湖南中医药大学研究生选修课 Principles of Genetic Engineering 基因工程原理 湖南中医药大学鲁耀邦
湖南中医药大学研究生选修课 Principles of Genetic Engineering 基 因 工 程 原 理 湖南中医药大学 鲁耀邦
基因工程原理纲要 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 口目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定
基因工程原理纲要 基因工程概论 基因工程的主要技术 基因工程的酶学基础 基因克隆的载体与受体 目的基因的克隆与分离 克隆基因的检测与功能鉴定
第五讲目的基因的克隆与分离 目的基因: 准备要分离、改造、扩增或表达的基因
第五讲 目的基因的克隆与分离 目的基因： 准备要分离、改造、扩增或表达的基因
第一节基因组DNA片断化 、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的 片断。 酶切
第一节 基因组DNA片断化 一、限制性内切酶法 用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的 片断。 酶切
1.优点 由于带有粘性末端,产物可以直接与载体连 接。 2缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的 基因也被切成碎片! BamH I BamH I BamH gene
由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连 接。 1. 优点 2. 缺点 目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的 基因也被切成碎片！ BamH I BamH I BamH I gene
、随机片断化 1.限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间,使基因组中 的酶切位点只有一部分被随机切开。 (1)限制性内切酶的选用原则 ①内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度
二、随机片断化 1. 限制性内切酶局部消化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中 的酶切位点只有一部分被随机切开。 ① 内切酶识别位点的碱基数 影响所切出的产物的长度和随机程度。 （1）限制性内切酶的选用原则
1)4bp的内切酶 平均每44(256)bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、Au、Sau3A。 2)6bp的内切酶 平均每46(4096)bp一个切点 ②内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 (Sau3A--BamH D
1）4bp的内切酶 平均每4 6（4096）bp一个切点。 2）6bp的内切酶 平均每4 4（256）bp一个切点。 随机程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。 ② 内切酶粘性末端 能与常用克隆位点相连。 （Sau3A—BamH I）
2.机械切割法 (1)超声波 超声波强烈作用于DNA,可使其断裂成 约300bp的随机片断。 (2)高速搅拌 1500转/分下搅拌30min,可产生约8kb 的随机片断
2. 机械切割法 （1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成 约300bp的随机片断。 （2）高速搅拌 1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb 的随机片断
第二节化学合成目的基因 1976年HG. Khorana提出了用化学方法合成基 因的设想,并于1979年在 scIence上发表了率先 成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 「、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基 因的设想，并于1979年在science上发表了率先 成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。 第二节 化学合成目的基因 一、目前常用的方法 磷酸二酯法、 磷酸三酯法、 亚磷酸三酯法、 固相合成法 自动化合成法
1.磷酸二酯法 (1)原理 ①保护dNTP的5‘端P或3端OH 保证合成反应的定向进行。 ②带保护的单核苷酸连接 带5'保护的单核苷酸与带3‘保护的另一个单 核苷酸以磷酸二酯键连接起来。 ③用酸或碱的脱保护
① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH ③ 用酸或碱的脱保护 （1）原理 1. 磷酸二酯法 ② 带保护的单核苷酸连接 保证合成反应的定向进行。 带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单 核苷酸以磷酸二酯键连接起来