第二十八章食品功能性成分的测定 本章要点 1.低聚糖的测定方法 2.大豆异黄酮的测定方法 3.总皂苷的测定方法 4.褪黑素的测定方法 5.肉碱的测定方法 6.免疫球蛋白IG的测定方法 7.EPA和DHA的测定方法 8.超氧化物歧化酶的测定方法 9.总谷胱甘肽(GSH)含量的测定方法 10.大蒜辣素含量的测定方法 11.核苷酸含量的测定方法 12.糖精含量的测定方法 13.牛磺酸含量的测定方法 14.甘草苷含量的测定方法 15.膳食纤维含量的测定方法 16.枸杞子多糖含量的测定方法 17.香菇多糖的测定方法 18.磷脂含量的测定方法 19.花生四烯酸含量的测定方法 20.B-胡萝卜素含量的测定方法 21.维生素E和胡萝卡素含量的测定方法 22.微量硒含量的测定方法 23.有机锗含量的测定方法 24.茶多酚含量的测定方法 25.儿茶素含量的测定方法
1 第二十八章 食品功能性成分的测定 本章要点 1. 低聚糖的测定方法 2. 大豆异黄酮的测定方法 3. 总皂苷的测定方法 4. 褪黑素的测定方法 5. 肉碱的测定方法 6. 免疫球蛋白 IgG 的测定方法 7. EPA 和 DHA 的测定方法 8. 超氧化物歧化酶的测定方法 9. 总谷胱甘肽（GSH）含量的测定方法 10.大蒜辣素含量的测定方法 11.核苷酸含量的测定方法 12.糖精含量的测定方法 13.牛磺酸含量的测定方法 14.甘草苷含量的测定方法 15.膳食纤维含量的测定方法 16.枸杞子多糖含量的测定方法 17.香菇多糖的测定方法 18.磷脂含量的测定方法 19.花生四烯酸含量的测定方法 20.β-胡萝卜素含量的测定方法 21.维生素 E 和胡萝卡素含量的测定方法 22.微量硒含量的测定方法 23.有机锗含量的测定方法 24.茶多酚含量的测定方法 25.儿茶素含量的测定方法
第一节低聚糖——低聚果糖和异麦芽低聚糖 的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用功能性食品中低聚糖的检测。 、方法提要 低聚糖各组分用高效液相色谱法分离并定量测定,以乙腈、水作流动相在碳水化合物分析柱上糖的分 离顺序是先单糖后双糖,先低聚后多聚,以示差折射检测器检测。 低聚糖的检测有外标法和内标法,但由于功能性食品一般只需报告低聚糖的总量,故可用厂家提供的 基料作对照样,在相同的分离条件下以面积比值法求出样品中低聚糖含量, 、仪器 1.高效液相色谱仪: Waters HPLc,510泵,410示差折射检测器,数据处理装置。 2.超声波振荡器。 3.微孔过滤器(滤膜045m)。 三、试剂 乙腈(色谱纯) 2水(三蒸水并经Mli-Q超纯处理) 3.低聚糖对照品:低聚糖难得纯品,故可用厂家提供的基料。 为对照品。 低聚果糖( Fructooligosaccharide):国产:一般含蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF;) 液状基料:含量约>35% 固状基料:含量约>50% 进口:从蔗果三糖(GF2)至蔗果七糖(GF6)有液状、固状,30%~%6%多种规格。异麦芽低聚糖 有液状、固状,一般含量>50% 4对照样品溶液 根据保健食品所强化的品种,准确称取低聚果糖或异麦芽低聚糖基料分别于100mL的容量瓶中,加水 溶解并稀释至刻度,配成低聚果糖约5~ 10mg/mL或异麦芽低聚糖约5~10mg/mL的对照样品溶液 四、测定步骤 1.样品处理 (1)胶囊、片剂、颗粒、冲剂、粉剂(不含蛋白质)的样品 用精度0000g的分析天平准确称取已均匀的样品(由于低聚糖原料含量不一,样品中的强化量也不同
2 第一节 低聚糖——低聚果糖和异麦芽低聚糖 的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用功能性食品中低聚糖的检测。 一、方法提要 低聚糖各组分用高效液相色谱法分离并定量测定，以乙腈、水作流动相在碳水化合物分析柱上糖的分 离顺序是先单糖后双糖，先低聚后多聚，以示差折射检测器检测。 低聚糖的检测有外标法和内标法，但由于功能性食品一般只需报告低聚糖的总量，故可用厂家提供的 基料作对照样，在相同的分离条件下以面积比值法求出样品中低聚糖含量。 二、仪器 1.高效液相色谱仪：Waters HPLC，510 泵，410 示差折射检测器，数据处理装置。 2.超声波振荡器。 3.微孔过滤器(滤膜 0.45μm)。 三、试剂 1.乙腈(色谱纯)。 2.水（三蒸水并经 Milli-Q 超纯处理）。 3.低聚糖对照品：低聚糖难得纯品，故可用厂家提供的基料。 为对照品。 低聚果糖（Fructooligosaccharide）：国产：一般含蔗果三糖（GF2）、蔗果四糖（GF3）、蔗果五糖（GF4）。 液状基料：含量约＞35%。 固状基料：含量约＞50%。 进口：从蔗果三糖（GF2）至蔗果七糖（GF6）有液状、固状，30%～96%多种规格。异麦芽低聚糖： 有液状、固状，一般含量＞50%。 4.对照样品溶液 根据保健食品所强化的品种，准确称取低聚果糖或异麦芽低聚糖基料分别于 100mL 的容量瓶中，加水 溶解并稀释至刻度，配成低聚果糖约 5～10mg/mL 或异麦芽低聚糖约 5～10mg/mL 的对照样品溶液。 四、测定步骤 1.样品处理 （1） 胶囊、片剂、颗粒、冲剂、粉剂（不含蛋白质）的样品 用精度 0.000lg 的分析天平准确称取已均匀的样品(由于低聚糖原料含量不一，样品中的强化量也不同
