保定学院：生化系实验中心《分子生物学实验》课程教学大纲.pdf_大学文库

出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物同工酶1、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基体系时它们聚合。引发产生自由基的方法有两种一一化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂是N,N,N"N-四甲基乙二胺（TEMED），在催化剂TEMED的作用下，有过硫酸铵形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时应予以控制。光聚合以光敏感物质核黄素作为（VB2）催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从容引起聚合作用。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚内烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总质量称为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离核酸。2、不连续聚内烯酰胺凝胶电泳的原理系统的不连续性表现在以下几个方面：1）凝胶板由上下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCI缓冲液，而分离胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCI缓冲液。3）在电场中形成不连续的电位梯度不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有三种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好的分离开来。浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：1）虽然样品胶和浓缩胶都是用的TrIS－HCI缓冲液，但pH不同：电泳时，由于HCI是强电解质，不管在哪层胶中，几乎都完全电离，CI布满整个胶板。：而在电泳槽中的Tris-甘氨酸缓冲液是pH8.3，因为甘氨酸的等电点为6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子（1%～0.1%）解离成H2N—CH2一COO。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比HCI小，比甘氨酸大。这三种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即：CI>蛋白质>甘氨酸。根据有效泳动率的大小，最大的称为快离子（或先行离子），最小的称为慢离子（或随后离子）。电泳一开始，有效泳动率最

出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物同工酶。 1、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N,N´-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基体系时它们聚合。引发产生自由基的方法有两种 ——化学法和光化学法。化学聚合的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂是N,N,N´,N-四甲基乙二胺（TEMED），在催化剂TEMED的作用下，有过硫酸铵形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟，冷却也可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时应予以控制。光聚合以光敏感物质核黄素作为（VB2）催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从容引起聚合作用。光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100mL凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总质量称为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数称为交联度，用C%表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离核酸。 2、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理系统的不连续性表现在以下几个方面：1）凝胶板由上下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统，电极缓冲液为 pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶缓冲液为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3）在电场中形成不连续的电位梯度不连续电泳之所以有很高的分辨率是因为有三种效应：即浓缩效应、电荷效荷和分子筛效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好的分离开来。浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下：1）虽然样品胶和浓缩胶都是用的Tris – HCl缓冲液，但pH不同；电泳时，由于HCl是强电解质，不管在哪层胶中，几乎都完全电离，Cl–布满整个胶板。；而在电泳槽中的Tris –甘氨酸缓冲液是pH8.3，因为甘氨酸的等电点为 6.0，在电泳过程中，它只有极少数分子（1 ％～0.1 ％）解离成H2N—CH2—COO–。一般酸性蛋白质在此pH值下也解离为带负电荷的离子，但其解离度比 HCl 小，比甘氨酸大。这三种离子带有同性电荷，在一定的电场作用下，它们的泳动率是不一样的。而且它们的有效泳动率是按下列次序排列的，即：Cl–＞蛋白质＞甘氨酸。根据有效泳动率的大小，最大的称为快离子（或先行离子），最小的称为慢离子（或随后离子）。电泳一开始，有效泳动率最

2424取用量/mL先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子，照光使胶聚合，待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽缓冲液要求没过样品槽，下槽缓冲液要求没过电极，准备点样和进行电泳。（三）样品的制备称取小麦幼苗茎部0.5g，放入研钵中，加提取液1mL，于冰域中研成匀浆，然后以2mL提取液分2次洗入离心管，于4℃、10000转/分离心10分钟，倒出上清液，与等量得40%蔗糖混合，留作点样用。（四）点样用微量加样器吸取少量样液，每个点样槽加15-50uL。点样时需小心，防止样品液的扩散。（五）电泳在上下电泳槽中加入电极缓冲液，并在上槽电极缓冲液中加一滴漠酚蓝，混匀。连接好电源线（上槽为负极）。打开电源开关，调节电流到每个点样孔1mA左右，样品进入分离胶后加大到每孔2mA，维持恒流。待指示燃料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳，将调节旋钮调至零，关闭电源，电泳约90分钟。（六）剥胶倒掉电极缓冲液，取下夹子，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻璃棒协助将分离胶放到大培养血中。（七）染色、记录结果在大培养血中加入适量Vc-联苯胺染色液，没整个胶板，于室温下显色20分钟，即得到过氧化物酶同工酶得红褐色酶谱。于日光灯下观察记录酶谱，并绘图。实验三植物DNA的提取（CTAB法）一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。二、实验原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和RNA两大类，真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。在浓氯化钠溶液（1～2mol/L）中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小：而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去

