热灭菌又分为高压蒸气灭菌、常压蒸气灭菌、巴斯德消毒法、煮沸消毒法和超高温杀菌等。本实验只讲高压蒸汽灭菌。高压蒸气灭菌是根据蒸气温度随压力的增加而提高，压力越大，温度越高的原理。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸气灭菌锅中进行的。在此密闭容器中，加热使灭菌锅隔套间的水沸腾产生水蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱除尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到了高于100℃的蒸气温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的，在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽温度。般将灭菌器中压力提高一个压力（即15磅/平方时或1.05公斤/平方厘米），灭菌15~30分钟，此时的温度是121.5℃，则可达到完全灭菌的要求。其过程如下：①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。）

1.干热灭菌干热灭菌又分为火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。（1）火焰烧灼灭菌直接用火焰灼烧灭菌，对接种环、接种针、玻棒或其它金属用具如镊子、解剖刀等采用此方法灭菌。（2）干热灭菌（热空气灭菌）是在电烤箱内利用高温干燥的热空气（160~170°C）使物体升温，然后导致物体上所带的微生物由于干热脱水（细胞内的蛋白质凝固变性）而死亡，这种方法常用于玻璃器皿等用具的灭菌。对于橡胶制品、塑料制品以及培养基等不能用此法灭菌。其过程如下： ①将要灭菌的器皿（培养皿、试管、吸管等）用报纸包扎好，放入烘箱内。 ②接通电源，拨开开关，打开电烘箱排气孔，旋开恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100°C时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内温度停止加温，此时如果还未达到所需的160~170°C，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。旋动恒温调节器到160℃，当到此温时，借助于恒温调节的自动控制，保持恒温2小时。 ③时间一到，关掉电源，当温度降到大约40~50℃（<70°C）后，打开箱门，取出器皿，并将调节器旋转到“0”。注意事项： ①灭菌物品在箱内不能堆放的太满，一般不要超过总容器的2/3，灭菌物品之间应留有一定空隙。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以免包装纸烤焦起火。 ②灭菌的器皿必须干燥，否则容易破裂。 ③灭菌的温度不能超过180℃，否则棉花和纸等要烧焦，甚至发生事故，所以，在使用时，要随时检查温度情况，以防止自动恒稳调节器失调。 ④灭菌后，如温度没降下就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器皿就破裂。 2.湿热灭菌湿热灭菌又分为高压蒸气灭菌、常压蒸气灭菌、巴斯德消毒法、煮沸消毒法和超高温杀菌等。本实验只讲高压蒸汽灭菌。高压蒸气灭菌是根据蒸气温度随压力的增加而提高，压力越大，温度越高的原理。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸气灭菌锅中进行的。在此密闭容器中，加热使灭菌锅隔套间的水沸腾产生水蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱除尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到了高于100℃的蒸气温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽温度。一般将灭菌器中压力提高一个压力（即15磅/平方时或1.05公斤/平方厘米），灭菌15~30分钟，此时的温度是121.5℃，则可达到完全灭菌的要求。其过程如下： ①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。）

②放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而投入棉塞。③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称得方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。④打开加热开关，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力）③灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。（压力一定要降到O时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由子内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者）③将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。3.灭菌→无菌检查作业1.按成分的不同可将培养基分为哪几种？2.按培养基的物理状态又分为哪几种？3.牛肉膏蛋白陈培养基是否要调pH？调到多少？4.培养基、无菌水等用哪种灭菌方法？5.热空气灭菌所需要的时间和温度分别是多少？6.热空气灭菌和高压蒸汽灭菌适应于哪些物品的灭菌？准备工作：每组6个-7个人，一张纱布一团棉花，3个250ml三角瓶，一个100ml三角瓶并放玻璃珠，一个糖瓷缸和一根玻棒，6根棉线绳，6根18*180试管，18套培养血，1根10ml吸管和洗耳球，3张报纸，裁好的报纸条牛皮纸4张，1ml吸管6根，一个带游码的天平，线球一个，配制培养基所需药品，药匙勺、pH试纸等。操作步骤：第1、2组配制400-500ml牛肉膏蛋白陈培养基分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第3、4组配制高氏1号培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第5、6组配制马氏培养基400-500m分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。每组每人装9ml自来水放入试管中，做一个棉塞，给带有玻璃珠的三角瓶加入45ml自来水，包培养血3包每包6-7套（看每组人多少而定），每人包吸管一根，注上班级组号，实验二微生物的分离与纯化