所以样品的称量应控制在使低聚糖最终的进样浓度约5~10mg/mL为宜),于100mL容量瓶中,加水约80mL 于超声波振荡器中振荡提取30min,加水至刻度,摇匀,用0.45μm滤膜过滤后直接这样测定。 (2)奶制品(含蛋白质)的样品 准确吸取50mL于小烧杯中,加25mL无水乙醇,加热使蛋白质沉淀,过滤,滤液经浓缩并用水定容 至25mL刻度 (3)饮料或口服液样品 准确吸取一定量的样品,加水稀释,定容至一定体积使低聚糖的最终进样浓度约5~10mg/mL。 (4)果冻或布丁类样品 果冻类样品先均匀搅碎,称量,加适量水并加热至60℃左右助溶.并于超声波振荡器中振荡提取,然 后用水稀释至一定体积 布丁类样品可按奶制品处理。 2色谱分离条件 色谱柱: Waters碳水化合物分析柱39mm×300mm。 柱温:35℃ 流动相:乙腈+水(75+25)。 流速:1~2mL/min 检测器灵敏度:16X 进样量:10~254L 3样品测定 取样品处理液和对照品溶液各10~25μL注入高效液相色谱仪进行分离。以对照品峰的保留时间定 性,以其峰面积计算出样液中被测物质的含量。 低聚糖的分离顺序为: 低聚果糖:果糖+葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖(GF2)……·蔗果七糖(GF6) 异麦芽低聚糖:葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖( pentose)、异麦芽 糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖以上, 五、结果计算 1.低聚糖占总糖的百分含量 因为各组分均为同系物,所以可用面积归一法计算低聚糖各组分总面积值及各组分占固形物(总糖) 的百分含量 低聚果糖占总糖%=S+S4+…S2 100 S1+S2+S3+S4+…S 式中S—一果糖+葡萄糖的峰面积; S2—一蔗糖的峰面积 S3+…S—一蔗果三糖(GF2)……蔗果七糖(GF6)的峰面积。 S2+S,+ 异麦芽低聚糖占总糖%= 10 S1+S2+S3+S4+
3 所以样品的称量应控制在使低聚糖最终的进样浓度约5～10mg/mL为宜)，于100mL容量瓶中，加水约80mL 于超声波振荡器中振荡提取 30min，加水至刻度，摇匀，用 0.45μm 滤膜过滤后直接这样测定。 （2） 奶制品（含蛋白质）的样品 准确吸取 50mL 于小烧杯中，加 25mL 无水乙醇，加热使蛋白质沉淀，过滤，滤液经浓缩并用水定容 至 25mL 刻度。 （3） 饮料或口服液样品 准确吸取一定量的样品，加水稀释，定容至一定体积使低聚糖的最终进样浓度约 5～10mg/mL。 （4） 果冻或布丁类样品 果冻类样品先均匀搅碎，称量，加适量水并加热至 60℃左右助溶．并于超声波振荡器中振荡提取，然 后用水稀释至一定体积。 布丁类样品可按奶制品处理。 2.色谱分离条件 色 谱 柱：Waters 碳水化合物分析柱 3.9mm×300mm。 柱 温：35℃。 流 动 相：乙腈+水（75+25）。 流 速：1～2mL/min。 检测器灵敏度：16X。 进 样 量：10～25μL。 3.样品测定 取样品处理液和对照品溶液各 10～25μL 注入高效液相色谱仪进行分离。以对照品峰的保留时间定 性，以其峰面积计算出样液中被测物质的含量。 低聚糖的分离顺序为： 低聚果糖：果糖+葡萄糖、蔗糖、蔗果三糖（GF2）……蔗果七糖（GF6） 异麦芽低聚糖：葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖、潘糖（pentose）、异麦芽 三糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖以上。 五、结果计算 1. 低聚糖占总糖的百分含量 因为各组分均为同系物，所以可用面积归一法计算低聚糖各组分总面积值及各组分占固形物（总糖） 的百分含量。 低聚果糖占总糖%= 100 1 2 3 4 7 3 4 7 + + + + + + S S S S S S S S 式中 Sl——果糖+葡萄糖的峰面积； S2——蔗糖的峰面积； S3+……S7——蔗果三糖（GF2）……蔗果七糖（GF6）的峰面积。 异麦芽低聚糖占总糖%= 100 1 2 3 4 7 3 4 7 + + + + + + S S S S S S S S
式中S—一葡萄糖的峰面积; S2——麦芽糖的峰面积 S3+…S——异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖 以上的峰面积。 注:以上数值均可在积分仪中直接读出 2低聚糖在样品中的百分含量 低聚糖% S×m1×V×c、100 S1×m×V1 式中S—一样品中各低聚糖组分的峰面积总和 S1—一对照样品溶液中各低聚糖组分的峰面积总和: m——对照样品质量(g c——对照样品中各低聚糖组分占固形物(总糖)实测的百分含 量: ①此项由结果计算5(1)求出。 ②如对照样品为液体基料还应乘以固形物的含量: —一样品定容体积(mL) V1-一对照样品定容体积(mL) m一样品质量(g) 举例: (1)样品(约含低聚果糖65%)称样量0.7760g溶于水中并定容至l00mL (2)对照样品:比利时进口低聚果糖GH2至GF6(企业标示量占总糖为>92),准确称取0.5770g溶 于水中并定容至M0mL 3)样品及对照样品进样量分别为254L (4)用HPLC面积归一法验证对照样品低聚糖各组分面积值总和:418326;及各组分占固形物(总 糖)的百分含量:93.99% (5)用HPLC面积归一法计算样品低聚糖各组分面积值总和:417532。 (6)样品中低聚果糖的百分含量: 417532×0.9399×0.5770×100 低聚果糖% 100=69.75 418326×0.776×100 六、注释 1低聚糖( oligosaccharide)或称寡糖,是由3~10个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合 糖,现已广泛应用在饮料、奶类、果冻、谷类制品、婴幼儿食品等保健食品中 2.低聚果糖或异麦芽低聚糖是由酶将蔗糖(或淀粉)水解为果糖与葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖以国产低 聚果糖为例其结构式GF一Fn,(n=1~3),G一F为蔗糖(由G代表葡萄糖,F代表果糖构成),GF2即 一分子葡萄糖和二分子果糖称蔗果三糖,GF4称蔗果五糖