取用量/mL 2 4 2 4 先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子，照光使胶聚合，待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，上槽缓冲液要求没过样品槽，下槽缓冲液要求没过电极，准备点样和进行电泳。（三）样品的制备称取小麦幼苗茎部0.5g，放入研钵中，加提取液1mL，于冰域中研成匀浆，然后以2mL提取液分2次洗入离心管，于4℃、10000转/分离心10分钟，倒出上清液，与等量得40%蔗糖混合，留作点样用。（四）点样用微量加样器吸取少量样液，每个点样槽加15-50μL。点样时需小心，防止样品液的扩散。（五）电泳在上下电泳槽中加入电极缓冲液，并在上槽电极缓冲液中加一滴溴酚蓝，混匀。连接好电源线（上槽为负极）。打开电源开关，调节电流到每个点样孔1mA左右，样品进入分离胶后加大到每孔2mA，维持恒流。待指示燃料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳，将调节旋钮调至零，关闭电源，电泳约90分钟。（六）剥胶倒掉电极缓冲液，取下夹子，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻璃棒协助将分离胶放到大培养皿中。（七）染色、记录结果在大培养皿中加入适量Vc-联苯胺染色液，淹没整个胶板，于室温下显色20分钟，即得到过氧化物酶同工酶得红褐色酶谱。于日光灯下观察记录酶谱，并绘图。实验三植物DNA的提取（CTAB法）一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。二、实验原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为DNA和 RNA两大类，真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液 (0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将 DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去

除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿去除蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0一11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利手收集，③酶的作用，核酸醒在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，会降解DNA。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温（O℃左右）下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、（ETDA-Na）等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。CTAB（十六烧基三甲基漠化铵）是一种阳离子表面活性剂（去污剂）能与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。本实验利益CTAB的高盐溶液提取植物基因组DNA，先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，再经无水乙醇或异丙醇沉淀上清液，最后得到DNA。三、试剂和器材：试剂：1、CTAB分离缓冲液：（2%CTAB，1.4mol/LNaCL，20mmol/LEDTA，100mmol/LTris-HCL(pH8.0)0.1%PVP（吡咯烷酮）共100mL，灭菌后变成澄清的溶液）2、β-巯基乙醇3、氯仿-异戊醇（24：1）4、无水5、70%乙醇乙醇或异内醇器材：研钵，恒温水浴锅（37-100），离心机等四、实验步骤1、将1mLCTAB分离缓冲液加入2mL离心管中，置手65℃C水浴中预热。2、称取1.0g叶片，置于预冷的研钵中，尽快将叶片研碎。3、将研磨样品直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。4、样品于65℃保温20-30分钟。5、加等体积（1mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。6、室温下10000rpm离心10分钟。7、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2倍体积冷的无水乙醇或2/3体积的异内醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）

除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿去除蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA 溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，③酶的作用，核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，会降解DNA。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂（去污剂）能与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但不能沉淀核酸。本实验利益CTAB的高盐溶液提取植物基因组DNA，先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，再经无水乙醇或异丙醇沉淀上清液，最后得到DNA。三、试剂和器材：试剂：1、CTAB分离缓冲液：（2%CTAB，1.4mol/LNaCL, 20mmol/LEDTA, 100mmol/LTris-HCL(pH8.0), 0.1%PVP（吡咯烷酮）共100mL ，灭菌后变成澄清的溶液） 2、β-巯基乙醇 3、氯仿-异戊醇（24：1）4、无水乙醇或异丙醇 5、70%乙醇器材：研钵，恒温水浴锅（37-100），离心机等四、实验步骤 1、将1mLCTAB分离缓冲液加入2mL离心管中，置于65℃水浴中预热。 2、称取1.0g叶片，置于预冷的研钵中，尽快将叶片研碎。 3、将研磨样品直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。 4、样品于65℃保温20-30分钟。 5、加等体积（1mL）的氯仿-异戊醇，轻轻颠倒混匀。 6、室温下10000rpm离心10分钟。 7、用一开口较大的滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2倍体积冷的无水乙醇或2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链DNA，或者是云雾状的 DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）