②放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而投入棉塞。 ③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称得方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 ④打开加热开关，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力） ⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。(压力一定要降到0时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者) ⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。 3．灭菌→无菌检查作业 1．按成分的不同可将培养基分为哪几种？ 2．按培养基的物理状态又分为哪几种？ 3．牛肉膏蛋白胨培养基是否要调pH？调到多少？ 4．培养基、无菌水等用哪种灭菌方法？ 5．热空气灭菌所需要的时间和温度分别是多少？ 6．热空气灭菌和高压蒸汽灭菌适应于哪些物品的灭菌？准备工作：每组6个-7个人，一张纱布一团棉花，3个250ml三角瓶，一个100ml三角瓶并放玻璃珠，一个搪瓷缸和一根玻棒，6根棉线绳，6根18*180试管，18套培养皿，1根10ml吸管和洗耳球，3张报纸，裁好的报纸条牛皮纸4张，1ml吸管6根，一个带游码的天平，线球一个，配制培养基所需药品，药匙勺、pH试纸等。操作步骤：第1、2组配制400-500ml牛肉膏蛋白胨培养基分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第3、4组配制高氏1号培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第5、6组配制马丁氏培养基400-500ml 分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。每组每人装9ml自来水放入试管中，做一个棉塞，给带有玻璃珠的三角瓶加入45ml自来水，包培养皿3包每包6-7套（看每组人多少而定），每人包吸管一根，注上班级组号。实验二微生物的分离与纯化

教学目标1.初步掌握微生物的分离、培养的基本方法。2.练习微生物接种移殖和培养的基本技术。教学重点分离纯化的基本操作技术。教学方法课堂讲授课时安排4课时教学过程一、实验原理（一）微生物的分离微生物的分离是微生物学中的一个最重要的基本技术，因此要求熟练地掌握。工农业及科学实验上所用的微生物菌种，最初都是从自然界筛选出来的。自然界的微生物种类非常多，分布极广，要从自然界找到我们需要的特殊菌种，就必须把它们从许许多多不同的杂种中分离出来。然后根据生长上的要求和菌种的特性，用各种不同的筛选方法，挑选出性能良好符合生产科研要求的纯种。什么叫微生物的纯培养呢？就是在一种培养物中只生长一种微生物，而绝对没有其它微生物混杂其内，所产生的后代。到什么地方可以采到含有我们所需要的菌种的样品呢？这要根据所需菌种的特性和其它有关因素而确定。一般地说，土壤中是菌种取样的主要源泉。但其它地方也有，如污水、动物粪便以及动植物的病原组织等也有量的微生物存在。例如我们要筛选分解纤维素的微生物，首先就要考虑分解纤维素的微生物和纤维素的关系，纤维素是分解纤维素微生物的物质基础，离开纤维素就无所谓对纤维素进行什么分解了，因此要筛选分解纤维素的微生物就要到有纤维素腐烂的地方采集样品，才能筛选到分解纤维素的微生物。又如，要分离固氮菌，我们就要根据固氮菌生活的特性，到富有肥沃的pH偏碱的土壤中采样，这样就能分离出我们所需要的固氮菌。在自然界中微生物几乎都是混杂在一起的，必须从土壤中或其它基质中将所需要的微生物分离出来供生产和研究的需要，由于微生物对营养、酸碱度、氧气的要求不同，当供给它们适当的生活环境条件，以有利于有些微生物的生长，又抑制或淘汰了其它杂菌。再用各种分离方法，使它们在固体培养基上形成单个菌落，便可得到纯种，最常用的是稀释分离法，这种方法是将含有微生物的物质，用水稀释使一定量的液体中含有的微生物在固体培养基表面上发育成个别菌落的可能，然后再挑选单独的菌落。用无菌操作方法移殖在适应的培养基上，而获得纯种。分离的成功与否，决定于四个条件：（1）稀释度的选择：（2）营养条件：（3）环境条件：（4）操作过程是否严格遵守无菌手续。需要指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。（二）接种方法微生物的接种方法，常用的有斜面接种、平面接种、液体接种、穿刺接种等。常用的接种工具有接种环、接种针、接种产铲、接种钩和三角玻璃棒等。不同接种方法，使用不同的接种工具。接种是在接种室或净化工作台上进行，接种室或净化工作台事先用紫外线或化学药剂灭菌。（三）微生物的培养微生物的培养是微生物学一项重要的技术，培养方法有好气培养和厌气培养两种方法。真菌放线菌和大多数细菌都是需要好气培养，厌气性细菌则相反，要求隔绝空气的条件下进行厌气培