4 式中 Sl——葡萄糖的峰面积； S2——麦芽糖的峰面积； S3+……S7——异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖、异麦芽四糖、异麦芽四糖 以上的峰面积。 注：以上数值均可在积分仪中直接读出。 2.低聚糖在样品中的百分含量 低聚糖%= 100 1 1 1 S m V S m V c 式中 S——样品中各低聚糖组分的峰面积总和； S1——对照样品溶液中各低聚糖组分的峰面积总和； m1——对照样品质量（g）； c——对照样品中各低聚糖组分占固形物（总糖）实测的百分含 量； ① 此项由结果计算 5（1）求出。 ② 如对照样品为液体基料还应乘以固形物的含量： V——样品定容体积（mL）； V1——对照样品定容体积（mL）； m——样品质量（g）。 举例： （1）样品（约含低聚果糖 65%）称样量 0.7760g 溶于水中并定容至 l00mL。 （2）对照样品：比利时进口低聚果糖 GF2 至 GF6（企业标示量占总糖为＞92），准确称取 0.5770g 溶 于水中并定容至 l00mL。 （3）样品及对照样品进样量分别为 25μL。 （4）用 HPLC 面积归一法验证对照样品低聚糖各组分面积值总和：418326；及各组分占固形物（总 糖）的百分含量：93.99%。 （5）用 HPLC 面积归一法计算样品低聚糖各组分面积值总和：417532。。 （6）样品中低聚果糖的百分含量： 低聚果糖%= 100 69.75 418326 0.776 100 417532 0.9399 0.5770 100 = 六、注释 1.低聚糖（Oligosaccharide）或称寡糖，是由 3～10 个单糖通过糖苷键连接形成直链或支链的低度聚合 糖，现已广泛应用在饮料、奶类、果冻、谷类制品、婴幼儿食品等保健食品中。 2.低聚果糖或异麦芽低聚糖是由酶将蔗糖（或淀粉）水解为果糖与葡萄糖或麦芽糖与葡萄糖以国产低 聚果糖为例其结构式 G—F—Fn，（n=1～3），G—F 为蔗糖（由 G 代表葡萄糖，F 代表果糖构成），GF2 即 一分子葡萄糖和二分子果糖称蔗果三糖，GF4 称蔗果五糖
3低聚糖难得纯品,因酶反应产物中除各种蔗果糖外,还残留下不少葡萄糖,果糖和蔗糖(或麦芽糖) 另经有关文献检索,低聚糖亦未见有准确的定量方法,其原因是低聚糖的分离其响应因子依赖于分子内部 链的长短,故准确定量较难,本方法是根据自己的实践,采用强化在保健食品中的基料作对照样,而建立 的新方法 4两种低聚糖(低聚果糖、异麦芽低聚糖)共存于同一食品中,低聚糖各组分用以上的分离条件难以 分开,表现为许多组分重叠,干扰了正常定量,但将两组色谱图叠加进行比较,异麦芽三糖为一独立峰, 因而可以用其对异麦芽低聚糖进行定量分析 把两组对照样色谱图中低聚糖各组分的峰面积相加,得出总的峰面积,再求出其中低聚果糖所占的百 分比,求出一个校正因子(注意:一定要换算成相同的浓度单位)。从样品色谱图中把低聚糖各组分总的 峰面积乘以其百分比就可求出低聚果糖的含量(但要注意样品中含其他糖如蔗糖的干扰)。 5食品的化学构成比较复杂,某些功能性食品在生产工艺过程中会带来杂质和赋形剂及其中一些组分 (如淀粉、麦片、豆粉)的变性而干扰本法的测定,故在样品处理中应尽量去除并参考6.(4)的定量方 法 6本法也适用于其他低聚糖的测定。 第二节大豆异黄酮的测定方法 大豆总异黄酮的测定方法(紫外分光光度法) 本方法适用于大豆以及大豆制品中大豆总异黄酮的测定(所测样品需要进行前处理)。 1.方法提要 将金雀异黄素标准品及含有大豆制品的样品溶液在分光光度上扫描200~400m吸收情况,结果发现, 标准品及样品的最大吸收峰都在259nm,且最大吸收峰周围干扰较少。因此,选用金雀异黄素作为标准品 利用紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量。 2.仪器 紫外分光光度计。 3.试剂 (1)金雀异黄素(Cl10O5)标准品(美国Sgma公司,含量为99999 (2)95%乙醇(C2H6O)(分析纯),天津化学试剂厂生 (3)双蒸馏水(H2O),自制。 (4)石油醚(沸程为60~90℃)(分析纯),上海化学试剂厂。 (5)环己烷(C6H12)(分析纯),上海试剂一厂 (6)标准品溶液:准确称取金雀异黄素( genistein)标准品5.mg,置人50m容量瓶中,以95%乙 醇溶解,并定容至刻度,摇匀 4.测定步骤 (1)样品处理:精密称取大豆总异黄酮纯化物10.4mg,置λ5mL容量瓶中,以95%乙醇溶解,并
5 3.低聚糖难得纯品，因酶反应产物中除各种蔗果糖外，还残留下不少葡萄糖，果糖和蔗糖（或麦芽糖）； 另经有关文献检索，低聚糖亦未见有准确的定量方法，其原因是低聚糖的分离其响应因子依赖于分子内部 链的长短，故准确定量较难，本方法是根据自己的实践，采用强化在保健食品中的基料作对照样，而建立 的新方法。 4.两种低聚糖（低聚果糖、异麦芽低聚糖）共存于同一食品中，低聚糖各组分用以上的分离条件难以 分开，表现为许多组分重叠，干扰了正常定量，但将两组色谱图叠加进行比较，异麦芽三糖为一独立峰， 因而可以用其对异麦芽低聚糖进行定量分析。 把两组对照样色谱图中低聚糖各组分的峰面积相加，得出总的峰面积，再求出其中低聚果糖所占的百 分比，求出一个校正因子（注意：一定要换算成相同的浓度单位）。从样品色谱图中把低聚糖各组分总的 峰面积乘以其百分比就可求出低聚果糖的含量（但要注意样品中含其他糖如蔗糖的干扰）。 5.食品的化学构成比较复杂，某些功能性食品在生产工艺过程中会带来杂质和赋形剂及其中一些组分 （如淀粉、麦片、豆粉）的变性而干扰本法的测定，故在样品处理中应尽量去除并参考 6．（4）的定量方 法； 6.本法也适用于其他低聚糖的测定。 第二节 大豆异黄酮的测定方法 一、大豆总异黄酮的测定方法（紫外分光光度法） 本方法适用于大豆以及大豆制品中大豆总异黄酮的测定（所测样品需要进行前处理）。 1. 方法提要 将金雀异黄素标准品及含有大豆制品的样品溶液在分光光度上扫描 200～400nm 吸收情况，结果发现， 标准品及样品的最大吸收峰都在 259nm，且最大吸收峰周围干扰较少。因此，选用金雀异黄素作为标准品， 利用紫外分光光度法测定大豆总异黄酮的含量。 2. 仪器 紫外分光光度计。 3. 试剂 （1）金雀异黄素（C12H10O5）标准品（美国 Sigma 公司，含量为 99.999%）。 （2）95%乙醇（C2H6O）（分析纯），天津化学试剂厂生产。 （3）双蒸馏水（H2O），自制。 （4）石油醚（沸程为 60～90℃）（分析纯），上海化学试剂厂。 （5）环己烷（C6Hl2）（分析纯），上海试剂一厂。 （6）标准品溶液：准确称取金雀异黄素（geninstein）标准品 5.2mg，置人 50ml 容量瓶中，以 95%乙 醇溶解，并定容至刻度，摇匀。 4. 测定步骤 （1）样品处理：精密称取大豆总异黄酮纯化物 10.4mg，置入 50mL 容量瓶中，以 95%乙醇溶解，并
定容至刻度,摇匀。(注:样品为经大孔吸附树脂吸附纯化并配合溶剂法提取制得的大豆总异黄酮提取纯 化物,浅黄棕色粉末,味苦) (2)标准曲线的绘制:准确吸取0.05、01、0.15、0.2、0.3、04mL标准品溶液分别置于10mL容量 瓶中,并各加95%乙醇1.0mL,再加蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以lmL95%乙醇加水到10mL作空白对照, 在259mm处测得吸光度,以测得之吸光度与纯品量绘制标准曲线并得出回归方程见表28-1。 计算公式 回归方程y=ax+b相关系数r=0.996 式中b—一截距,0.2006; d一斜率,78118 表28-1标准曲线与回归方程 编号 2 4 5 6 0.52 1.04 1.56 2.08 3.12 4.16 0.0432 0.1080 0.1763 0.2735 0.3654 0.5131 (3)样品测定:分别准确吸取样品液0.3mL于3只10mL容量瓶中,以下按标准曲线制备项下操作 在259mm处测定吸收度,计算平均值,按标准曲线方程计算含量,并计算样品的大豆总异黄酮质量分数。 结果见表28 表28-2样品中的大豆总异黄酮含量 吸光度/OD 0.2837 0.2837 0.2795 平均吸光度/OD 0.2835 含量/(g/mL 8.0452 5.精密度实验 准确吸取标准品溶液0.2mL,分别置5只10mL容量瓶中,按标准曲线项下操作,测定吸收度,计算 相对标准差(RSD)为2.6%。 6.加样回收率实验 准确吸取1、0.2、0.2、0.2、0.lmL标准品溶液于5只lmL容量瓶中,再分别准确加入样品液0.3mL, 照标准曲线制备项下操作,计算加样回收率,结果见表28-3 表28-3加样回收率实验 平均RSD/ 加标准品质量/g 1.04 2.08 1.04 2.08 2.08 0.3mL样品中相当 2.41492.4149241492414924149 金雀黄素的量/g OD 值 0.36650.49650.49320.49880.3625
6 定容至刻度，摇匀。（注：样品为经大孔吸附树脂吸附纯化并配合溶剂法提取制得的大豆总异黄酮提取纯 化物，浅黄棕色粉末，味苦）。 （2）标准曲线的绘制：准确吸取 0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mL 标准品溶液分别置于 10mL 容量 瓶中，并各加 95%乙醇 1.0mL，再加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以 lmL95%乙醇加水到 l0mL 作空白对照， 在 259nm 处测得吸光度，以测得之吸光度与纯品量绘制标准曲线并得出回归方程见表 28—1。 计算公式： 回归方程 y = ax + b 相关系数 r = 0.9996 式中 b——截距，0.2006； d——斜率，7.8118。 表 28—1 标准曲线与回归方程 编号 1 2 3 4 5 6 x/μg 0.52 1.04 1.56 2.08 3.12 4.16 y 0.0432 0.1080 0.1763 0.2735 0.3654 0.5131 （3）样品测定：分别准确吸取样品液 0.3mL 于 3 只 10mL 容量瓶中，以下按标准曲线制备项下操作， 在 259nm 处测定吸收度，计算平均值，按标准曲线方程计算含量，并计算样品的大豆总异黄酮质量分数。 结果见表 28—2。 表 28—2 样品中的大豆总异黄酮含量 编号 1 2 3 吸光度/OD 0.2837 0.2837 0.2795 平均吸光度/OD 0.2835 含量/（μg/mL） 8.0452 5. 精密度实验 准确吸取标准品溶液 0.2mL，分别置 5 只 10mL 容量瓶中，按标准曲线项下操作，测定吸收度，计算 相对标准差（RSD）为 2.6%。 6. 加样回收率实验 准确吸取 0.1、0.2、0.2、0.2、0.1mL 标准品溶液于 5 只 l0mL 容量瓶中，再分别准确加入样品液 0.3mL， 照标准曲线制备项下操作，计算加样回收率，结果见表 28—3。 表 28—3 加样回收率实验 1 2 3 4 5 平均 RSD/% 加标准品质量/μg 1.04 2.08 1.04 2.08 2.08 0.3mL 样品中相当 金雀黄素的量/μg 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 OD 值 0.3665 0.4965 0.4932 0.4988 0.3625