教学目标 1．初步掌握微生物的分离、培养的基本方法。 2．练习微生物接种移殖和培养的基本技术。教学重点分离纯化的基本操作技术。教学方法课堂讲授课时安排 4课时教学过程一、实验原理（一）微生物的分离微生物的分离是微生物学中的一个最重要的基本技术，因此要求熟练地掌握。工农业及科学实验上所用的微生物菌种，最初都是从自然界筛选出来的。自然界的微生物种类非常多，分布极广，要从自然界找到我们需要的特殊菌种，就必须把它们从许许多多不同的杂种中分离出来。然后根据生长上的要求和菌种的特性，用各种不同的筛选方法，挑选出性能良好符合生产科研要求的纯种。什么叫微生物的纯培养呢？就是在一种培养物中只生长一种微生物，而绝对没有其它微生物混杂其内，所产生的后代。到什么地方可以采到含有我们所需要的菌种的样品呢？这要根据所需菌种的特性和其它有关因素而确定。一般地说，土壤中是菌种取样的主要源泉。但其它地方也有，如污水、动物粪便以及动植物的病原组织等也有大量的微生物存在。例如我们要筛选分解纤维素的微生物，首先就要考虑分解纤维素的微生物和纤维素的关系，纤维素是分解纤维素微生物的物质基础，离开纤维素就无所谓对纤维素进行什么分解了，因此要筛选分解纤维素的微生物就要到有纤维素腐烂的地方采集样品，才能筛选到分解纤维素的微生物。又如，要分离固氮菌，我们就要根据固氮菌生活的特性，到富有肥沃的pH偏碱的土壤中采样，这样就能分离出我们所需要的固氮菌。在自然界中微生物几乎都是混杂在一起的，必须从土壤中或其它基质中将所需要的微生物分离出来供生产和研究的需要，由于微生物对营养、酸碱度、氧气的要求不同，当供给它们适当的生活环境条件，以有利于有些微生物的生长，又抑制或淘汰了其它杂菌。再用各种分离方法，使它们在固体培养基上形成单个菌落，便可得到纯种，最常用的是稀释分离法，这种方法是将含有微生物的物质，用水稀释使一定量的液体中含有的微生物在固体培养基表面上发育成个别菌落的可能，然后再挑选单独的菌落。用无菌操作方法移殖在适应的培养基上，而获得纯种。分离的成功与否，决定于四个条件：（1）稀释度的选择；（2）营养条件；（3）环境条件；（4）操作过程是否严格遵守无菌手续。需要指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。（二）接种方法微生物的接种方法，常用的有斜面接种、平面接种、液体接种、穿刺接种等。常用的接种工具有接种环、接种针、接种产铲、接种钩和三角玻璃棒等。不同接种方法，使用不同的接种工具。接种是在接种室或净化工作台上进行，接种室或净化工作台事先用紫外线或化学药剂灭菌。（三）微生物的培养微生物的培养是微生物学一项重要的技术，培养方法有好气培养和厌气培养两种方法。真菌、放线菌和大多数细菌都是需要好气培养，厌气性细菌则相反，要求隔绝空气的条件下进行厌气培