测得相当金雀 黄素的含量/ 3.46794.4921 4.46634.5046 4489 回收率/% 98.63 1004799.08 平均回收率/% 9986 1.06 7.结果计算 样品中大豆总异黄酮的百分含量(以金雀异黄素计算)按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算 8.注释 若受试物为大豆的制品,如水豆腐、干豆腐、豆芽、豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥,分别 取干重为l0g的受试样品置于锥形瓶中,加入石油醚50mL,放置24h,过滤,残渣用滤纸筒包好,置于水 浴上的索氏提取器中用甲醇提取6h,注意温度低于π0℃。提取液回收甲醇,残渣上大孔吸附树脂柱,用 水洗脱除去糖类成分,续以95%的乙醇洗脱,将乙醇洗脱液浓缩,干燥,以95%乙醇定容为25mL。豆浆、 豆汁等液体大豆饮品可在60℃水浴上蒸干,取干重为1啁g的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理,得到不 同的样品95%乙醇溶液 二、大豆异黄酮的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。 本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为10ng:大豆苷元的最低检出限为30ngo 1.方法提要 大豆异黄酮( soybean isoflavones,简称ISO)是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善 心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种,染 料本素( Genistein,G)和大豆苷元( Daidzein,D)是其中两种重要化合物。本法用80%乙醇作为溶剂, 提取样品中的染料木素、大豆苷元,以反相高效液相色谱分离,在紫外检测器260nm条件下检测其峰面积 以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。 2.仪器 (1)LC高效液相色谱仪,C—RIB色谱处理机 (2)检测器:SPD2AS紫外检测器。 (3)离心机。 (4)超声波振荡器。 3.试剂 (1)甲醇(色谱纯)。 (2)乙醇(优级纯)。 (3)双重蒸馏水 (4)大豆异黄酮标准品:染料木素与大豆苷元标准品(美国 Sigma公司产品),以染料木素的大豆苷 元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。 (5)大豆异黄酮标准溶液:准确称取染料木素标准品5.0mg,大豆苷元标准品3.2mg,各自用流动相
7 测得相当金雀 黄素的含量/μg 3.4679 4.4921 4.4663 4.5046 3.4489 回收率/% 101.25 99.87 98.63 100.47 99.08 平均回收率/% 99.86 1.06 7. 结果计算 样品中大豆总异黄酮的百分含量（以金雀异黄素计算）按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算。 8. 注释 若受试物为大豆的制品，如水豆腐、干豆腐、豆芽、豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥，分别 取干重为 l0g 的受试样品置于锥形瓶中，加入石油醚 50mL，放置 24h，过滤，残渣用滤纸筒包好，置于水 浴上的索氏提取器中用甲醇提取 6h，注意温度低于 70℃。提取液回收甲醇，残渣上大孔吸附树脂柱，用 水洗脱除去糖类成分，续以 95%的乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩，干燥，以 95%乙醇定容为 25mL。豆浆、 豆汁等液体大豆饮品可在 60℃水浴上蒸干，取干重为 10g 的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理，得到不 同的样品 95%乙醇溶液。 二、大豆异黄酮的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。 本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为 10ng；大豆苷元的最低检出限为 30ng。 1. 方法提要 大豆异黄酮（soybean isoflavones，简称 ISO）是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善 心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有 12 种，染 料本素（Genistein，G）和大豆苷元（Daidzeiu，D）是其中两种重要化合物。本法用 80%乙醇作为溶剂， 提取样品中的染料木素、大豆苷元，以反相高效液相色谱分离，在紫外检测器 260nm 条件下检测其峰面积， 以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。 2. 仪器 （1）LC 高效液相色谱仪，C—RIB 色谱处理机。 （2）检测器：SPD—2AS 紫外检测器。 （3）离心机。 （4）超声波振荡器。 3. 试剂 （1）甲醇（色谱纯）。 （2）乙醇（优级纯）。 （3）双重蒸馏水。 （4）大豆异黄酮标准品：染料木素与大豆苷元标准品（美国 Sigma 公司产品），以染料木素的大豆苷 元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。 （5）大豆异黄酮标准溶液：准确称取染料木素标准品 5.0mg，大豆苷元标准品 3.2mg，各自用流动相
“甲醇+水(60+40)”定容至100mL,配制成50HgmL的染料木素和32μg/mL的大豆苷元标准溶液 4.测定步骤 (1)样品处理 a.固体样品:准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中,定量加入80%乙醇,经超声振荡5min, 加水补足至刻度,待提取液略澄清后经离心分离(3000r/min,5min),取上清液经045μm滤膜过滤后待 进样 b.液体样品:准确吸取2·0mL液体样品,加入80%乙醇摇匀并定容100mL,澄清后同上述步骤 (2)色谱分离条件 色谱柱:Shim- Pack clc-ODS,6mmx150mm,5m。 流动相:甲醇+水(60+40),临用前用超声波除气 流速:0~5min,为10mL/min:5~10min为16 mL/min。 柱温:40℃。 检测波长:UV260nm 灵敏度:0.016AUFS 进样量:104L (3)样品测定:准确称取样品处理液和标准液各10μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分 离,以其标准溶液峰的保留时间进行定性,利用峰面积求出样液中待测物质的含量。 5.结果计算 S. xm 式中X一样品中染料木素大豆苷元的含量(ug/g); S1-一样品峰面积 c——标准溶液浓度(μg/mL); S2-一标准溶液峰面积 —一样品定容体积(mL) m试样质量(g)。 样品中大豆异黄酮含量X(gg)=X+XXg、X分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量) 6.注释 (1)本法染料木素浓度在001~0.1mg/mL范围内呈直线关系,相关系数为0.9968大豆苷元浓度在 0.003~0.03mg/mL范围内呈直线关系,相关系数09945 (2)精密度:同一样品依本法重复6次,染料木素、大豆苷元的相对标准差(RSD)分别为3.1%及 (3)回收率:依本法各取试样9份,每3份为一组,分别加入不同量标准品进行试样处理,染料木 素添加回收率为950%~1037%、大豆苷元添加回收率为958%~1055%
8 “甲醇+水（60+40）”定容至 100mL，配制成 50μg/mL 的染料木素和 32μg/mL 的大豆苷元标准溶液。 4. 测定步骤 （1）样品处理： a. 固体样品：准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中，定量加入80%乙醇，经超声振荡5min， 加水补足至刻度，待提取液略澄清后经离心分离（3000r/min，5min），取上清液经 0.45μm 滤膜过滤后待 进样。 b. 液体样品：准确吸取 2.0mL 液体样品，加入 80%乙醇摇匀并定容 100mL，澄清后同上述步骤。 （2）色谱分离条件： 色 谱 柱：Shim—Pack CLC—ODS，6mm×l50mm，5μm。 流 动 相：甲醇+水（60+40），临用前用超声波除气。 流 速：0～5min，为 1.0mL/min；5～10min 为 1.6mL/min。 柱 温：40℃。 检测波长：UV260nm。 灵 敏 度：0.016AUFS。 进 样 量：l0μL。 （3）样品测定：准确称取样品处理液和标准液各 l0μL（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分 离，以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样液中待测物质的含量。 5. 结果计算 S m S c V X = 2 1 式中 X——样品中染料木素/大豆苷元的含量（μg/g）； S1——样品峰面积； c ——标准溶液浓度（μg/mL）； S2——标准溶液峰面积； V——样品定容体积（mL）； m——试样质量（g）。 样品中大豆异黄酮含量 X（μg/g）=Xg+Xd(Xg、Xd 分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量) 6. 注释 （1）本法染料木素浓度在 0.01～0.1mg/mL 范围内呈直线关系，相关系数为 0.9996；大豆苷元浓度在 0.003～0.03mg/mL 范围内呈直线关系，相关系数 0.9945。 （2）精密度：同一样品依本法重复 6 次，染料木素、大豆苷元的相对标准差（RSD）分别为 3.1%及 1.2%。 （3）回收率：依本法各取试样 9 份，每 3 份为一组，分别加入不同量标准品进行试样处理，染料木 素添加回收率为 95.0%～103.7%、大豆苷元添加回收率为 95.8%～105.5%