养。二、实验器材每组：土样10g，米曲霉、装90ml无菌水的三角瓶，装9ml无菌水的试管5支，培养血9套，无菌吸管等。三、实验步骤（1）制备土壤稀释液称10克土样→90m无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中→摇动20分钟，静止半分钟，无菌吸管吸1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的大试管中水中→混合后从第1号试管（102）吸1ml→第二号试管中用此法稀释至第五号试管→得到10~10°土壤稀释液。（2）用划线法分离土壤中细菌（3）用无菌培养血一副→贴上标签→倒入细菌培养基成平板→凝固后用接种针（环）取10和10菌液一环→在平板上划线→倒置在28℃，培养2~3天观察移殖。（3）用混菌法分离土壤中放线菌用无菌培养血一副→贴上标签→血内一边加10%酚数滴，另一边加入0.1ml10-2~10-3土壤悬液→倒入已冷却至55~60℃左右的放线菌培养基摇匀→放入冷却→倒置在28℃培养，3~5天观察移殖。（4）用涂布法分离真菌用无菌培养皿一副→贴上标签→滴入2滴链霉素→倒入马丁氏培养基1管摇匀冷却→吸0.1ml10或10土壤悬液放在平板上→用无菌三角玻璃棒涂匀→倒置28℃培养3~5天，观察移殖。[作业]1.什么叫微生物的纯培养？2．分离微生物的方法有哪几种？准备：每组准备一根涂棒两个接种环，两个酒精灯、将上次包好灭菌的培养血放好，培养基融化等。操作步骤：每人倒3个平板（3种培养基各一个），高氏1号要加5-8滴10%苯酚，马丁氏要加滴1%链霉素。土壤稀释液制备：称取5克土样放入带玻璃珠的45ml三角瓶中，这是10，再从10取1ml放入另1支装有9ml的试管中变成10以此类推至10-5。用涂布法分离真菌和放线菌，取10或10~5的菌液0.2ml于平板中央用无菌玻璃涂棒涂匀，标注带分菌名及学号，倒置28度培养。划线法分离细菌：用无菌接种环沾取10的菌液一环在平板划线。结尾：取出棉塞将试管、三角瓶洗干净，牛皮纸、线绳、玻璃珠回收实验三细菌的革兰氏染色教学目标（1）学习并掌握革兰氏染色法的步骤和关键点（2）了解革兰氏染色原理（3）巩固显微镜操作技术及无菌操作技术教学重点1、革兰氏染色法的操作步骤

养。二、实验器材每组：土样10g，米曲霉、装90ml无菌水的三角瓶，装9ml无菌水的试管5支，培养皿9套，无菌吸管等。三、实验步骤（1）制备土壤稀释液称10克土样 → 90m无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中 → 摇动20分钟，静止半分钟，无菌吸管吸1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的大试管中水中 → 混合后从第1号试管（10-2）吸1ml →第二号试管中用此法稀释至第五号试管 → 得到10-1~10-6土壤稀释液。（2）用划线法分离土壤中细菌（3）用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 倒入细菌培养基成平板 → 凝固后用接种针（环）取 10-4和10-5菌液一环 → 在平板上划线 → 倒置在28℃，培养2~3天观察移殖。（3）用混菌法分离土壤中放线菌用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 皿内一边加10%酚数滴，另一边加入0.1ml10-2~10-3土壤悬液 →倒入已冷却至55~60℃左右的放线菌培养基摇匀 → 放入冷却 → 倒置在28℃培养，3~5天观察移殖。（4）用涂布法分离真菌用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 滴入2滴链霉素 → 倒入马丁氏培养基1管摇匀冷却 → 吸 0.1 ml 10-4或 10-5土壤悬液放在平板上 → 用无菌三角玻璃棒涂匀 → 倒置28℃培养3~5天，观察移殖。 [作业] 1．什么叫微生物的纯培养？ 2．分离微生物的方法有哪几种？准备：每组准备一根涂棒两个接种环，两个酒精灯、将上次包好灭菌的培养皿放好，培养基融化等。操作步骤：每人倒3个平板（3种培养基各一个），高氏1号要加5-8滴10%苯酚，马丁氏要加滴1% 链霉素。土壤稀释液制备：称取5克土样放入带玻璃珠的45ml三角瓶中，这是10-1，再从10-1取1ml放入另1支装有9ml的试管中变成10-2以此类推至10-5。用涂布法分离真菌和放线菌，取10-4或10-5的菌液0.2ml于平板中央用无菌玻璃涂棒涂匀，标注带分菌名及学号，倒置28度培养。划线法分离细菌：用无菌接种环沾取10-1的菌液一环在平板划线。结尾：取出棉塞将试管、三角瓶洗干净，牛皮纸、线绳、玻璃珠回收。实验三细菌的革兰氏染色教学目标（1）学习并掌握革兰氏染色法的步骤和关键点（2）了解革兰氏染色原理（3）巩固显微镜操作技术及无菌操作技术教学重点 1、革兰氏染色法的操作步骤