第三节总皂苷的测定方法(分光光度法) 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。 本方法人参皂苷Re的最低检出量为2pgmL 方法提要 样品中总皂苷经提取、PT一大孔吸附树脂柱预分离后,在酸性条件下,香草醛与人参皂苷生成有色 化合物,以人参皂苷Re为对照品,于560nm处比色测定 二、仪器 1.722分光光度计 2PT一大孔吸附树脂柱(河北省津杨滤材厂) 3.超声波振荡器。 试剂 1.甲醇(分析纯) 2.乙醇(分析纯) 3.人参皂苷Re标准品(中国药品生物制品检定所)。 4-5%香草醛溶液:称取5g香草醛,加冰乙酸溶解并定容至0omL 5高氯酸(分析纯) 6冰乙酸(分析纯)。 7.人参皂苷Re标准溶液:精确称取人参皂苷Re标准品20.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL,即每lmL 含人参皂苷Re20mg 8重蒸水 四、测定步骤 1样品处理 (1)固体样品 称取10g左右样品于100mL烧杯中,加入20~4mL85%乙醇,超声波振荡30min,再定容至s0mL, 摇匀,放置,吸取上清液l.0mL挥干后以水溶解残渣,进行柱分离 (2)液体样品 含乙醇的酒类样品:准确吸取1.mL样品放于蒸发皿中,蒸干,用水溶解残渣,用此液进行柱层析 非乙醇类液体样品:准确吸取l.σmL样品(如浓度高或颜色深,需稀释一定体积后再取l.OmL)直接进行 柱分离。 2.柱层析 以PI一大孔吸附树脂柱进行层析分离,准确吸取上述已处理好的样品溶液10mL上柱,用15mL水 洗柱,以洗去糖分等水溶性杂质,弃去洗脱液,再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷,收集洗脱液于蒸发皿中, 于水浴上蒸干,以此作显色用 3显色
9 第三节 总皂苷的测定方法（分光光度法） 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。 本方法人参皂苷 Re 的最低检出量为 2μg/mL。 一、方法提要 样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色 化合物，以人参皂苷 Re 为对照品，于 560nm 处比色测定。 二、仪器 1.722 分光光度计。 2.PT—大孔吸附树脂柱（河北省津杨滤材厂）。 3.超声波振荡器。 三、试剂 1.甲醇（分析纯）。 2.乙醇（分析纯）。 3.人参皂苷 Re 标准品（中国药品生物制品检定所）。 4.5％香草醛溶液：称取 5g 香草醛，加冰乙酸溶解并定容至 l00mL。 5.高氯酸（分析纯）。 6.冰乙酸（分析纯）。 7.人参皂苷 Re 标准溶液：精确称取人参皂苷 Re 标准品 20.0mg，用甲醇溶解并定容至 10mL，即每 1mL 含人参皂苷 Re2.0mg。 8.重蒸水。 四、测定步骤 1.样品处理： （1）固体样品 称取 1.0g 左右样品于 100mL 烧杯中，加入 20～40mL 85%乙醇，超声波振荡 30min，再定容至 50mL， 摇匀，放置，吸取上清液 1.0mL 挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。 （2）液体样品 含乙醇的酒类样品：准确吸取 1.0mL 样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析； 非乙醇类液体样品：准确吸取 1.0mL 样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取 1.0mL）直接进行 柱分离。 2.柱层析 以 PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液 1.0mL 上柱，用 15mL 水 洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用 20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中， 于水浴上蒸干，以此作显色用。 3 显色
在上述已挥干的蒸发皿中准确加入02mL5%香草醛冰乙酸溶液,转动蒸发皿,使残渣溶解,再加O.8mL 高氯酸,混匀后移入0mL比色管中,塞紧盖子于60℃以下水浴上加温15mn取出,冷却后准确加入冰乙 酸50mL,摇匀后以1.0cm比色皿、于560nm处与人参皂苷Re标准管同时比色 4标准曲线的绘制 吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/mL)0、20、40、60、80、1004L(相当于人参皂苷Re0、40、80 120、160、200μg),于10mL比色管中,用氮气吹干,同4.(3)显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线 人参总皂苷浓度为20~200g/mL之间与吸光度值呈线性关系,相关系数(r)0.999 五、结果计算 X= x V1×1000 mxl×1000×1000 式中X一样品中总皂苷(以人参皂苷Re计)(gkg或g/L); m一试样质量或试液体积(g或mL) V1-一样品提取液总体积(mL) 2一样品提取液测定用体积(mL) m——从标准曲线查得待测液中人参皂苷Re量(pg) 六、注释 1.人参系五加科植物是人参 Panax ginseng C A Meyer的根,含有多种人参皂苷( ginsenoside),多数为达 玛烷型皂苷,如人参皂苷Ra、Ra、Rb、Rb2、Rb3、Re、Rd等:;少数为齐墩果酸型(C型)皂苷,如人 参皂苷Re。由于苷元不同,达玛烷型皂苷又分为:20S一原人参二醇类皂苷(A型)和20S—原人参三醇 类皂苷(B型)。其中,A型和B型皂苷酸水解后,分别得到人参二醇( Panaxadiol)和人参三醇( panaxatriol) 除人参外,五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。 当保健食品原料配方中含有上述多种原料时,即以本法“总皂苷(以人参皂苷Re计)”报告检测结果。 2.对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品,按《中华人民共和国药典》2000 年版一部第99页,以薄层色谱法进行鉴定试验,将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确 定其主要原料后,人参、西洋参制品仍以人参皂苷Re为对照品进行检测,而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷 (中国药品生物制品检定所)为对照品进行检测,分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”、“绞股蓝总皂 苷”报告检测结果 3回收率:90%~105% 第四节褪黑素的测定方法(高效液相色谱法 本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定,非添加褪黑素的天然食品可参照此法。 本方法褪黑素的最低检出量为25ng。 、方法提要 样品中的褪黑素用甲醇提取后,经高效液相色谱分离,在紫外检测器上检测,波长260mm,用外标 法定量,根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量
10 在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL 5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加0.8mL 高氯酸，混匀后移入 l0mL 比色管中，塞紧盖子于 60℃以下水浴上加温 15min 取出，冷却后准确加入冰乙 酸 5.0mL，摇匀后以 1.0cm 比色皿、于 560nm 处与人参皂苷 Re 标准管同时比色。 4 标准曲线的绘制： 吸取人参皂苷 Re 标准溶液（2.0mg/mL）0、20、40、60、80、100μL（相当于人参皂苷 Re0、40、80、 120、160、200μg），于 10mL 比色管中，用氮气吹干，同 4.（3）显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线。 人参总皂苷浓度为 20～200μg/mL 之间与吸光度值呈线性关系，相关系数（r）0.999。 五、结果计算 1000 1000 1000 2 1 1 = m V m V X 式中 X——样品中总皂苷（以人参皂苷 Re 计）（g/kg 或 g/L）； m——试样质量或试液体积（g 或 mL）； V1——样品提取液总体积（mL）； V2——样品提取液测定用体积（mL）； m1——从标准曲线查得待测液中人参皂苷 Re 量（μg）。 六、注释 1.人参系五加科植物是人参 Panax ginseng C A Meyer 的根，含有多种人参皂苷(ginsenoside)，多数为达 玛烷型皂苷，如人参皂苷 Ral、Ra2、Rbl、Rb2、Rb3、Re、Rd 等；少数为齐墩果酸型（C 型）皂苷，如人 参皂苷 Re。由于苷元不同，达玛烷型皂苷又分为：20S—原人参二醇类皂苷（A 型）和 20S—原人参三醇 类皂苷（B 型）。其中，A 型和 B 型皂苷酸水解后，分别得到人参二醇（Panaxadial）和人参三醇（panaxatriol）。 除人参外，五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。 当保健食品原料配方中含有上述多种原料时，即以本法“总皂苷（以人参皂苷 Re 计）”报告检测结果。 2.对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品，按《中华人民共和国药典》2000 年版一部第 99 页，以薄层色谱法进行鉴定试验，将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确 定其主要原料后，人参、西洋参制品仍以人参皂苷 Re 为对照品进行检测，而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷 （中国药品生物制品检定所）为对照品进行检测，分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”、“绞股蓝总皂 苷”报告检测结果。 3.回收率：90%～105%。 第四节 褪黑素的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定，非添加褪黑素的天然食品可参照此法。 本方法褪黑素的最低检出量为 25ng。 一、方法提要 样品中的褪黑素用甲醇提取后，经高效液相色谱分离，在紫外检测器上检测，波长 260mm，用外标 法定量，根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量